Name: レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぼう、レトロウイルス統合サイトのPCR増幅と次世代シーケンシングを用いたゲノムマッピング手法。HEK293T細胞を用いて、宿主ゲノム内のウイルス挙動を網羅的に解析する効率的なバイオインフォマティクス解析手法です。

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私たちは、エンゲルマンラボにおけるレトロウイルス組み込み部位の配列決定のためNGSプロトコルを確立することが重要であった助言のための私達の同僚スティーブン・ヒューズとヘンリー・レヴィンに感謝しています。この作品は、米国国立衛生研究所によってサポートされていましたAI039394とAI052014（ANE）とAI060354（エイズ研究のためのハーバード大学センター）を付与します。

著者らは開示するものは何もない。

ゲノムの分布パターンのマ​​ッピングを介して、最初のウイルス感染の段階からのレトロウイルス組込み部位の分析のためのプロトコルは、記載されています。このプロトコルは、任意のレトロウイルスと任意の感染可能細胞型にも適用可能です。さらに、アッセイパイプラインは、6.4×10 -5のMOIで開始感染のそれにゲノムDNAと同等の連続希釈液からのユニークな組込み部位の十分な数を回復する可能性のある、非常に敏感です。細胞の小部分のみが組み込まれたプロウイルスを保有します低ウイルス量を含有することができる感染患者からのサンプルに適用すると、この感度は、プロトコルは特に有用となります。この分野36,38,41-43における従来の方法論の論文と一致して、このプロトコルのバイオインフォマティクス部における複数のステップは、配列データの大きなファイルを処理するためにカスタマイズされたスクリプトの開発から利益を得るであろう。 BLAT 58ミリアンペアですがこのプロトコルで説明するユーティリティをpping、ユーザーが適切な代替であるとボウタイ67（http://bowtie-bio.s...

