Name: ラットの肝臓におけるDNA鎖切断および酸化的DNA損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぼう、ラット肝臓におけるDNA鎖切断と酸化的DNA損傷を測定するアルカリコメットアッセイ法を。酵素修飾法を用いて単一細胞レベルで損傷を評価し、遺伝毒性の安全性評価に活用できます。

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この作業は米国食品医薬品局(FDA)の支援を受けました。Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. 酢酸シプロテロン処理F344ラットにおける遺伝毒性の性特異的用量反応分析に関するCPA研究の原著論文を認めます。Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

倫理文：動物が関与する手順は、毒性学研究のための米国FDA /ナショナルセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 注：ここで説明する研究デザインは、インビボげっ歯類アルカリコメットアッセイ18の彼らの検証のための代替法検証のための日本語センター（JaCVAM）によって開発されたプロトコルに基づいて、さらにOECDガイドラインTG489 19の勧告に基づいて修正されます。 1.準備<ol><li>スライドの準備<ol><li>電子レンジで加熱することにより、リン酸緩衝液中（のCa 2+、Mgを2+遊離およびフェノールレッドを含まない）（w / v）の1％アガロース定期的な溶融を溶解させます。 </li><li> 55℃の水浴中で溶融し、1％標準アガロース溶液を置き、浴で温度を平衡化。ディップガラス顕微鏡は、任意のexcesを切る、アガロース溶液にスライドアガロースだときれいなスライドの背中を拭いてください。平らな面に縦スライドを置き、スライドを室温で乾燥することができます。乾燥した場所にスライドを保存します。 </li></ol></li><li>コメットアッセイ溶液の調製<ol><li> 0.5％の低融点アガロース溶液を調製します。電子レンジで加熱することにより、リン酸緩衝液中でアガロース低融点（ の Ca 2+はMg 2+、及びフェノールレッドを含まない）に溶解します。彗星スライドの準備中に37-45℃でソリューションをしてください。その後、残りのアガロース溶液を捨てます。 </li><li>溶解緩衝液を準備します。エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（EDTA二ナトリウム、ミスター372.24グラム/モル）、2.5 M塩化ナトリウム（NaClを、氏58.44グラム/モル）、および10 mMのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トリス塩基、ミスター121.14グラム/モル）の100 mM溶液を作ります精製水に、10 N水酸化ナトリウム溶液（NaOHで、氏は40g /モル）でpHを10に調整します。使用の日に、最終concentratを達成するために、溶液にトリトンX100、およびジメチルスルホキシド（DMSO、氏78.13グラム/モル）を添加それぞれ1％、10％、のイオン、そして使用前に少なくとも30分間4-9℃で撹拌しました。 </li><li>使用日に新鮮な酵素緩衝液を作ります。 40mMの2- [4-（2-ヒドロキシエチル）ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸（HEPES、ミスター238.3グラム/モル）を含む溶液を調製し、100mMの塩化カリウム（KClを、氏74.55グラム/モル）、0.5 mMのEDTA二ナトリウム、および精製水で0.2％ウシ血清アルブミン（BSA、ミスター六万六千四百六十三/モル）。 10 N水酸化カリウム溶液（KOH、56.1グラム/モル）で8.0にpHを調整します。 RTで攪拌し、使用前に完全な溶解を確認します。 </li><li>精製水に300mMのNaOHおよび1 mMのEDTA二ナトリウムを含むアルカリ性緩衝液を準備します。使用前に少なくとも30分間4-9℃で撹拌しました。使用前に溶液のpHを測定し、pHが&gt; 13であることを確認してください。 </li><li>精製水に0.4 Mトリス塩基の溶液を用意し、塩酸（HCl、氏36.46）でpHを7.5に調整します。 4-10℃でソリューションを保存します。これは、バッファが中和されています。 </li><li> Fを作ります使用日にバッファをミンチレッシュ。ハンクス液中の20mM EDTA二ナトリウムおよび10％DMSOを含有する溶液（HBSS、のCa 2+はMg 2+、およびフェノールレッドを含まない）を準備します。使用するまで氷上で保管してください。 </li><li>染色溶液を調製するには、1でトリス - ホウ酸-EDTA（TBE緩衝液）と核酸蛍光染色原液を希釈：万（v / v）でした。アルミ箔を用いた光からソリューションを保護します。 2-8℃で保存し、24時間で使用しています。 </li></ol></li></ol>ラット肝臓からの単一細胞懸濁液の調製<ol><li> 2013年版20：動物の安楽死のためのアメリカの獣医診療ガイドラインで推奨される方法以下のCO 2ガスのラットを安楽死させます。 <ol><li> 2.75でCO 2流量を設定します。安楽死室（ 例えば 、デシケータージャー、通気蓋付きのラットケージ）にラットを入れ、タンクバルブを開くことにより、CO 2をオンにします。まで1.5〜2.5分間待ちラットは無意識になります。その最大設定にCO 2流を増加させます。呼吸が停止した後、安楽死を確実にするために、約1分間チャンバー内でラットを残します。