Name: マルチターゲット発色ホールマウントその場でハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較しますショウジョウバエ胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 学ぶマルチターゲット発色ホールマウントインサイツハイブリダイゼーション（MC-WISH）法を用いて、ショウジョウバエ胚における複数遺伝子のmRNA発現パターンを同時に可視化し比較する手法です。

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テンプレート生成のためのcDNAプラスミドについて、同僚に感謝します。著者らの研究は、Swedish Cancer Foundation(CAN 2010/553)、Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education(IG2011-2042)、Knut and Alice Wallenberg Foundation(KAW2012.0058)の支援を受けています。

<ol><li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHauptmann%2C+G+%22In+Situ+Hybridization+Methods%22">In Situ Hybridization Methods</a>. , 1, Humana Press, Springer. NY. (2015).</li>
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<li>Speel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robert+Feulgen+Prize+Lecture+1999.+Detection+and+amplification+systems+for+sensitive%2C+multiple-target+DNA+and+RNA+in+situ+hybridization%3A+looking+inside+cells+with+a+spectrum+of+colors%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Robert Feulgen Prize Lecture 1999. Detection and amplification systems for sensitive, multiple-target DNA and RNA in situ hybridization: looking inside cells with a spectrum of colors.</a> Histochem Cell Biol. 112 (2), 89-113 (1999).</li>
<li>Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+in+situ+hybridization+method+for+the+detection+of+cellular+RNAs+in+Drosophila+tissue+sections+and+its+application+for+localizing+transcripts+of+the+homeotic+Antennapedia+gene+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex.</a> EMBO J. 2 (4), 617-623 (1983).</li>
<li>Tautz, D., Pfeifle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+in+situ+hybridization+method+for+the+localization+of+specific+RNAs+in+Drosophila+embryos+reveals+translational+control+of+the+segmentation+gene+hunchback%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback.</a> Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).</li>
<li>Hartmann, C., Jäckle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+relationships+between+a+novel+Drosophila+stripe+expressing+gene+and+known+segmentation+genes+by+simultaneous+visualization+of+transcript+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal relationships between a novel Drosophila stripe expressing gene and known segmentation genes by simultaneous visualization of transcript patterns.</a> Chromosoma. 104 (2), 84-91 (1995).</li>
<li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+detection+of+mRNA+transcript+localizations+in+fish+and+fly+embryos+using+alkaline+phosphatase+and+beta-galactosidase+conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Two-color detection of mRNA transcript localizations in fish and fly embryos using alkaline phosphatase and beta-galactosidase conjugated antibodies.</a> Dev Genes Evol. 209 (5), 317-321 (1999).</li>
<li>Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-%2C+two-%2C+and+three-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">One-, two-, and three-color whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Methods. 23 (4), 359-372 (2001).</li>
<li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+whole-mount+in+situ+hybridization+to+vertebrate+and+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Two-color whole-mount in situ hybridization to vertebrate and Drosophila embryos.</a> Trends Genet. 10 (8), 266(1994).</li>
<li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolour+whole-mount+in+situ+hybridization+to+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Multicolour whole-mount in situ hybridization to Drosophila embryos.</a> Development Genes and Evolution. 206 (4), 292-295 (1996).</li>
<li>O'Neill, J. W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-label+in+situ+hybridization+using+biotin+and+digoxigenin-tagged+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Double-label in situ hybridization using biotin and digoxigenin-tagged RNA probes.</a> Biotechniques. 17 (5), 870-875 (1994).</li>
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<li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor whole-mount in situ hybridization.</a> Methods Mol Biol. 137, 139-148 (2000).</li>
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<li>Grossniklaus, U., Pearson, R. K., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+sloppy+paired+locus+encodes+two+proteins+involved+in+segmentation+that+show+homology+to+mammalian+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila sloppy paired locus encodes two proteins involved in segmentation that show homology to mammalian transcription factors.</a> Genes Dev. 6 (6), 1030-1051 (1992).</li>
<li>Hauptmann, G., Gerster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+gene+expression+patterns+reveal+transverse+and+longitudinal+subdivisions+of+the+embryonic+zebrafish+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulatory gene expression patterns reveal transverse and longitudinal subdivisions of the embryonic zebrafish forebrain.</a> Mech Dev. 91 (1-2), 108-118 (2000).</li>
<li>Long, S., Rebagliati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+two-color+whole-mount+in+situ+hybridizations+using+digoxygenin-+and+dinitrophenol-labeled+RNA+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Sensitive two-color whole-mount in situ hybridizations using digoxygenin- and dinitrophenol-labeled RNA probes.</a> Biotechniques. 32 (3), 494-500 (2002).</li>
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<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+whole-mount+fluorescent+in+situ+hybridization+in+zebrafish+using+enhanced+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sensitive whole-mount fluorescent in situ hybridization in zebrafish using enhanced tyramide signal amplification.</a> Methods Mol Biol. 1082, 175-185 (2014).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