宿主細胞ゲノムへのウイルスDNA（vDNA）の統合は、レトロウイルスのライフサイクルに不可欠なステップです。統合を安定挿入プロウイルス1の確立につながる二つの異なる触媒プロセスを実行するウイルス酵素インテグラーゼ（IN）、によって達成されます。サブユニットにある多量2-4によって一緒に保持端vDNAと高次intasomeを形成し、逆転写により生成された線形vDNAの端部に係合します。切断する3&#39;-処理として知られているプロセスにおける配列の3 &#39;下流不変5&#39;-CA-3からvDNAの&#39;末端は、3 &#39;陥凹残す各vDNA末端5-8で反 ​​応性ヒドロキシル基で終わります。 intasomeは、その後、ホストの大規模アセンブリおよびプレインテグレーション複合体（PIC）9-11として知られているウイルスタンパク質の一部として核にインポートされます。細胞標的DNA（TDNA）が遭遇した後、INは3&#39;-ヒドロキシルグロvDNAを使用しています同時に千鳥状にTDNAトップとボトム鎖を切断するアップとは、鎖転移12,13の過程を経てTDNA 5 &#39;リン酸基にvDNAを結合します。 ローカルおよびグローバルなスケールでレトロウイルス展示組込み部位の好み。局所的には、コンセンサス組込み部位は、上流と下流のvDNA挿入部位14,15から約5〜10塩基対から及ぶ弱く保存されたパリンドロームTDNAの配列からなります。世界的に、レトロウイルスは特定のクロマチンの注釈16をターゲットにしています。イプシロン、レンチ、およびspumaを通じてアルファ - 7つの異なるレトロウイルス属があります。ガンマレトロが優先的に、転写開始部位（のTSS）とアクティブエンハンサー領域18-20に統合しながら、HIV-1を含むレンチウイルスは、積極的に転写される遺伝子17の本体内での統合を好みます。著しく対照的に、スプーマを強くheterochromに偏っていますこのような遺伝子に乏しいラミナ関連ドメイン21とATICの地域、。地元のTDNAの基本設定は、INとTDNA 13,22,23間の核の連絡先の特定のネットワークによって決定される大部分があります。レンチウイルス及びガンマレトロのために、ゲノムのアノテーションへの統合の相対は、INと同族の細胞因子24-27間の相互作用によって支配大部分です。因子の相互作用25-27,29-32は、それぞれ、ローカルおよびグローバルレベルでの統合を再ターゲットするための戦略を証明しているIN-ホストIN-TDNAの相互作用ネットワーク13,22,23,28の仕様を変更し、破壊し、またはリエンジニアリング。 レトロウイルスの組み込み部位をカタログするために使用するDNA配列決定手順のパワーは、過去数十年にわたって非常に増加しています。組込み部位は、研究33,34ごとにユニークなサイトのほんの一握りを得るために面倒な精製および手動クローニング技術を用いて、先駆的な仕事に回収しました。外因性の組織培養細胞の感染から回収サイトの数が数千17に数百に増加して、フィールドを形質転換したヒトおよびマウスのドラフトゲノムに個々の組込み部位をマッピングする機能を持つLTR-宿主DNA接合のLM-PCR増幅の組み合わせ、18。 NGSの方法論とLM-PCRのより最近の組み合わせは、ライブラリの深さ急騰を送信しました。 DNAのクラスタリングを使用することにより、配列決定ライブラリがユニークな配列19-21,39数百万を得ることができるしながら具体的には、パイロシーケンシングは、ユニークな組込み部位30,35-38数万のオーダーで得られました。ここでは、DNAのクラスタリングNGSを使用して、レトロウイルス組込み部位を増幅し、配列決定するための最適化されたLM-PCRプロトコルを記述します。この方法は、それによってsequenする前に、追加のアダプターライゲーション工程の必要性を排除し、直接増幅されたDNA分子に、したがって、PCRプライマーに必要なアダプター配列を組み込み、40を cing。 LTR-宿主DNA接合の生配列決定データの解析からのゲノムの機能を適切にする固有の組み込み部位のマッピングのバイオインフォマティクス解析パイプラインは、また、一般的に記載されています。この分野36,38,41-43における従来の方法論のプロトコルから確立された優先順位に応じて、カスタムスクリプトは、バイオインフォマティクスパイプライン内の特定のステップの完了を支援するために開発することができます。プロトコルの有用性および感度は、増幅することにより、代表的なデータで示さシーケンシング、および1.0の感染のおおよその多重度（MOI）、並びに、このDNAの滴定シリーズで感染組織培養細胞からのHIV-1組込み部位をマッピングしています6.4×10 -5のおおよそ同等のMOIを得15625：1の最大希釈の5倍ステップで非感染細胞DNAを介して希釈しました。