ラットがハートビートを持っていないことを確認するために、触診、およびラットがその手足を撤回しないことを決定するためにつま先をつまんで安楽死を確認します。 </li></ol></li><li> 70％エタノールで髪の皮膚を消毒します。腹腔を開き、手術用ハサミで無傷の肝臓を削除します。肝臓を除去した後、手術用ハサミで残りの肝臓から左側葉を取り除きます。まな板の上の左側葉を置き、使い捨て片刃カミソリの刃を使用して2つの隣接する3〜4ミリメートル厚の横断切片を切りました。 </li><li> （セクションのカールを防止するために）ろ紙上の1つの横断面を配置し、10％中性緩衝ホルマリン（NBF）にセクションを配置します。 ：1以上の組織に10％NBFの比が10であることを確認してください。少なくとも72時間の固定時間の後、PROC組織病理学のために肝臓をESS（以下のセクション7を参照してください）​​。 </li><li> 6センチメートルペトリ皿に5ミリリットルの氷冷ミンチバッファ（セクション1.2.6）に第2の横肝臓切片を置き、残留血液を除去するために3回すすいでください。 </li><li> 1ミリリットルの氷冷ミンチ緩衝液を含む新しい2 ml遠心管に肝臓切片を転送します。細胞を放出するために細かいハサミでよくすすぎ、肝臓切片をミンチ。任意の組織塊を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液株。 </li><li>氷の上で単一細胞懸濁液を置き、1時間以内にスライドを作るために使用します。その濃度は約2×10 6細胞/ mlであることを確実にするために（血球計または電子細胞カウンターで、 例えば ）をカウントすることにより、細胞の濃度を確認してください。 </li></ol>コメットスライドの調製<ol><li>溶融し、37℃、0.5％の低融点アガロース溶液（セクション1.2.1）の10倍量の単一細胞懸濁液の1ボリュームを混ぜます。すぐに、通常の融点アガロース（セクション1.1）でコーティングしたスライド上に100μLをピペット。すぐに細胞 - アガロース混合物の上にカバースリップを配置。各サンプルの少なくとも8のスライドを作成します。 注：スライドは盲検法で得点することができるように、全てのスライドは、記録された番号または類似のコードと自分のアイデンティティによって識別されるべきである（以下、6.2.2を参照のこと）。 </li><li> 30分間、4℃に平らな、クールなスライドを置きます。 </li><li>ゲルが固化した後、静かにカバースリップを除去し、予め冷却溶解バッファー（セクション1.2.2）にスライドを浸します。光からスライドを保護し、O / N（最大）に1時間（最小）から4℃の溶解緩衝液中でスライドを保ちます。 </li></ol>コメットスライドの4酵素処理<ol><li>溶解緩衝液から各組織試料から調製された8スライドの6を削除し、それらを室温で酵素緩衝液（セクション1.2.3）で各5分間、3倍すすぎます。アルカリコメットアッセイワットのために、残りの2つのスライドを使用してくださいithout酵素処理（以下、5.1を参照してください）​​。すすいだ後、組織とスライドを排出し、ブロッティングにより、過剰な液体を除去します。 </li><li> 1で酵素緩衝液とhOGG1と遠藤III酵素株式を希釈：1,000（v / v）でした。使用するまで氷上に置いてください。 </li><li>酵素単独緩衝液200μl（基準スライドとして使用する2スライド）、200μlのhOGG1溶液（2スライド）または200μlの遠藤III溶液（2スライド）：各処置群から調製されたスライドに、以下の溶液を200μlを適用します。 </li><li> 、湿らせたペーパータオルを敷いたペトリ皿の中にスライドを入れパラフィルムでスライドをカバーし、遠藤III処理およびリファレンススライドとhOGG1処理されたスライドの30分間、37℃で45分間インキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、蒸留水でスライドを洗浄し、以下、5.2で説明したように処理を継続します。 </li></ol> 5.巻き戻しと電気泳動<ol><li>酵素で処理していないスライドは、溶解緩衝液からスライドを削除、スライドを排出し、残留洗剤および塩を除去するために、5分間の冷中和バッファー（セクション1.2.5）で1回すすいでください。 </li><li>すべてのスペースを避け、ステップ4.5および水平ゲル電気泳動槽内のランダムに5.1から場所スライド、。液面がちょうどスライドを覆うまで（アガロースの上に泡を回避し、タンクがレベルであることを確認してください）​​たててpH&gt; 13電気泳動バッファー（セクション1.2.4）でタンクを埋めます。 DNAの巻き戻しの開始時に緩衝液のpHと温度を記録します。 </li><li>スライドはアルカリ責任損傷のDNAと表現の巻き戻しを可能にするために20分間、アルカリ性緩衝液に残ってみましょう。 </li><li>電気泳動槽（V / cmの=ボルトが正極と負極の間にCMで距離で割った値）は0.7 V / cmで製造する巻き戻し、プログラム電力供給時。 </li><li>巻き戻した後、電源装置上の実行ボタンを押してください。必要な場合は、バッファレベルを上げるか、下げることによって300ミリアンペアの電流を調整。目を保ちますただ、スライドの表面の上の電子バッファレベル。 4℃で20分間電気泳動を行います。電気泳動の開始時と終了時にスライドの配置、バッファーの温度と電流（アンペア）を記録します。 注：あまりにも多くのバッファは、DNAの移動を妨害する可能性がより低い電圧になります。 </li><li>電気泳動後、静かにタンクからスライドを持ち上げ、5分間中和バッファー（セクション1.2.5）に浸漬することにより過剰のアルカリを中和します。