放射性標識された核酸プローブとのインサイチュハイブリダイゼーション（ISH）は、しばしば、組織切片上でRNAの局在を検出するために使用されます。放射性ISH法は、しかし、それほど敏感で時間がかかり、全体マウントで完全な転写物の分布パターンの感謝を許可していません。対照的に、本明細書に記載のMC-WISH法は、無傷の胚内での色の対比において、複数の遺伝子発現ドメインの直接比較を可能にします。 MC-WISHは、組織学的コンテキストが直ちに明らかと標準明視野顕微鏡によって簡単に可視化するという利点を有します。これは、可能性が高い精度で互いに地形的遺伝子発現ドメインに関連し、高速で信頼性の高い方法で、ユニークで重複発現部位を定義するために提供します。一方、多重化された蛍光ISH（FISH）は、感度、解像度に関して、より強力であり、細胞の、あるいはサブセルラー再あれば好ましく、使用されていますmRNA検出の溶液が必要です。 MC-WISHによってマップされた転写物の広いスペクトルは、実質的に任意の転写物が胚でなく、幼虫および成体組織およびショウジョウバエ以外の種だけでなく分析することができることを示唆しています。実際、 ショウジョウバエのためにここで詳述説明する手順は、ゼブラフィッシュ胚11,16,22と同様に効率的に動作します。また、MC-WISH法は無脊椎動物および脊椎動物胚および組織標本の多種多様に適用できます。 ハプテン - ラベルとプローブ濃度私たちは日常的にRNAプローブのハプテン標識としてフルオレセイン、ジゴキシゲニン、及びビオチンを使用しています。また、ジニトロフェノールで標識されたプローブは、ゼブラフィッシュWISH実験23-25 ​​に導入された、適用されてもよいです。フルオレセインは、最高の中古Fとなるように、フルオレセイン標識プローブは、他のハプテンのラベルと比較してより低い感度を表示または豊富な転写産物の検出。各新たに転写されたプローブは、最初にその性能を基質としてBCIP / NBTまたはファストレッドを使用していずれかで評価された単一のWISH実験で試験されています。プローブ濃度は、バックグラウンドの発生なしに強いシグナルを数時間に分以内に達成されたときに最適と考えられています。 興味の発現ドメインはMC-WISHによってその全範囲で検出されていることを確認するために、それは最も敏感な基質の組み合わせ、BCIP / NBTを使用して、単一ラベルWISH実験により各転写パターンを可視化することが不可欠です。これは、弱い発現ドメインは、マルチターゲット実験では見落とされていないことを保証します。他の基質の組み合わせの低い感度を補償することは、標準的なBCIP / NBT染色と比較して、プローブ濃度（三倍に）倍を使用することが不可欠です。 低pH不活性化低pH不活性化工程は、につながることができます第二および第三の染色ラウンドで減少し、信号検出結果としてアンチセンスハプテン標識RNAプローブ/センスのmRNAハイブリッドの部分的な崩壊。感度の損失を最小限に抑えるために、不活性化ステップは、可能な限り短いです。我々は、低pHでの10分間のインキュベーション時間は、AP活性を排除するのに十分であることを経験しました。大量の後続の迅速な洗浄は、未結合の抗体-APコンジュゲートの急速な希釈を確保し、ハプテン化プローブに再結合するのを防ぎます。代替手順は、パラホルムアルデヒド固定し、熱不活性化が含まれます。しかし、色の沈殿物の一部は、安定したパラホルムアルデヒド固定がAPの完全な不活性化のために十分ではないかもしれない加熱されません。第1の印加抗体-APコンジュゲートの不完全な不活性化は、検出される第2のmRNA種との表現で偽陽性の重複につながるラウンド以下の検出におけるmRNAパターンの再可視化につながることができます。したがって、対照実験番目でE胚が最初に適用抗体-APコンジュゲートの不活性化した後、2つの画分に分割されます。二次抗体-APコンジュゲートは、制御画分から省略され、第二の色反応の信号を生成してはなりません。第二の色反応を最初に対応する信号分布パターンを生成する場合は、その後不活性化手順は効率的ではなかったです。この場合には、低pHの停止溶液中でのインキュベーション時間は、次の実験のために延長されるべきです。 AP基質アプリケーションの注文感度は検出の後続の各​​ラウンドで降下するので、前より豊富転写物にあまり豊富でmRNAを検出することをお勧めします。ファスト染料が好ましく、より強い表現転写物の検出のための第一の染色ラウンドで適用されるように、また、ファストレッドとファーストブルー基板の組み合わせは、かなりpurpleblue BCIP / NBT染色よりも感度が低いです。これも時間その後のBCIP / NBT染色を監視しpurpleblue信号が軽く高速染料に関連して、あまりにも暗くなるまでの時間で停止させることができる利点など。したがって、標準的な2色の実験では、最初に強く発現されたmRNAは、ファストレッドによって検出され、第二BCIP / NBTずつ弱いです。しかし、しばらくして拡散するようになる沈殿物を生成した黄色INT基質の組み合わせを適用することができるファースト染料の代替として。したがって、BCIP / INTはもっぱら最後の染色ラウンドで適用されます。その結果、三色の実験では、我々は、多くの場合、最初のファストレッド、二BCIP / NBT（またはファーストブルー）と第3のINT基板を組み合わせて使用​​します。それはINTを適用するとき、できるだけ早くステンド胚を撮影することをお勧めであることに注意してください。 アゾ染料の蛍光検出これは、暗い色の沈殿物が軽いものをシャドウイングされたときに発現パターンの重複を認識することが困難な場合があることができます。 Fまたは、例えば、強く開発BCIP / NBT沈殿物を軽量化、高速色素信号をマスクすることができます。この問題を回避する1つの方法は、各染色後すぐに画像をキャプチャし、次の検出のラウンドの前に適用された色の沈殿物を除去することです。この場合、アルコール可溶性アゾ染料（ファストレッド）及びINT沈殿物は、それぞれ、第一及び第二の検出ラウンド後にエタノール洗浄により除去され、BCIP / NBT染色は最後AP-基板26として適用されます。別の可能性は、アゾ染料の蛍光特性を利用することです。ファストレッド、ローダミンフィルターを用いて可視化することができるファストブルー遠赤色フィルタ28,29を用いて観察することができるが、27を設定します 。それはあまりにも稠密になり、アゾ色素の蛍光シグナルを消光しないように、比較または発色および蛍光画像のオーバーレイは、時間で停止しなければならない共distribution.Usingこのアプローチを、BCIP / NBT信号発達の部位を明らかにすることができます反応生成物。

