ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

この手順の全体的な目標は、ウェットラボ試薬、標準化されたコントロール、およびバイオインフォマティクススイートに沿ったスタンドを組み合わせた、困難ながん検体のシーケンシングのための包括的なシステムを説明することです。この方法は、正確なDNAバリアント分析と解釈を達成するために、少量および低品質の腫瘍生検を配列決定する方法など、がん領域の主要な質問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、シーケンシングが困難なサンプル、つまり利用可能なDNA量が限られているサンプルを、シングルソース試薬とコントロール、および完全に統合されたバイオインフォマティクスソフトウェアを使用して迅速かつ確実に分析できることです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、この方法が簡素化するターゲットNGSの複雑さのために苦労します。ただし、ライブラリの定量とサンプルプーリングの手順では、すべてのサンプルライブラリで均一なカバレッジを実現するために特別な注意が必要です。このプロトコルは、困難ながん検体のシーケンシングのために、ウェットベンチプロセスとドライベンチプロセスを統合します。

最初のステップは、リアルタイムPCRで増幅できるDNAテンプレートコピーの数を決定するためのDNAの定量と適格性評価です。サンプルの定量と品質管理の手順を開始するには、微量遠心チューブに十分な量のマスターミックスを調製します。サンプルあたり、5マイクロリットルの2倍マスターミックス、0.5マイクロリットルのプライマープローブミックス、0.5マイクロリットルの阻害プライマープローブミックス、0.05マイクロリットルのROX、および2.95マイクロリットルの希釈液を使用してください。

9マイクロリットルのマスターミックスを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。DNA標準試料1マイクロリットルを二重に加え、ピペッティングで5回上下させて混合します。核酸サンプルが十分に混合されていることを確認した後、サンプルの1マイクロリットルをマスターミックスに加え、ピペッティングで5回上下させて混合します。

密封されたプレートをPCRシステムに入れます。摂氏95度で10分間のPCRサイクルを実行し、続いて摂氏95度で15秒、摂氏60度で1分間のサイクルを40サイクル実行します。重複するDNA標準試料ごとに線形回帰プロットを生成して、qPCRデータを解析します。

次に、マイクロリットルあたりの機能的または増幅可能なコピー数における未知DNAの濃度を、プロトコルテキストに記載されているように計算します。サンプルの定量と品質管理の次のステップは、シングルチューブマルチプレックスPCRによるがんホットスポット配列の濃縮です。遺伝子特異的または gsPCR は、21 のがん遺伝子の 46 遺伝子座を濃縮するために実行されます。

あたり以下の容量、5マイクロリットルの2倍増幅マスターミックス、および1マイクロリットルの汎がんプライマーパネルを使用して、微量遠心チューブに十分な量のgsPCRマスターミックスを調製します。6マイクロリットルのgsPCRマスターミックスを96ウェルプレートの各ウェルに分注します。各核酸サンプルの4マイクロリットルを個々のウェルに加えます。

ピペッティングで5回上下させて混合します。適切なコントロールを含めます。密封されたプレートをサーモサイクラーに入れ、次のPCRサイクルを行います。

95°Cで5分間、95°Cで15秒、60°Cで4分間、2サイクル、95°Cで15秒、72°Cで4分間、23サイクル。

72°Cで10分間の延長を行い、その後4°Cでキープします。遺伝子特異的PCRの後、10サイクルのタグPCRを実施して、次世代シーケンシングとの互換性のためにプラットフォーム特異的アダプターを組み込みます。7.5マイクロリットルの2倍インデックスマスターミックスと5.5マイクロリットルのインデックスコードを96ウェルプレートの指定ウェルに加え、ピペッティングで5回上下して混合します。

gsPCRプレートを慎重に開き、マスターミックスで新しいプレートに2マイクロリットルのgsPCR製品を追加します。密閉されたプレートをサーモサイクラーに入れ、次のPCRサイクル、摂氏95度で5分間、摂氏95度で30秒、摂氏55度で30秒、摂氏72度で1分間10サイクル、および摂氏72度で最終的に10分間延長します摂氏72度で10分間延長します。続いて摂氏4度で保持します。

タグPCRに続いて、ライブラリの精製とサイズ選択は、磁気ビーズ化学を使用して行われます。この手順は、11マイクロリットルのライブラリピュアプレップ磁気ビーズを96ウェルプレートの別々のウェルに追加することから始めます。タグPCRプレートを開き、10マイクロリットルのタグPCR産物をビーズに加え、ピペッティングで5回上下させて混合します。

混合物を室温で4分間インキュベートします。96ウェルプレートをマグネットスタンドに4分間置きます。96ウェルプレートをスタンドに置いたまま、ピペットで上清を取り除き、廃棄します。

プロトコールのテキストに記載されているように、エタノール含有洗浄バッファーでビーズを2回洗浄した後、ビーズを室温で2分間乾燥させ、プレートをスタンドから取り出します。各ウェルに20マイクロリットルの溶出バッファーを加え、ピペッティングを5回繰り返して、ビーズを再懸濁します。室温で2分間インキュベートします。