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td>標準的な細胞培養培地、HEK293T細胞と互換性</td></tr>がある <tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH 30088.03</td><td>最適なウイルス産生のためには、異なるロットの血清を事前にスクリーニングする必要があるかもしれません</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>コーニング</td><td>30-002-Cl</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td>に添加する抗生物質 <td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>細胞の洗浄に使用</td></tr><tr><td>トリプシンEDTA</td><td>コーニング</td><td>25-053-CI</td><td>組織培養プレートから付着細胞を剥離するために使用</td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td>DNA トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>0.45 & マイクロ;m フィルター</td><td>Thermo Scientific</td><td>09-740-35B</td><td>ウイルス粒子含有細胞培養培地のろ過に使用</td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2239</td><td>ウイルスストックからのキャリーオーバープラスミドDNAの分解に使用</td></tr><tr><td>HIV-1 p24 抗原捕捉アッセイ</td><td>ABL Inc.</td><td>5447</td><td>ウイルス産生の収量を定量化するために使用されます</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &ティッシュキット</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>細胞からゲノムDNAを精製するために使用される</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Covaris</td><td>S2</td><td>このモデルのソニケーターでは、デューティサイクルの2ラウンド、5%、強度、3、バーストあたりのサイクル数、200、時間、80秒</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>GeneMate</td><td>G-3250-125</td><td>市販の水は、サンプルのクロスコンタミネーションの可能性を減らすために推奨</td></tr>されます <tr><td>QIAQuick PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>ライブラリ建設中にDNAを精製するために使用される</td></tr><tr><td>End-It DNAエンドリペアキット</td><td>エピセンター</td><td>ER81050</td><td>超音波処理されたDNAサンプルのDNA末端を修復するために使用されます</td></tr><tr><td>Klenowフラグメント(3'-5'エキソ&ndash;)</td><td>ニューイングランドバイオラボ(NEB)</td><td>M0212S</td><td>dATPからAテール修復DNAフラグメントdATPに使用</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>R0141</td><td>デオキシアデノシン三リン酸</td></tr><tr><td>MseI</td><td>NEB</td><td>R0525L</td><td>ゲノムDNA切断のための制限エンドヌクレアーゼ</td></tr><tr><td>BglII</td><td>NEB</td><td>R0144L</td><td>上流のHIV-1 U5配列T4 DNAリガーゼの増幅を抑制するための制限エンドヌクレアーゼ</td></tr><tr><td></td><td>NEB</td><td>M0202L/6218</td><td>適合DNA末端の共有結合用酵素</td></tr><tr><td>DNAオリゴヌクレオチド</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>カスタム</td>会社<td>にオリゴの精製を行っていただきます。HPLC精製はDNAに十分です<30ヌクレオチド;PAGEは、より長いDNAを精製します&nbsp;</td></tr><tr><td>アドバンテージ 2 ポリメラーゼミックス</td><td>Clontech</td><td>639202</td> PCR dNTPs(100 mM溶液<td>)用DNAポリメラーゼを含む市販のミックス</td></tr> <tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>R0181</td><td>氷上の4つの化学物質を滅菌水で希釈し、各dNTP</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td>DNA濃度</td></tr><tr><td>の測定用分光光度計Qubit Fluorimeter</td><td>Life Technologies</td><td>Qubit&reg; 3.0</td><td>統合部位ライブラリのDNA濃度を確認するための蛍光光度計</td></tr><tr><td>2200 TapeStation System</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>統合部位ライブラリのDNAサイズ分布を確認するためのテープベースのアッセイ</td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>NGSに使用</td></tr></tbody></table>