スライドを排出し、さらに2回繰り返します。 </li><li> 5分間の冷100％エタノールに浸漬することによりスライドを修正しました。保存のための乾燥した場所で空気乾燥し、場所にスライドを許可します。 </li></ol> 6. DNA染色、彗星の可視化と分析<ol><li> DNA染色<ol><li>段ボールや金属トレイにスライドを置き、各スライドに核酸蛍光染色作業溶液（セクション1.2.7）の200μlを添加し、ガラスカバースリップでカバーしています。からスライドを保護します光は、スライドをスコアリング前に少なくとも30分間染色溶液と接触したままであることを可能にします。一度に20のバッチでスライドを染色します。 </li><li>各スライドを読む前に、静かにカバーガラスを乱さないように注意しながら、余分な染色液を離れブロット。 </li></ol></li><li>彗星の可視化とスコアリング<ol><li>コンピュータのモニタ上の彗星スライドのライブ映像を表示するために蛍光顕微鏡に取り付けたビデオカメラを使用してください。 </li><li>ランダムに細胞を含有する顕微鏡のフィールドを選択します。マウスを使用して、セルを選択します。マウスの左クリックで「コメットヘッド」の中心をクリックします。 注：コンピュータソフトウェアは、セルのすべての測定パラメータを計算し、データファイルにデータを追加します。 </li><li>現在のフィールド内のすべてのセルをスコア（ステップ6.2.4を参照）、その後、細胞の別のセットを見つけるために、顕微鏡のステージを制御し、画面に表示される映像を使用しています。 6.2.2で説明したように、これらの細胞をスコア。 </li><li>スライドFスコアロム右は左とまでダウンします。ランダムに約10のフィールドを選択してください。このプロセスの間、視野に表示される任意の適切な彗星の細胞は、バイアスなしで採点されるべきです。 注：以下のいずれかに該当する場合彗星を獲得しないでください：1）には、スライドのエッジのいずれかに位置しています。 2）2以上の彗星が重複します。 3）尾部の破片があります。 4）ソフトウェアは、頭と尾を区別することはできません。または5）核および/または尾の染色は、スライド上の他の彗星とは大きく異なります。 注：尾のほぼすべてのそれらのDNAの蛍光を持つ彗星は、しばしば「ハリネズミ」彗星と呼ばれています。ヘッジホッグ彗星が得点されるべきではなく、スライドスコアリング中に検出されたハリネズミの数を記録し、合計彗星の割合として報告されるべきです。 </li><li>合計で少なくとも150彗星細胞/サンプルを得るために、器官/組織ごとに2つのスライドを読んで、スライドあたり少なくとも75彗星を分析します。スライドからの細胞の必要な数があることした後ENは、結果は、後のデータ分析のためにスプレッドシートファイルとして保存され、得点しました。 </li></ol></li></ol> 7.組織病理学分析<ol><li> 21をトリミング組織に続いて10％NBF中に72時間固定、最小の後、日常的に処理し、パラフィンワックスベースの媒体22内のサンプルの左側肝葉を埋め込 ​​みます。セクションのサンプルでは、​​約5ミクロンとガラススライド上に収集します。 </li><li>ヘマトキシリン​​＆エオシン（H＆E）を持つセクションを染色： <ol><li>染色手順の前に2時間60℃のオーブン中でパラフィン組織切片を有するスライドを加熱します。 </li><li>側面を脱パラフィンをキシレンを使用してください。水道水洗浄への段階的エタノール（EtOH）中でスライドを再水和。 </li><li> 2分40秒のためにヘマトキシリン​​の450ミリリットルでスライドを配置します。水道水すすぎを実行している5分までに、次の4秒間酸（450ミリリットルに2ミリリットルの氷酢酸脱イオン水）でスライドを洗浄します。 </li><li>スライドさを置きます2分30秒、1分、70％EtOHでリンス用水道水すすぎを実行し、続いて2分間1mlの水酸化アンモニウムを含む450 mlの70％エタノールでエス。 </li><li> 3分、4 mlの氷酢酸を含む450 mlのエオシンY溶​​液でスライドをインキュベートします。 </li><li>傾斜EtOHでスライドを脱水。キシレン（3回各1分）でスライドをオフにして、カバースリップをスライド上に置かれるまで、キシレンにスライドを保持します。 </li></ol></li><li> 1（最小限）、2（軽度）、3（中程度）、または4のように重症度のための光学顕微鏡、レコード所見、および悪性度非腫瘍性病変によってスライドを調べます（印）。 注：;軽度=百分の16から35;中等度= 36から60までパーセント;特定の病変に適用される重症度グレードが病変と肝臓の相対的な割合（最小限= &lt;百分の1から15に基づいており、マークさ= 61- 100％）。 </li></ol> 8.データ解析<ol><li>動物は、統計的評価のための実験的な単位と考えられています。 DNA損傷は、％DNとして表されます尾部にA。 </li><li>基準スライド（無酵素処理）のバックグラウンドDNA鎖切断（SB）の推定値を提供する：酸化的DNA損傷は、次​​のように計算されます。 注：酵素処理したスライドは、鎖切断の尺度と酸化塩基（SB + OX）を提供します。 DNA損傷の関数としてのテールにおける％DNAのための線形の用量反応を仮定すると、SB + OXからSBの減算は、酸化ピリミジン/変更されたプリン23からのDNA鎖切断の推定を与えます。 </li><li>車両制御に処置した動物における応答の対比較のためのダネット検定が続く一方向ANOVAによって、用量の関数として尾の％DNAを分析します。 注：すべての試験は片側であり、0.05未満のp値は、統計的有意性の基準として設定されています。 </li></ol>