in situハイブリダイゼーション（ISH）は、細胞、組織および生物体1内の形態学的な文脈におけるRNA転写物の検出及び局在化のための標準的な方法です。 ISH法によって生成された信号は、一般的に、放射性、蛍光および発色検出システムによって可視化されます。近年、蛍光ISH（FISH）2の重要な技術的進歩は、単一分子3,4 .Whileまでの検出および定量RNA発現の単一細胞およびサブ細胞レベルでの及びRNAの可視化を可能にする、劇的に改善された感度と分解能が得られました洗練された単一分子FISH法は、より専門的な用途に使用され、発色ISHは、研究および臨床診断においてインサイチュ検出方法においてルーチンRNAとして普及しています。発色検出用の酵素の沈殿反応が部位に対照的な色に見える製品を生成した、使用されていますハイブリダイゼーション5。これは、RNAの可視化ルーチン組織学的染色および形態学的状況に組み合わせることができる利点は、標準的な明視野顕微鏡により直ちに明らかです。また、適用される色基質の多数は、永久的な試料調製が5を得ることができるように、有機および/ ​​または水性マウント媒体中で安定な析出物を生じます。 ショウジョウバエでは、初期ISHプロトコルを切片材 6上の転写産物を検出するための放射性同位体で標識したプローブを適用しました。それは、組織切片からの全胚または臓器系の完全な転写パターンを再構築することは困難であるが、非放射性標識プローブを用いた発色ISH法の適用は、全マウント7にRNAの分布を検出するグローバルすることができます。発色性ISHの多くのバリエーションが存在するが、典型的にin situハイブリダイゼーション （WISH）プロトコルHYB でホールマウントridizedハプテン標識プローブは、レポーター酵素に結合した抗ハプテン抗体によって検出されたmRNA転写物は、沈殿色原体によって可視化されます。 レポーターによって生成異なる色の沈殿物のパレットは、アルカリホスファターゼ（AP）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（POD）、およびβ-ガラクトシダーゼ（GAL）1における複数のターゲットの特徴的な検出と同じサンプル8-14を可能にする酵素。しかしながら、POD酵素活性は、限られた時間の間持続し、追加（チラミド）シグナル増幅なしで15以下豊富な転写物の検出は、これらの酵素に挑戦することができるようにGAL比色反応は、幾分敏感です。対照的に、APの永続的な活性が長く持続する基質代謝回転と高い信号対雑音比を可能にします。そのため、異なる色の基質とAPレポーター酵素を用いて順次検出が効果的に成功を収めており、単一胚における最大3つの異なる転写産物の特徴的な検出10-12,16。 このマルチターゲット発色WISH（MC-WISH）方式（ 図1）14のために、標識アンチセンスRNAプローブを、 インビトロ転写によって生成され、利用可能なハプテンラベルの1つでマーク。胚は、ホルムアルデヒド固定し、メタノール処理およびプロテイナーゼK消化することによって透過されます。胚のハイブリダイゼーションは同時に異なる遺伝子にそれぞれ特異的な3つまでの異なる標識アンチセンスRNAプローブを用いて行われます。ストリンジェンシー洗浄により未結合のプローブを除去した後、各ハプテン標識は、検出の別々のラウンドで可視化されます。単一の検出ラウンドは、ローカライズされた安定した色の沈殿物を生成し、AP-基板を適用することにより、APとRNAの可視化に結合した抗ハプテン抗体と胚のインキュベーションで構成されています。抗体検出および染色した後、適用される抗体-AP conjuゲートは、低pH洗浄によって除去されます。多色実験では、検出の各ラウンドは、異なるハプテン標識を標的とする抗体を使用し、各転写パターンが異なる色の基板（ 表1）によって可視化されます。胚はグリセロールで取り付けられ、微分干渉コントラスト（DIC）光学系を用いた高解像度複合顕微鏡で撮像されます。

