レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング
2016年3月22日
感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。
この手順の全体的な目標は、バルクゲノムDNAからレトロウイルス統合部位をPCR増幅し、得られたDNAライブラリを配列決定して、正確な組み込み位置を参照ゲノムにマッピングできるようにすることです。この方法は、宿主ゲノム全体の統合部位の分布を解析することにより、基礎的および臨床的なレトロウイルス学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、DNAシーケンシングの深さと、1回のシーケンシングランで多くのサンプルをマルチプレックス化できるという事実です。
トランスフェクションの1日前に、5つの100mm皿のそれぞれに10ミリリットルのサプリメントを補充したダルベッコ修正イーグルス培地の10 HEK293T細胞の3.3倍から6番目の細胞にプレートします。翌日、市販のトランスフェクション試薬またはリン酸カルシウムを使用して、完全長レトロウイルス分子クローンを運ぶ10マイクログラムのプラスミド、または9マイクログラムのエンベロープ脱落シングルラウンドベクターと1マイクログラムのVSV-G発現コンストラクトで細胞をトランスフェクションします。混合物を細胞培地に滴下します。
トランスフェクション後、加湿細胞培養インキュベーターで細胞を摂氏37度でインキュベートし、5%の二酸化炭素でインキュベートします。約48時間後、メスピペットを使用してウイルス含有細胞培地を回収し、重力流で0.45ミクロンのフィルターに通します。次に、200, 000Gで4°Cで1時間超遠心分離することによりウイルスを濃縮する。
遠心分離後、約500マイクロリットルのDMEM FPSが残るまで上清を除去し、ウイルスペレットを再懸濁します。20ユニットのDNaseを加え、摂氏37度で1時間インキュベートします。製造元の指示に従って、HIV-1 p24抗原捕捉キットを使用してp24濃度を測定します。
感染前日、6ウェルプレートに1ウェルあたり2.5ミリリットルのDMEM FPSで5 HEK293T細胞の3.0倍〜10倍をプレートし、組織培養インキュベーターで一晩インキュベートします。500マイクロリットルの新鮮なDMEM FPSに500ナノグラム/ミリリットルの最終ウイルスp24濃度を細胞に感染させます。組織培養インキュベーターで2時間インキュベートします。
2時間後、37°Cに予熱したDMEM FPSを2ミリリットルずつ各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。感染から48時間後、培地を取り出し、2ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄します。摂氏37度に予熱した0.5ミリリットルのトリプシンEDTAを加えて細胞を収穫し、数秒後にウェルの細胞の脱落を目視検査します。
次に、予熱したDMEM FPSを2ミリリットル加え、メスピペットで10回ピペッティングして細胞を再懸濁します。溶液を18ミリリットルの予熱DMEM FPSを含む75平方センチメートルの組織培養フラスコに移し、組織培養インキュベーターに戻します。感染後最低5日後に、前と同じように細胞を回収し、ピペッティングにより予熱したDMEM FPSを5ミリリットルに再懸濁します。
溶液を室温で5分間2, 500Gで遠心分離し、次いで上清を吸引して廃棄する。最後に、市販のキットを使用して細胞ペレットからゲノムDNAを抽出します。付属のイオン交換カラムから、pH 8.5 の 200 μL ミリモル Tris-HCL で DNA を溶出します。
ゲノムDNAの超音波処理後、PCR精製キットを使用して超音波処理されたDNAを精製します。次に、末端修復キットを使用してDNAを修復します。DNAを前回と同様に精製した後、AはKlenow Exo-Minus酵素を用いてDNAを尾部に形成します。
あるいは、制限エンドヌクレアーゼ消化によるフラグメンテーションのためには、5'TAオーバーハングを生成する酵素のカクテルと、上流のウイルスLTRの下流で切断するBglIIなどの不適合酵素でゲノムDNAを切断します。10マイクログラムのゲノムDNAを100マイクロリットルの最終容量にカットします。摂氏37度で一晩インキュベートします。
最終的なDNAがPCR精製キットを使用してクリーンアップされていることを確認してください。超音波処理されたDNAと共に使用されるリンカーは、適合するT 3'オーバーハングを含まなければならず、一方、MseI消化されたDNAのためのリンカーは、適合する5'TAオーバーハングを含まなければならない。まず、35マイクロリットルのTris-HCL EDTAバッファーで、短鎖と長鎖の10マイクロモルをアニールし、摂氏90度に加熱し、1分間に摂氏1度刻みで室温までゆっくりと冷却します。
次に、1.5マイクロモルのライゲーションリンカー、1マイクログラムの断片化されたDNA、および800ユニットのT4 DNAリガーゼを含むゲノムDNAサンプルごとに、少なくとも4つの並行ライゲーション反応を調製し、最終容量は50マイクロリットルです。摂氏12度で一晩結紮します。超音波処理によって調製されたサンプルの場合、精製されたライゲーション反応を、上流のLTRから下流に切断する制限酵素で消化します。
適切な酵素を100単位、メーカー推奨条件下で一晩使用してください。最終製品がPCR精製キットを使用して精製されていることを確認してください。ここに示す試薬を使用して、最初のラウンドPCRを調製します。
次のパラメータを使用して最初のラウンドPCRを実行します:摂氏94度で2分間、続いて摂氏94度で15秒間、摂氏55度で30秒間、摂氏68度で45秒間のサイクルが続きます。摂氏68度で10分間終了します。最初のラウンド反応をプールし、以前と同様にDNAを精製します。
次に、ここに示されている試薬を含む2回目のPCRを準備します。最初のラウンドPCRと同じサイクリングパラメータを使用します。2回目の反応で得られたDNAをプールして精製した後、品質管理と次世代シーケンシングを行い、プロトコールの書面に記載されている詳細な指示書に従ってインテグレーション部位を解析します。
左図のように制限酵素による消化によって調製されたライブラリーからの組み込み部位、または右図のように超音波処理によって調製されたライブラリーからの組み込み部位を、Web ロゴソフトウェアを使用してアラインメントしました。滴定シリーズの各希釈は、図の上部にあるきれいなDNAから、下部の1〜15,625の最大希釈まで描かれています。確実性は、感染細胞DNAの希釈が増加すると減少します。
この画像は、50, 000のユニークなゲノム部位の一致したランダムコントロールの配列ロゴを示しています。対照的に、MRCデータセットから整列されたランダムなサイトは、かなりのレベルの基本選好を生成できなかったことに注意してください。一度習得すれば、統合サイトライブラリはゲノムDNAから3日で調製できます。
したがって、初期感染からバイオインフォマティクスの完了まで、統合サイトマッピングは約2週間で完了できます。この手順に従うと、数千または数百万のユニークなレトロウイルス統合部位をカタログ化し、挿入部位とゲノムアノテーション間の関連を定量化するための多様な分析を行うことができます。
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概要
このプロトコルは、感染細胞のゲノムDNAからレトロウイルスの統合部位を増幅し、シーケンシングとリファレンスゲノムへのマッピングを行うことを概説しています。また、BEDToolsを使用して統合部位の分布を定量化する技術も含まれています。