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どの著者も、競合する利益や相反する利益を持っていません。これらの資料の情報は、FDAによる正式な情報の配布ではなく、FDAの立場や方針を表すものではありません。

このプロトコルは、単一細胞レベルでのラットの肝臓の両方の直接および酸化的DNA損傷の同時測定を説明します。一般的なプロトコル（ すなわち 、DNA損傷がない試験薬剤によって、しかし動物組織の取り扱いおよび処理によって誘導される）は、単一の細胞または核は最小限の処理によって誘導されるDNA損傷に単離することができる任意の組織にも適用可能です。私たちの研究では、骨髄7,9、胃6、腎臓9、膀胱9、肺9、心臓10、乳腺5、子宮5、精巣5、および血液5から細胞にアルカリコメットアッセイを行いました。これらのアッセイは、多数の器官および実験動物の組織における生体異物誘発性のDNA損傷を研究するための、迅速、単純で安価な方法を提供することができます。また、この方法は、例えば、末梢血には、剥離、アッセイを行うことにより、人間のバイオモニタリング研究のために使用することができます尿管の細胞、または臨床的または職業的に暴露...

アルカリ性コメットアッセイは、単一細胞レベルでDNA鎖切断を測定します。単一細胞の懸濁液を、顕微鏡スライド上のアガロース中に埋め込まれており、細胞がDNAのスーパーコイルループを含む核様体を形成するために溶解しました。陽極に向かって移動するDNAの解放された鎖と、鎖の切断を含むDNAループ内の超らせんの損失のpH&gt; 13の結果で電気泳動、蛍光顕微鏡で観察することができる彗星のような構造を作成します。断片化されたDNAは、DNAの破壊1を定量するために使用することができるフラグメントの大きさ、および全強度（頭部および尾部）に比べコメットテールの相対的な蛍光に基づく「テール」に彗星の「ヘッド」から移行します、2。アッセイは、単純な敏感な、汎用性の高い、迅速、かつ1比較的安価です。 DNA損傷物質によって引き起こされる断片化したDNAの検出は、細胞内のDNA損傷を定量化するためのアッセイを使用するか、またはから核を分離されているがindivi潜在的に遺伝毒性物質（複数可）で処置した動物のデュアル組織。 、その利点に、in vivoでのコメットアッセイは、現在の調和国際会議（ICH）3および欧州食品安全機関（EFSAにおける製品安全性評価を行うために（in vivoの小核試験と対になる）は、第2のin vivo遺伝毒性アッセイとして推奨されます）4規制ガイドライン。私たちの研究室では、食品成分、医薬品、およびナノ材料5-10により誘発される生体内のDNA損傷を評価するためのアッセイを採用しています。ラット肝臓は、このプロトコルの例として使用されるが、コメットアッセイは、実験動物の他の組織/器官限り、組織から単離することができる無傷の単一細胞で行うことができます。 DNA損傷の特定のタイプは、基本的なアルカリ性コメットアッセイを変更することなく、DNA鎖切断のように検出することが困難です。酸化的DNA損傷の場合には、ストランドBreaksは、8-オキソグアニン（8-oxoGua）で休憩し、メチルfapy -グアニン11を作成し、人間8-オキソグアニン-DNA-N-グリコシラーゼ1（hOGG1、などの修復酵素で消化することによりDNAに酸化的損傷で作成することができます。また、エンドヌクレアーゼIII（遠藤III）を酸化さピリミジン1で主に切断を生じる。したがって、酵素消化工程の追加アッセイをインビボ 12 に酸化的DNA損傷を測定するための特異的かつ高感度の方法を行う。これらのアッセイを利用して、我々は実証しましたラットとマウス6-8の肝臓におけるラット10の中心部にある毒物誘発性酸化的DNA損傷。 in vitroで敏感で識別される遺伝毒性物質のためのインビボアッセイにおけるフォローアップが3,13をテストとして1）、2）複数の組織における生体異物によって誘発されるDNA損傷のメカニズムを評価する：アルカリコメットアッセイは、遺伝毒性と人間のバイオモニタリングで多くのアプリケーションを持っています14、3）かどうかを調べるため発癌物質は、4）、5）は、ヒトの疾患および職業暴露16を調べ、そしてするDNA損傷の修復15を評価するために、遺伝毒性または作用の非遺伝毒性モード（MOA）7を使用して動作6）のための潜在的なハイスループットスクリーニングアッセイとして臓器特異的な遺伝毒性17。

<table><tbody><tr><td>カバースリップ(No.1、24 x 50 mm)&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドフィ</td><td></td><td>ッシャー12-550-123</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA、二ナトリウム</td><td>Fisher</td><td>BP120-1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Fisher</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free)</td><td>HyClone</td><td>SH30588.02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース (LMP)</td><td>ロンザ</td><td>50081</td><td>NuSieve GTG アガロース</td></tr><tr><td>ノーマル メルティング アガロース (NMA)&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>pH試験紙ストリップ(pH 7.5-14)</td><td>フィ</td><td>ッシャーM95873</td><td></td></tr><tr><td>カリウムクロライド</td><td>フィ</td><td>ッシャー7447-40-7</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化カリウム</td><td>フィ</td><td>ッシャー1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>スライドラベル(0.94 x 0.5インチ)</td><td>フィッシャー</td><td>NC9822036</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&trade;ゴールド&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャー9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>トリズマベース&nbsp;</td><td>フィッシャー</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>05-402-6</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー (40 & micro;m)</td><td>フィッシャー</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>エンドヌクレアーゼIII(Nth)&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0268S</td><td>希釈1:1,000</td></tr><tr><td>hOGG1&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0241S</td><td>希釈1:1,000</td></tr></tbody></table>

ラットの肝臓におけるdna鎖切断および酸化的dna損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで

In Vivo Alkaline Comet Assay and Enzyme-modified Alkaline Comet Assay for Measuring DNA Strand Breaks and Oxidative DNA Damage in Rat Liver

修復されていないDNA損傷は遺伝的不安定性を引き起こし、それが癌の発症を促進する可能性があります。したがって、潜在的なDNA損傷物質を特定することは、公衆衛生を保護するために重要です。鎖が切断されるときにDNA損傷を検出するin vivoアルカリコメットアッセイは、その応答が化学物質のin vivo吸収、組織分布、代謝および排泄(ADME)、およびDNA修復プロセスを反映するため、生体異物の遺伝毒性ハザードの評価に特に関連性があります。他のin vivo DNA損傷アッセイと比較して、このアッセイは迅速で、感度が高く、視覚的で安価であり、特定の修復酵素を使用して酸化的DNA損傷を鎖切断に変換することにより、アッセイは効率的かつ比較的アーチファクトのない方法で酸化的DNA損傷を測定できます。コメットアッセイによるDNA損傷の測定は、急性および亜慢性の毒性研究デザインを使用して行うことができ、コメットアッセイを他の毒性学的評価と統合することにより、アッセイは動物資源を最大限に活用することにより、動物福祉の要件に対処します。アッセイのもう一つの大きな利点は、少量の細胞しか必要とせず、細胞が増殖する細胞集団に由来する必要がないことです。アッセイは、臨床的または職業的に曝露された個人から得られたさまざまなヒトサンプルを使用して実行することもできます。