<table><tbody><tr><td>脱イオン、ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0603</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA Polymerase&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0111</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0101</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0131</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase阻害剤&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>DNase I, RNaseフリー&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>NTPセット</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>ジゴキシゲニン-11-UTP</td><td>ロシュ</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン-12-UTP</td><td>ロシュ</td><td>11427857910</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-16-UTP</td><td>ロシュ</td><td>11388908910</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Applichem</td><td>A2936</td><td></td></tr><tr><td>エタノール,絶対&nbsp;</td><td>メルク</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>シャーラウ</td><td>SO0339</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム</td><td>シャーラウ</td><td>SO0331</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Σ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td></td><td>Σ 32213</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>サーモScientific</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>塩酸&nbsp;</td><td>メルク</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸三ナトリウム</td><td>シャルラウ</td><td>SO0200</td><td></td></tr><tr><td>脱イオンホルムアミド</td><td>Applichem</td><td>A2156</td><td></td></tr><tr><td>トルラ酵母</td><td>シグマ</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>Applichem</td><td>A3004</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸ナトリウム塩</td><td>ΣD6001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>羊血清</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>ヒツジ抗ビオチンAP Fabフラグメント&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>ヒツジ抗ジゴキシゲニン-アルカリホスファターゼ(AP)ファブフラグメント</td><td>ロシュ</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>ヒツジ抗フルオレセイン-APファブフラグメント</td><td>ロシュ</td><td>11426303001</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗ジニトロフェニル-AP抗体</td><td>ベクターラボラト</td><td>リーMB-3100</td><td></td></tr>トリ<tr><td>ス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン</td><td>シャーラウ</td><td>TR04241000</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>シャーラウ</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シャーラウ</td><td>SO0227</td><td></td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>シグマ</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>シグマ</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>アプリケム</td><td>A3006</td><td></td></tr><tr><td>ファストレッド錠セット</td><td>シグマ</td><td>F4648</td><td></td></tr><tr><td>ファストブルーBBソル</td><td>トシグマ</td><td>F3378</td><td></td></tr>ナ<tr><td>フトール-AS-MX-リン酸</td><td>シグマ</td><td>N5000</td><td></td></tr>ナ<tr><td>フトール-AS-GR-リン酸</td><td>シグマ</td><td>N3625</td><td></td></tr>ナ<tr><td>フトール-AS-BI-リン酸</td><td>シグマ</td><td>N2250</td><td></td></tr>マ<tr><td>ゼンタ-フォス</td><td>バイオシンセ</td><td>スB7550</td><td></td></tr><tr><td>INT</td><td>シグマ</td><td>I8377</td><td></td></tr><tr><td>NBT</td><td>Applichem</td><td>A1243</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Applichem</td><td>A1117</td><td></td></tr><tr><td>INT/BCIP溶液</td><td>ロシュ</td><td>11681460001</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール 86-88%</td> <td>Scharlau</td><td>GL0023</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルインキュベーター</td><td>Memmert</td><td>BE400</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>グラント</td><td>QBT2</td><td></td></tr><tr><td>Netwell&nbsp; インサート 15 mm</td><td>Corning</td><td>3477</td><td></td></tr><tr><td>Netwell キャリアキット 15 mm</td><td>Corning</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェル細胞培養プレート</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml マイクロチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.691</td><td></td></tr></tbody></table>