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムdnaのマッピング

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

両方のローカルおよびグローバルなスケールでレトロウイルスの展示署名統合好み。ここでは、（2）各ウィルスのゲノムの位置をマッピングする、ライゲーション媒介PCR（LM-PCR）増幅および次世代シークエンシング（NGS）を使用して、レトロウイルス組込み部位の多様なライブラリーの（1）の生成のための詳細なプロトコルを提供しますBEDToolsを用いて接合をホストし、そして（3）統計的関連性のためにデータを分析します。感染細胞から抽出したゲノムDNAを制限酵素で、または超音波処理による消化によって断片化されます。適切なDNA末端修復した後、二本鎖リンカーは、DNAの末端にライゲーションされ、半ネステッドPCRは、ウイルスの長い末端反復（LTR）の端部と連結させたリンカーDNAの両方に相補的なプライマーを用いて行われます。 PCRプライマーは、別々のアダプターライゲーションのための要件を否定、NGS中にDNAのクラスタリングに必要な配列を運びます。品質管理（QC）は、DNA断片のサイズ分布を評価し、適応させるために行われますNGSの前にDNAの取り込みを小胞体。シーケンス出力ファイルは、LTR-含む読み込みのためにフィルタリングされ、及びLTRおよびリンカーを定義するシーケンスが離れてトリミングされます。トリミングされた宿主細胞の配列は、BLATを用いて基準ゲノムにマッピングされ、参照ゲノムにおけるユニークな点に最小限97％の同一性のためにフィルタリングされます。ユニークな組み込み部位は、様々なゲノム機能に隣接するヌクレオチド（nt）の配列および分布の相対のために精査されています。このプロトコルを使用して、高い複雑性の組込み部位のライブラリーは、三日中のゲノムDNAから構築することができます。組込み部位の解析に影響を受けやすい組織培養細胞の外因性のウイルス感染を包含する全体の手順は、従って、約1〜2週間で行うことができます。この技術の最近のアプリケーションでは、HIV感染患者からの組込み部位の長手方向の分析に関連しています。