インビボでのアルカリ性コメットアッセイは、酢酸シプロテロン（CPA）5で処理したラットの肝臓における直接および酸化的DNA損傷の両方を測定するための酵素修飾コメットアッセイに関連して行きました。 CPAは、メス24に比べて雄ラットに肝腫瘍を誘発するために必要な5倍高い用量で、性別特異的にラットの肝臓腫瘍を誘発する合成ホルモン薬です。 CPAの5倍、より高い用量は、DNA損傷の有意な増加を誘導するために必要とされている：私たちは、雌雄ラットの肝臓でCPAによって生成され、直接DNA損傷がそのhepatotumorigenicityと同じ性別固有のパターンを有していることがわかりましたメスに比べてオスの肝臓（ 図1）。 私たちは、性別固有のコメットアッセイの結果が15倍高くなっているヒドロキシ基転移酵素（複数可）（HST）の活動によるものであると仮定する成人男...

アルカリ彗星アッセイは、真核細胞のDNA鎖切断を測定します。エンドヌクレアーゼIIIまたはヒト8-オキソグアニン-DNA-N-グリコシラーゼ消化ステップを追加することで、アッセイは酸化的DNA損傷を効率的に検出できます。これらのアッセイを使用してラット肝臓のDNA損傷を検出する方法について説明します。

ラットの肝臓におけるDNA鎖切断および酸化的DNA損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで

Unrepaired DNA damage can lead to genetic instability, which in turn may enhance cancer development. Therefore, identifying potential DNA damaging agents ...