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

胚発生および器官形成の間に活性な遺伝子調節ネットワークを解析するためには、正確に異なる遺伝子をその場で互いに空間的関係で表現する方法を定義することが不可欠です。マルチターゲット発色ホールマウントin situハイブリダイゼーション （MC-WISH）は、同じサンプル試料の色の対比で異なるmRNA種の独特の視覚化を可能にするように大きく、遺伝子発現パターンの瞬間比較を容易に 。これにより、高精度な地形的相互に遺伝子発現ドメインを関連付けるために、固有の重複発現部位を定義する可能性を提供します。提示されたプロトコルでは、我々は、 ショウジョウバエ胚における種々の遺伝子のmRNA発現パターンを比較するためにMC-WISH手順を説明します。 3 RNAプローブを、それぞれ別の遺伝子に特異的な、異なるハプテンによって標識まで、同時に胚サンプルにハイブリダイズされ、その後、アルカリによって検出NEフォスファターゼ基づく比色免疫組織化学。説明する手順は、 ショウジョウバエのためにここで詳述するが、ゼブラフィッシュ胚と同様に動作します。

記載されているプロトコルは、異なる色で複数の転写パターンの同時可視化を可能にします。 MC-WISHは直接、同じ胚における異なる遺伝子の発現パターンを比較する利点を提供します。一例として、 空気門の発現パターン（EMS）19、 フシtarazu（FTZ）20とずさんなペアの 1（SLP1）21を直接 キイロショウジョウバエの胚盤葉期胚に比べ、色の色合いの様々な可視化されている（ 図4） 。 異なるAP基質の組み合わせは、対照的な色の沈殿物（ 表1）のパネルを得るために利用可能です。ファストレッドおよびBCIP / NBTによって生成紫色の沈殿によって生成される赤色の沈殿を容易に区別することができるので、最も一般的に使用され二色実験におけるLY（ 図4A）。ファストレッド色が転写物の部分的な同時分布の場合には偽装されるように、しかし、BCIP / NBT染色はすぐにではなく、暗い色になることができます。したがって、ファストブルーの適用はそれぞれ、NAMP、NAGPとNABPと組み合わせて、青色、緑色、紫色の製品を生成する、有利で​​ある （表1）であることができます。 NAMPでのファーストブルーの組み合わせは 、EMSとそれぞれ赤と青で可視化SLP1発現部位（ 図4B）のために、ここで示すように、隣接または重複表現ドメインにおけるファストレッド製品から容易に識別可能であるライトブルーの色を提供します。緑のEMSドメインが明らかに赤SLP1の発現部位（ 図4C）から独特であるように、ファーストブルーNAGPの組み合わせは、ファストレッド染色に似た強いコントラストを提供します。しかし、EMSとSLP1発現部位が解除された場合ファーストブルーNABPとファストレッドによりtected、それぞれ、結果として紫と赤の色の析出物が（ 図4D）以下に識別可能です。前述したようにSLP1と赤と緑でFTZ式で示されるように、ファストレッドとファーストブルーNAGPはそれぞれ、（ 図4D）を区別するのは簡単です。 INTとの組み合わせでMagentaPhosはFTZ（ 図 4C、E）の分節式を明らかにするために使用された黄色の沈殿物を生成します。それぞれファーストブルーNAMPとMAG / INT、（ 図 4E）とSLP1とFTZの検出によって例示されるような黄色の沈殿物が青色の基材への良好なコントラストを生成します。しかし、黄色の沈殿物がファストレッド製品からあまり容易に識別可能です。 EMSの黄色に染色された発現領域はほとんどdistiすることができます<html>赤（ 図 4F）に示すSLP1の吻側式からnguished。したがって、色基質の組み合わせは、各実験のために慎重に選択しなければなりません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig1.jpg" /> MC-WISHの図1のフローチャート。3つのユニークな転写パターンの色とりどりの可視化のために、異なる抗体-APコンジュゲートと各検出サイクルの色基質の組み合わせのどちらかを選択します。略語：AP​​、アルカリホスファターゼ; BIO、ビオチン; DIG、ジゴキシゲニン。 FLUO、フルオレセイン。他の略語は伝説4と表図 1を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> S / ftp_upload / 53830 / 53830fig2.jpg &quot;/&gt; 胚担体として図2のインサート。（A）15 mmの直径および74ミクロンのメッシュサイズのポリエステル膜と底部に取り付けられたインサートは、 ショウジョウバエ胚担体として使用されます。 （B）インサートを種々の溶液のための貯蔵トレーとして機能する12ウェルプレート内に組み立てられます。 （C）利用可能なキャリアとハンドルを同時に（D）12インサート/胚サンプルの処理が可能になります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig3.jpg" /> 染色された胚の図3のマウント。胚は、スペーサとして機能するカバーガラス、の2つのスタック間で70％グリセロールの低下に取り付けられます。アプリのジェントル移動嘘をついた大型カバーガラスは、観察や写真撮影のために所望の向きに取り付けられた胚を回転させるのに役立ちます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53830/53830fig4.jpg" /> 図4。 ショウジョウバエの 胚における mRNA転写物の多色の可視化 。 ショウジョウバエの胚におけるMC-WISH実験の例は、横方向のビューから表示されます。 空気門 （EMS）のmRNAの発現パターン、 フシtarazu（FTZ）とずさんなペア1（SLP1） は各パネルに表示されている別のAPの色の基質の組み合わせによって可視化されます。転写物は、（A）FTZ FLUO および EMS DIG、（によって検出しました<stroNG&gt; B）はFLUO、EMS BIO、およびFTZ DIG、（C）EMS BIO、FLUOはSLP1、およびFTZ DIG、（D）FTZ BIO、FLUOはSLP1、 および EMS DIG、（E）SLP1 FLUO、EMS DIGをSLP1と、バイオFTZ FTZ BIO、（F）は 、FLUOをSLP1、 および EMS DIGが標識プローブ。ハプテン標識プローブは、免疫組織化学的に記載された順序で次々と検出されました。略語：FBファーストブルー。 FR、ファストレッド錠。他の略語は、伝説が1と表図 1を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53830/53830fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 基板の組み合わせ </td><td> 1ミリリットルAPのバッファに追加 </td><td> Concentraン[/ mlの] </td><td> APバッファ </td><td> 色 </td><td> 信号感度 </td></tr><tr><td> BCIP NBT </td><td> 3.5μlの4.5μL </td><td> 175 337.5 </td><td> SB9.5 </td><td>パープル</td><td> +++ </td></tr><tr><td> MAGのINT </td><td> 5μlの5μL </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td>黄</td><td> + </td></tr><tr><td> BCIP / INT原液</td><td> 7.5μL </td><td> 250 250 </td><td> SB9.5 </td><td>黄</td><td> + </td></tr><tr><td>ファーストブルーNAMP </td><td> 5μlの5μL </td><td> 250 250 </td><td> SB8.2 </td><td>ブルー</td><td> ++ </td></tr><tr><td>ファーストブルーNABP </td><td> 20μlの10μlの</td><td>千500 </td><td> SB8.2 </td><td>バイオレット</td><td> ++ </td></tr><tr><td>ファーストブルーNAGP </td><td> 10μlの10μlの</td><td> 500 500 </td><td> TT8.2 </td><td>緑色</td><td> + </td></tr><tr><td>ファストレッドNAMP </td><td> 1錠</td><td>千400 </td><td> TT8.2 </td><td>赤</td><td> ++ </td></tr></tbody></table> 表1 基質の組み合わせ略語：+++、強いです;。 ++、媒体と、 +、弱いNBT、4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド; BCIP、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル - ホスフェート。 INT、2-（4-ヨードフェニル）-3-（4-ニトロフェニル）-5-フェニルテトラゾリウムクロリド。 MAG、マゼンタフォス、5-ブロモ-6-クロロ-3-インドリル - ホスフェート、NAMP、ナフトールAS-MXリン酸; NABP、ナフトールAS-BIリン酸; NAGP、ナフトールAS-GR-リン酸塩; SB9.5、pHは9.5で染色緩衝液; SB8.2、pHは8.2で染色緩衝液; TT8.2、pHは8.2でトリス - トゥイーンバッファー。

