レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

この手順の全体的な目的は、バルクゲノムDNAからレトロウイルスの組み込み部位をPCR増幅し、得られたDNAライブラリをシーケンシングすることで、正確な組み込み位置をリファレンスゲノムにマッピングすることです。この手法は、ホストゲノム全体における組み込み部位の分布を分析することにより、基礎的および臨床的なレトロウイルス学における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、DNAシーケンシングの深度が高く、また、1回のシーケンシングランで多くのサンプルをマルチプレックス化できる点にあります。

トランスフェクションの前日に、補完したDulbecco's Modified Eagle's Medium 10 mLを用いて、5枚の100 mmディッシュにそれぞれ3.3×10⁶個のHEK293T細胞を播種します。翌日、市販のトランスフェクション試薬またはリン酸カルシウムを用いて、全長レトロウイルス分子クローンを保持するプラスミド 10 µg、またはエンベロープを欠損させたシングルラウンドベクター 9 µgとVSV-G発現コンストラクト 1 µgを細胞にトランスフェクションします。混合液を細胞培地に滴下して加えてください。

トランスフェクション後、細胞を5%二酸化炭素を含む加湿細胞培養インキュベーター内にて37 °Cで培養します。約48時間後、メスピペットを用いてウイルスを含む細胞培養上清を回収し、0.45 µmフィルターで重力ろ過します。次に、4 °Cで1時間、200,000 Gsの超遠心分離にかけ、ウイルスを濃縮します。

遠心分離後、DMEM FPSが約500 µL残るまで上清を除去し、ウイルスペレットを再懸濁させます。20 unitsのDNaseを添加し、37 °Cで1時間インキュベートします。製造元の指示に従い、HIV-1 p24抗原キャプチャーキットを用いてp24濃度を測定します。

感染の前日に、6ウェルプレートの各ウェルに3.0 × 10⁵個のHEK293T細胞を2.5 mLのDMEM FPSで播種し、組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。新鮮なDMEM FPS 500 µLを用い、最終ウイルスp24濃度が500 ng/mLとなるように細胞を感染させます。組織培養インキュベーターで2時間インキュベートします。

2時間後、37 °Cに予熱したDMEM FPSを各ウェルに2 mLずつ加え、プレートをインキュベーターに戻します。感染から48時間後、培地を除去し、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。37 °Cに予熱したTrypsin-EDTAを0.5 mL加えて細胞を回収し、数秒後にウェル内を確認して細胞が剥離しているかを目視で検査します。

次に、あらかじめ温めておいたDMEM FPSを2 mL加え、メスピペットで10回ゆっくりとピペッティングして細胞を再懸濁します。この溶液を、18 mLの温めたDMEM FPSが入った75 cm²の組織培養フラスコに移し、組織培養インキュベーターに戻します。感染から最低5日後、前述と同様の手順で細胞を回収し、ピペッティングにより5 mLの温めたDMEM FPSに再懸濁します。

溶液を室温で2,500 Gsにて5分間遠心分離し、その後、上清を吸引して廃棄します。最後に、市販のキットを用いて細胞ペレットからゲノムDNAを抽出します。pH 8.5のミリモル濃度のTris-HCL 200 µLを用いて、提供されたイオン交換カラムからDNAを溶出させます。

ゲノムDNAをソニケーションした後、PCR精製キットを用いてソニケーション後のDNAを精製します。次に、末端修復キットを用いてDNAを修復します。前述と同様にDNAを精製した後、Klenow Exo-Minus酵素を用いてDNAにA-tailを付加します。

あるいは、制限酵素消化による断片化を行う場合は、5'TAオーバーハングを生成する酵素のカクテルと、上流のウイルスLTRの下流を切断するBglIIなどの不適合酵素を用いて、ゲノムDNAを消化します。10 µgのゲノムDNAを最終容量100 µLで消化し、37 °Cで一晩インキュベートします。

最終的なDNAをPCR精製キットを用いて精製してください。ソニケーション処理したDNAに使用するリンカーは、互換性のあるT 3'オーバーハングを含んでいる必要があり、MseI消化DNAに使用するリンカーは、互換性のある5'TAオーバーハングを含んでいる必要があります。まず、35 µLのTris-HCL EDTAバッファー中で、10 µMの短鎖および長鎖リンカー鎖を混合し、90 °Cまで加熱した後、1分間に1 °Cの速度でゆっくりと室温まで冷却してアニーリングさせます。

次に、1.5 µMのライゲーション済みリンカー、1 µgの断片化DNA、および800 unitsのT4 DNAリガーゼを含み、最終容量が50 µLとなるライゲーション反応を、ゲノムDNAサンプルあたり少なくとも4つのパラレルで準備します。12 °Cで一晩ライゲーションを行います。超音波処理で準備したサンプルの場合は、精製したライゲーション反応液を、アップストリームLTRの下流を切断する制限酵素で消化します。

製造元の推奨条件に従い、適切な酵素を100 units使用して一晩反応させます。最終産物はPCR精製キットを用いて精製してください。ここに示す試薬を使用して、第1ラウンドのPCRを調製します。

以下のパラメータで第1ラウンドのPCRを行います：94 °Cで2分間、続いて94 °Cで15秒、55 °Cで30秒、68 °Cで45秒のサイクルを30回繰り返します。最後に68 °Cで10分間処理します。第1ラウンドの反応液をプールし、前述の方法でDNAを精製します。

次に、ここに示す試薬を用いて2回目のPCRの準備を行います。サイクル条件は1回目のPCRと同じものを使用してください。2回目の反応から得られたDNAをプールして精製した後、品質管理および次世代シーケンシングを行い、プロトコルの本文にある詳細な手順に従ってインテグレーションサイトを解析します。

左図に示す制限酵素消化によるライブラリ、または右図に示す超音波処理によるライブラリから得られた組み込み部位を、web logoソフトウェアを用いてアライメントしました。図の上部の原液DNAから、下部の最大希釈倍率1/15,625まで、タイトレーションシリーズの各希釈段階が示されています。感染細胞DNAの希釈度が高くなるにつれて、確実性は低下します。

この画像は、50,000箇所の固有のゲノム部位を用いたマッチングランダムコントロール（MRC）のシーケンスロゴを示しています。対照的に、MRCデータセットからアラインメントされたランダムな部位では、顕著な塩基嗜好性が認められなかったことに注目してください。習得すれば、ゲノムDNAからインテグレーションサイトライブラリーを3日間で調製することが可能です。

したがって、初期感染からバイオインフォマティクス解析の完了まで、インテグレーションサイトのマッピングは約2週間で完了させることができます。この手順に従うことで、数千から数百万ものユニークなレトロウイルスインテグレーションサイトをカタログ化し、挿入部位とゲノムアノテーションの関連性を定量化するための多様な解析を行うことが可能です。