in vivo アルカリコメットアッセイおよび酵素修飾アルカリコメットアッセイの全体的な目的は、単一細胞レベルで直接的なDNA損傷と酸化的DNA損傷を同時に測定することです。この手法は、FDA規制製品の安全性分析のための規制ツールとして初めて提案されました。これにより、規制上の安全性評価から分子疫学、基礎的ながん研究に至るまで、幅広い分野における重要な疑問への回答に役立てることができます。この手法は感度が高く汎用性に優れており、比較的安価です。事実上あらゆる動物組織におけるDNA損傷を検出することが可能です。一般的に、この手法に習熟している人々であっても、さまざまな組織から単細胞懸濁液を迅速に調製することに苦慮する場合があり、それが課題となることがあります。この手法は、科学的根拠だけでなく一定の熟練した技術を要するため、視覚的な実演が極めて重要です。テキストのプロトコルに従い、二酸化炭素ガスでラットを安楽死させた後、触診によって心拍がないことを確認し、足指をつまんで肢を引かないことを確認します。エタノールで皮膚を消毒し、外科用鋏で腹腔を開いた後、損傷のない肝臓を摘出します。ハサミを用いて、左側葉を器官の残りの部分から切り離し、まな板の上に置きます。次に、使い捨ての片刃カミソリを使用して、隣接する3〜4 mm厚の横断切片を2枚作成します。横断切片の1枚をフィルターペーパーの上に置き、その後、10%中性緩衝ホルマリン（NBF）に入れます。2枚目の肝臓切片を、6 cmのペトリ皿に入れた5 mLの氷冷ミンシングバッファーに加え、3回洗浄して残留血液を除去します。次に、肝臓切片を1 mLの氷冷ミンシングバッファーを含む新しい2 mL遠心チューブに移します。微細剪刀を用いて切片を細かく刻んで細胞を遊離させ、その後、40 µmのセルストレーナーを用いて細胞懸濁液をろ過し、組織の塊を除去します。単一細胞懸濁液を氷上に置き、ヘモサイトメーターを用いて、細胞濃度が約2 × 10⁶ cells/mLであることを確認します。コメットスライドを調製するために、単一細胞懸濁液1量分と、37 °Cに溶かした0.5%低融点アガロース溶液10量分を混合します。直ちに100 µLをあらかじめ調製したアガロースコートスライド上にピペットで分注し、カバーガラスでアガロース細胞混合物を覆います。スライドを平らに置き、4 °Cで30分間冷却します。ゲルが凝固した後、カバーガラスを静かに取り除き、あらかじめ冷却した溶解緩衝液にスライドを浸します。暗所、4 °Cで1時間から一晩インキュベートします。インキュベーション後、各組織サンプルに対して準備した8枚のスライドのうち6枚をライシスバッファーから取り出し、室温の酵素バッファーを用いて5分間ずつ3回洗浄します。次に、ティッシュで余分な溶液を拭き取ります。続いて、hOGG1およびEndo III酵素ストックを酵素バッファーで1:1000に希釈し、氷上に置きます。スライドを濡らしたペーパータオルを敷いたペトリ皿に入れ、各処理群のスライドに以下の溶液を200 µLずつ滴下する。2枚のスライドに酵素バッファーのみ、2枚のスライドにhOGG1溶液、2枚のスライドにEndo III溶液を加え、パラフィルムでスライドを覆う。その後、スライドを37 °Cに置き、Endo III処理スライドと参照スライドを45分間、hOGG1処理スライドを30分間インキュベートする。インキュベーション後、スライドを水切りし、リファレンススライドについては、冷中和緩衝液を用いて残留界面活性剤および塩を除去します。次に、蒸留水を用いて酵素処理したスライドを洗浄します。スライドを隙間がないように、水平ゲル電気泳動槽にランダムに配置します。次に、気泡が入らないように注意しながら、スライドがちょうど浸かるまで、調製したばかりの電気泳動バッファーをタンクに加えます。電源を1センチメートルあたり0.7ボルトに設定し、DNAの解離およびアルカリ不安定損傷の発現を促すため、スライドをアルカリバッファー中で20分間インキュベートします。スライドの配置、バッファーの温度、および電流値を記録してください。アンワインディングのためのインキュベーション後、電気泳動槽を4°Cに設置します。