我々は、色の沈殿物を対照することによって三つの異なるmRNAの分布パターンの同時および特定の検出を可能にする、完全なショウジョウバエの胚におけるマルチターゲット発色性ホールマウントin situハイブリダイゼーション （MC-WISH）の手順を説明します。

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

発色マルチターゲットWISHの全体的な目的は、無傷のショウジョウバエ胚内におけるmRNA分布パターンのマッピングを容易にすることです。この方法により、同一の胚内で3つの異なる遺伝子のmRNA局在を直接比較することができます。マルチカラーWISHは、発生中の生物における遺伝子発現マップを迅速かつ信頼性の高い方法で作成するために使用されます。これにより、遺伝子調節相互作用、活性および胚発生、または器官形成に関する重要な手がかりが得られます。この技術の主な利点は、異なる遺伝子のmRNA発現パターンを、はっきりとした対照的な色で可視化できることです。これにより、特有の発現部位や重複する発現部位を高精度に強調することができます。標準的な手順に従って、必要な胚を収集し、脱膜、固定、および脱卵黄化を行います。必要になるまで、冷凍庫のメタノール中に保存してください。次に、室温に置いた胚を用いて開始します。12ウェルプレートの最初のウェルにインサートを装着し、2 mLのメタノールを加えます。手順全体を通じて胚を保持するために使用するインサートに、目的の量の胚を移します。次に、減少するメタノール系列で3分間ずつインキュベートし、胚を再水和させます。まず、PBS中の75% メタノールから開始します。続いて、PBS-T中の50% メタノールを用います。その後、PBS-T中の25% メタノールを用い、最後に純粋なPBS-Tで2回インキュベートして終了します。次に、室温で20分間、PBS中の4% パラホルムアルデヒドで胚を前固定します。PBS-Tで4回洗浄し、固定液を除去します。洗浄ステップの間に、Proteinase Kとグリシンのワーキングソリューションを解凍し、調製します。洗浄後、室温で3分間、新しく調製したProteinase Kで胚を透過処理します。新しく調製したグリシンで1分間ずつ2回洗浄し、反応を停止させます。その後、室温で20分間、PBSで調製した4% パラホルムアルデヒドで胚を後固定します。PBS-Tで1回3分間の洗浄を4回行い、パラホルムアルデヒドを洗い流します。その後、胚を前ハイブリダイゼーションバッファーに移します。必要になるまで、冷凍庫に保存することができます。前ハイバッファーに入った胚を2 mLチューブに分配することから始めます。沈殿した胚を約15 µLずつ各チューブに分注します。次に、胚を65

multi-target-chromogenic-whole-mount-situ-hybridization-for-comparing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ-...

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

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ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

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学ぶマルチターゲット発色ホールマウントインサイツハイブリダイゼーション（MC-WISH）法を用いて、ショウジョウバエ胚における複数遺伝子のmRNA発現パターンを同時に可視化し比較する手法です。

マルチターゲット発色ホールマウント

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