96ウェルプレートを磁気スタンドに4分間戻し、18マイクロリットルの透明な上清を慎重に取り出して、新しい96ウェルプレートのウェルに移します。このプロトコールの次のステップは、相対的に競合するリアルタイムPCRによる精製された各サンプルライブラリの定量化です。この手順を開始するには、サンプルあたり次の容量、5マイクロリットルの2x LQマスターミックス、2マイクロリットルのLQプライマープローブミックス、0.5マイクロリットルのLQ標準、および0.5マイクロリットルのLQ ROXを使用して、マイクロ遠心チューブに十分な量のLQマスターミックスを調製します。

8マイクロリットルのLQマスターミックスを光学式96ウェルプレートのウェルに加えます。別々のウェルに、ライブラリーの段階希釈液2マイクロリットル、LQポジティブコントロール2マイクロリットル、LQ希釈液2マイクロリットルを加え、ピペットで5回上下させて混合します。密封されたプレートをPCRシステムに挿入し、各サンプルにFAM検出器とVIC検出器の両方を割り当てます。

95°Cで5分間、95°Cで15秒間、続いて60°Cで1分間40サイクルのサイクル条件でPCR増幅を行います。次に、各サンプルの濃度を、プロトコルテキストに記載されているように計算します。ライブラリの定量化に続いて、各サンプルライブラリは測定された濃度に基づいて正規化され、シーケンシングのために1つのチューブにプールされます。

簡略化された解析モジュールを使用して、ライブラリの正規化とサンプルプーリングの計算を容易にします。ライブラリを正規化するには、まず、プールする一意のペアワイズインデックスを含むすべてのサンプルの濃度の中央値をナノモル単位で決定します。次に、すべてのサンプルの濃度の中央値を5を掛け、次に個々の濃度で割ることにより、プールする個々のサンプル量をマイクロリットル単位で決定します。

各サンプルの正規化された容量を1本の微量遠心チューブに追加して、サンプルプールを作成します。シーケンシング希釈液を使用して、サンプルプールを1.25ナノモルに希釈します。サンプルプールをPhix Control V3の存在下で変性することにより、シーケンシング用のサンプルプールを準備します。1.25ナノモルのサンプルプール15マイクロリットル、0.5ナノモルフィックス3マイクロリットル、および1N水酸化ナトリウム2マイクロリットルを組み合わせます。

短時間のボルテックスと遠心分離の後、室温で5分間インキュベートします。微量遠心チューブ内の992マイクロリットルの予冷HT1高バッファーに8マイクロリットルの変性ライブラリを追加します。変性希釈したライブラリ600マイクロリットルを試薬カートリッジの17番位置に加えます。

微量遠心チューブで、各シーケンシングプライマーの4マイクロリットルを636マイクロリットルのHT1高バッファーで別々に希釈します。600マイクロリットルの希釈したread-1シーケンシングプライマーをシーケンシング試薬カートリッジの18番の位置に加えます。600マイクロリットルの希釈インデックスリードプライマーを位置番号19に、600マイクロリットルの希釈リード2シーケンシングプライマーを位置番号20に

次世代シーケンシング装置に試薬をロードし、メーカーの指示に従ってペアエンドの2×150サイクルのシーケンシングを実行します。最後に、コンパニオンバイオインフォマティクスソフトウェアを使用してシーケンシングデータを解析します。ベンチトップシーケンサーを使用して、1回のNGSランで合計90のサンプルを処理できました。

示されているデータセットのサンプルには、細胞株、残存臨床形式および固定パラフィン包埋(FFPE)、および合成テンプレートDNAが含まれ、高深度のシーケンシングと均一なカバレッジが得られました。外れ値は、テンプレートコントロールなし、大きなコピー数増幅を伴う 1 つの細胞株 DNA の希釈シリーズ、および分析前の qPCR ベースの QC アッセイによって PCR 阻害のフラグが立てられた 1 つの FFPE DNA で構成されていました。46 種類のアンプリコンのカバレッジの均一性は、3 つの異なるオペレーターと異なる低品質の FFPE DNA サンプルを使用して維持されました。

FFPEでは、既知の5%BRAF V600E変異上に含まれる腫瘍DNAコントロール混合物は、400の増幅可能コピーの入力を使用して、3人のオペレーターによって平均5.2±1.3パーセントの標的BRAF変異を有することが報告されました。コピー数増幅による細胞株およびFFPE DNAサンプルの希釈は、EGFRおよびKRASの増幅に依存することが示されています。重要なことに、FFPE DNAインプットは、わずか50の増幅可能コピーまたは1.2ナノグラムのバルクDNAに減らすことができます。

既知の突然変異の検出を維持しながら、誤検知の呼び出しはありません。この手法を習得すると、適切に実行すれば、一度に24サンプルのバッチサイズで約3時間半のハンズオン時間で11時間で実行できます。