次に、電源のRunボタンを押し、必要に応じて、バッファーレベルをスライドのわずか上になるよう調整し、電流を300 mAに設定します。サンプルを20分間泳動させ、その後、再びスライドの配置、バッファーの温度、および電流を記録します。電気泳動後、スライドをタンクから慎重に引き上げ、中和緩衝液に浸して過剰なアルカリを中和します。その後、スライドの液を切った状態で、中和操作をさらに2回繰り返します。冷えた100% ethanolを用いて、スライドを5分間固定します。スライドを自然乾燥させ、乾燥した環境で保存します。DNAを染色するため、スライドをカードボードまたは金属製のトレイに置き、各スライドに200 µLの核酸蛍光染色用作業溶液を加え、カバーガラスで覆います。スライドを遮光し、少なくとも30分間インキュベートします。次にスライドを観察するため、カバーガラスをずらさないよう注意しながら、過剰な染色液を優しく吸い取ります。次に、ビデオカメラを備えた蛍光顕微鏡のステージにコメットスライドを設置し、細胞を含む視野をランダムに選択します。コメットアッセイソフトウェアを起動し、マウスを使用して細胞を選択し、その細胞のコメットヘッドの中心を左クリックします。ソフトウェアが細胞のパラメータを算出し、データファイルに追加します。現在の視野内のすべての細胞のスコアリングが完了したら、別の視野に移動し、偏りなく、出現した適切なコメット細胞のスコアリングを繰り返します。1枚のスライドにつき、ランダムに10視野、少なくとも75個のコメットをスコアリングしてください。最後に、後の解析のためにデータをスプレッドシートに保存します。既報の通り、CPAは性別に依存してラットの肝腫瘍を誘発する合成ホルモン剤であり、雌ラットと比較して雄ラットで肝腫瘍を誘発するには5倍の用量が必要です。ここで示したように、in vivo アルカリコメットアッセイおよび酵素修飾コメットアッセイにより、雄の肝臓でDNA損傷を有意に増加させるには、雌と比較して5倍高い用量のCPAが必要であることが実証されました。ヒドロキシステロイドスルホトランスフェラーゼ（HST）は、成体雄ラットと比較して、成体雌ラットで15倍高く発現しています。HSTによる代謝は、CPAがDNA結合性代謝物へと活性化される際の律速段階となります。ここで示されているように、CPA誘発性の酸化的なDNA損傷は、一般に雌よりも雄のラット肝臓で大きく、したがって、雄ラットにおける腫瘍形成において律速段階となる可能性は低いと考えられます。これらの表に示されている通り、CPA投与ラットの肝臓の組織病理学的評価では、薬剤誘発性の構築的なアポトーシスや壊死の証拠は見られず、コメットアッセイの陽性結果が細胞毒性の二次的影響ではないという以前の結論が裏付けられました。この手順を行う際は、単一細胞懸濁液を回収し、可能な限り速やかにコメットアッセイ用のスライドを調製することが重要です。この手法の開発により、遺伝毒性学分野の研究者は、ほぼすべての動物組織およびヒトサンプルにおいて、DNA損傷および修復を定量的に探索することが可能となりました。このビデオを視聴することで、in vivo アルカリコメットアッセイと酵素修飾コメットアッセイを併用し、動物組織の単一細胞レベルでラットのDNA切断と酸化DNA損傷を同時に測定する方法について、より深く理解していただけると考えています。DNA損傷試薬を取り扱う際は、極めて危険を伴う可能性があることに留意してください。これらの手順を実施する際は、常に個人用保護具を着用してください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、ドキソルビシン処理細胞における一本鎖および二本鎖DNA切断を定量するためのアルカリ性単一細胞電気泳動アッセイを実演します。アルカリ性条件では、DNA塩基対間の水素結合が破壊され、DNA鎖が完全にほどかれて分離します。これにより、電気泳動時にアガロースゲル中の損傷していないDNA断片と損傷したDNA断片の異なる移動が可能になり、円形の彗星頭を形成する損傷していないDNA断片がゆっくりと移動し、損傷したDNA断片が細長い彗星尾を形成する彗星型の構造が明らかになります。...