表4に、代表的な実験の結果は、感染細胞の培養物からの組込み部位を回収するためのNGSの感度を例証します。非感染細胞DNAが直列平均して各セル一積分40を含有する感染からのゲノムDNAを希釈するために利用されました。 15,625：希釈は1の最大希釈の5のステップで調製しました。滴定シリーズのゲノムDNAは、その後、超音波処理によって断片化または制限で消化することにより、LM-PCRに続いてのMseIおよびBglIIを、エンドヌクレアーゼました。固有の組み込み部位の数、ならびに選択されたゲノム注釈の近位にマッピングするサイトの数は、上記のプロトコルに従って計算しました。データ分析は、理論的には唯一の15625には、感染した細胞から調製したライブラリーから回収されたユニークな組込み部位の数十（ニートゲノムDNAから回収量の1〜2％）を明らかにしました。 </p&gt; 統合サイトのデータセットを分析するとき...

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

この手順の全体的な目的は、バルクゲノムDNAからレトロウイルスの組み込み部位をPCR増幅し、得られたDNAライブラリをシーケンシングすることで、正確な組み込み位置をリファレンスゲノムにマッピングすることです。この手法は、ホストゲノム全体における組み込み部位の分布を分析することにより、基礎的および臨床的なレトロウイルス学における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、DNAシーケンシングの深度が高く、また、1回のシーケンシングランで多くのサンプルをマルチプレックス化できる点にあります。トランスフェクションの前日に、補完したDulbecco's Modified Eagle's Medium 10 mLを用いて、5枚の100 mmディッシュにそれぞれ3.3×10⁶個のHEK293T細胞を播種します。翌日、市販のトランスフェクション試薬またはリン酸カルシウムを用いて、全長レトロウイルス分子クローンを保持するプラスミド 10 µg、またはエンベロープを欠損させたシングルラウンドベクター 9 µgとVSV-G発現コンストラクト 1 µgを細胞にトランスフェクションします。混合液を細胞培地に滴下して加えてください。トランスフェクション後、細胞を5%二酸化炭素を含む加湿細胞培養インキュベーター内にて37 °Cで培養します。約48時間後、メスピペットを用いてウイルスを含む細胞培養上清を回収し、0.45 µmフィルターで重力ろ過します。次に、4 °Cで1時間、200,000 Gsの超遠心分離にかけ、ウイルスを濃縮します。遠心分離後、DMEM FPSが約500 µL残るまで上清を除去し、ウイルスペレットを再懸濁させます。20 unitsのDNaseを添加し、37 °Cで1時間インキュベートします。製造元の指示に従い、HIV-1 p24抗原キャプチャーキットを用いてp24濃度を測定します。感染の前日に、6ウェルプレートの各ウェルに3.0 × 10⁵個のHEK293T細胞を2.5 mLのDMEM FPSで播種し、組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。新鮮なDMEM FPS 500 µLを用い、最終ウイルスp24濃度が500 ng/mLとなるように細胞を感染させます。組織培養インキュベーターで2時間インキュベートします。2時間後、37 °Cに予熱したDMEM FPSを各ウェルに2 mLずつ加え、プレートをインキュベーターに戻します。感染から48時間後、培地を除去し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。37 °Cに予熱したTrypsin-EDTAを0.5 mL加えて細胞を回収し、数秒後にウェル内を確認して細胞が剥離しているかを目視で検査します。次に、あらかじめ温めておいたDMEM FPSを2 mL加え、メスピペットで10回ゆっくりとピペッティングして細胞を再懸濁します。この溶液を、18 mLの温めたDMEM FPSが入った75 cm²の組織培養フラスコに移し、組織培養インキュベーターに戻します。感染から最低5日後、前述と同様の手順で細胞を回収し、ピペッティングにより5 mLの温めたDMEM FPSに再懸濁します。溶液を室温で2,500 Gsにて5分間遠心分離し、その後、上清を吸引して廃棄します。最後に、市販のキットを用いて細胞ペレットからゲノムDNAを抽出します。pH 8.5のミリモル濃度のTris-HCL 200 µLを用いて、提供されたイオン交換カラムからDNAを溶出させます。ゲノムDNAをソニケーションした後、PCR精製キットを用いてソニケーション後のDNAを精製します。次に、末端修復キットを用いてDNAを修復します。前述と同様にDNAを精製した後、Klenow Exo-Minus酵素を用いてDNAにA-tailを付加します。あるいは、制限酵素消化による断片化を行う場合は、5'TAオーバーハングを生成する酵素のカクテルと、上流のウイルスLTRの下流を切断するBglIIなどの不適合酵素を用いて、ゲノムDNAを消化します。10 µgのゲノムDNAを最終容量100 µLで消化し、37 °Cで一晩インキュベートします。最終的なDNAをPCR精製キットを用いて精製してください。ソニケーション処理したDNAに使用するリンカーは、互換性のあるT 3'オーバーハングを含んでいる必要があり、MseI消化DNAに使用するリンカーは、互換性のある5'TAオーバーハングを含んでいる必要があります。まず、35 µLのTris-HCL EDTAバッファー中で、10 µMの短鎖および長鎖リンカー鎖を混合し、90 °Cまで加熱した後、1分間に1 °Cの速度でゆっくりと室温まで冷却してアニーリングさせます。次に、1.5 µMのライゲーション済みリンカー、1 µgの断片化DNA、および800 unitsのT4 DNAリガーゼを含み、最終容量が50 µLとなるライゲーション反応を、ゲノムDNAサンプルあたり少なくとも4つのパラレルで準備します。12 °Cで一晩ライゲーションを行います。超音波処理で準備したサンプルの場合は、精製したライゲーション反応液を、アップストリームLTRの下流を切断する制限酵素で消化します。製造元の推奨条件に従い、適切な酵素を100 units使用して一晩反応させます。最終産物はPCR精製キットを用いて精製してください。ここに示す試薬を使用して、第1ラウンドのPCRを調製します。以下のパラメータで第1ラウンドのPCRを行います：94 °Cで2分間、続いて94 °Cで15秒、55 °Cで30秒、68 °Cで45秒のサイクルを30回繰り返します。最後に68 °Cで10分間処理します。第1ラウンドの反応液をプールし、前述の方法でDNAを精製します。次に、ここに示す試薬を用いて2回目のPCRの準備を行います。サイクル条件は1回目のPCRと同じものを使用してください。2回目の反応から得られたDNAをプールして精製した後、品質管理および次世代シーケンシングを行い、プロトコルの本文にある詳細な手順に従ってインテグレーションサイトを解析します。左図に示す制限酵素消化によるライブラリ、または右図に示す超音波処理によるライブラリから得られた組み込み部位を、web logoソフトウェアを用いてアライメントしました。図の上部の原液DNAから、下部の最大希釈倍率1/15,625まで、タイトレーションシリーズの各希釈段階が示されています。感染細胞DNAの希釈度が高くなるにつれて、確実性は低下します。この画像は、50,000箇所の固有のゲノム部位を用いたマッチングランダムコントロール（MRC）のシーケンスロゴを示しています。対照的に、MRCデータセットからアラインメントされたランダムな部位では、顕著な塩基嗜好性が認められなかったことに注目してください。習得すれば、ゲノムDNAからインテグレーションサイトライブラリーを3日間で調製することが可能です。したがって、初期感染からバイオインフォマティクス解析の完了まで、インテグレーションサイトのマッピングは約2週間で完了させることができます。この手順に従うことで、数千から数百万ものユニークなレトロウイルスインテグレーションサイトをカタログ化し、挿入部位とゲノムアノテーションの関連性を定量化するための多様な解析を行うことが可能です。

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