アルカリ性単一細胞ゲル電気泳動:化学療法後の個々の癌細胞におけるDNA損傷の定量的推定のための高感度技術

このビデオは、有害物質にさらされた後のDNA損傷を検出するための彗星アッセイを示しています。アルカリ性条件下では、DNAは巻き戻されて変性し、電気泳動では、損傷していないDNAと損傷したDNAがアガロースゲル内で異なる方法で移動し、彗星状の構造を形成します。ゆっくりと移動する損傷を受けていないDNAは円形の彗星の頭を形成し、急速に移動する損傷したDNA断片は細長い彗星の尾を形成します。...

細胞内のDNA損傷検出のためのCometアッセイ

コメットアッセイは、アルカリに不安定なサイトや海馬ニューロンを含むすべての細胞のDNAにDNA-DNA/DNA-proteinクロスリンクを含むシングルと二重鎖切断を検出する効率的な方法です。この方法は、DNA損傷の量の違いに起因する電界中のDNAの差のマイグレーションを活用しています。...

コメットアッセイを用いて海馬神経細胞のDNA損傷を測定する

ここでは前例のないスループットDNA損傷のコメットアッセイの検出を可能にするプラットフォームについて説明します。デバイスパターンマイクロアレイへの哺乳動物細胞および96サンプルの並列処理を可能にします。アプローチは、基本レベルのDNA損傷、曝露によって誘導されるDNA損傷とDNA修復の動態の解析を容易にする。...

CometChip：マイクロアレイヒト細胞におけるDNA損傷を測定するためのハイスループット96ウェルプラットフォーム

コメットアッセイは、様々な要因によって誘発されるDNA破壊を測定します。 DNAの損傷を引き起こす（酸化ストレスを除く）すべての要因が一定に保持される場合、DNA損傷の量は、酸化ストレスの良い間接的なパラメータです。このプロトコルの目的は、酸化ストレスの間接的な測定のためのコメットアッセイを使用することです。...

全身酸化ストレスの間接的な指標として、コメットアッセイ

マウス脾臓リンパ球への慢性的なin vivo低線量照射によって誘発される可能性のあるDNA損傷レベルとDNA修復能力の変化を評価するためのプロトコルが、フローサイトメトリーを使用してDNA二本鎖切断のマーカーであるリン酸化ヒストンH2AXを測定することによって提示されます。...

慢性後のマウス脾細胞におけるDNA損傷と修復の測定<em&gt;インビボ</em&gt;β-およびγ-放射線の非常に低い用量への暴露

コメット ・ アッセイは、単一および二重鎖 DNA を含む DNA 損傷の中断を検出する効率的な方法です。化学療法の治療効果を評価するためがん細胞における DNA...

コメットアッセイを用いた DNA 損傷の in Vitro評価

このプロトコルは、DNA損傷を評価するために彗星アッセイで使用するための壊死時に高品質の凍結組織サンプルを調製するためのいくつかの手順を説明します:1)細かい組織、2)消化管からの掻き取られた上皮細胞、および3)立方体組織サンプルは、組織ミンチ装置を用いて均質化を必要とする。...

DNA損傷評価のための彗星アッセイにおける凍結組織の利用

ここでは、病変誘導後のDNA複製における一本鎖DNAギャップを調べるためのDNAファイバーアッセイの2つの改変について説明する。S1ファイバーアッセイは、ssDNA特異的S1エンドヌクレアーゼを使用して複製後ギャップの検出を可能にし、ギャップ充填アッセイはギャップ修復の視覚化および定量を可能にする。...

DNAファイバーアッセイを用いたヒト細胞における複製後ギャップの蓄積と修復の検出

コメットアッセイは、DNA損傷を検出するための一般的な手段です。この研究では、コメットアッセイの代表的なバリアントでスライドを実行するためのアプローチについて説明します。このアプローチにより、サンプル数が大幅に増加し、アッセイの実行時間、スライド操作の回数、およびゲルの損傷のリスクが軽減されました。...

細胞DNA損傷を評価するためのハイスループットコメットアッセイアプローチ

学ぼう、ラット肝臓におけるDNA鎖切断と酸化的DNA損傷を測定するアルカリコメットアッセイ法を。酵素修飾法を用いて単一細胞レベルで損傷を評価し、遺伝毒性の安全性評価に活用できます。

ラットの肝臓におけるDNA鎖切断および酸化的DNA損傷を測定するためのインビボアルカリコメットアッセイおよび酵素修飾されたアルカリコメットアッセイで

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