主要な研究要素
科学分野
- レトロウイルス学
- ゲノミクス
- バイオインフォマティクス
背景
- レトロウイルスの統合の理解は、基礎研究と臨床研究の両方にとって重要です。
- 統合部位のマッピングは、宿主ゲノム内でのウイルスの挙動を解明するのに役立ちます。
- 高いシーケンシング深度により、複数のサンプルの詳細な分析が可能になります。
- シーケンシング実行でサンプルをマルチプレックス化することで、効率性が向上します。
研究の目的
- ゲノムDNAからレトロウイルスの統合部位をPCRで増幅すること。
- 増幅されたDNAをシーケンシングし、リファレンスゲノムに正確にマッピングすること。
- 宿主ゲノムにおける統合部位の分布を分析すること。
使用した方法
- HEK293T細胞へのレトロウイルスプラスミドのトランスフェクション。
- PCRによる統合部位の増幅。
- 得られたDNAライブラリのシーケンシング。
- バイオインフォマティクスツールを用いたシーケンスのリファレンスゲノムへのマッピング。
主要な結果
- レトロウイルスの統合部位の成功的な増幅とシーケンシング。
- 統合位置のリファレンスゲノムへの正確なマッピング。
- 統合部位分布の定量分析。
- 宿主ゲノムにおけるレトロウイルスの挙動に関する洞察。
結論
- この方法は、レトロウイルスの統合を研究するための信頼性の高いアプローチを提供します。
- 宿主ゲノムとのウイルスの相互作用についての理解を深めます。
- このプロトコルは、様々なレトロウイルス研究に適応できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput mapping of retroviral integration sites using LM-PCR and next-generation sequencing enables precise characterization of virus-host genomic interactions. This capability is critical for de-risking gene therapy vectors, understanding insertional mutagenesis, and supporting translational research in retrovirology. The protocol's scalability and quantitative outputs position it as a foundational tool for early discovery and preclinical portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of retroviral integration patterns to clarify insertional preferences and genomic risk loci.
- Supports biological de-risking by mapping integration events at nucleotide resolution.
- Facilitates predictive confidence in vector safety and mechanistic understanding of host-virus interactions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated integration site libraries for downstream comparative analyses.
- Standardizes workflows for reproducible, quantitative mapping of integration events.
- Enables multiplexed sample processing, increasing throughput and assay scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns integration site data with genomic features relevant to disease models and biomarker discovery.
- Provides continuity from in vitro infection studies to preclinical vector safety assessments.
- Supports risk-adjusted advancement of gene-modified cell therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates from early discovery through preclinical research, supporting both mechanistic studies and translational safety assessments.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on integration site selection and host genomic impact.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative integration site data for comparative evaluation.
- Analytics: Provides high-complexity datasets for statistical analysis of insertional patterns and genomic feature associations.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical safety and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable workflow for diverse retroviral and gene therapy applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in vector safety and target validation.
- Operational Value: Standardizes integration site mapping for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for gene therapy and retroviral vector programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on integration site profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, NGS library preparation, and bioinformatics analysis.
- Needs access to high-throughput sequencing platforms and computational infrastructure for mapping and statistical analysis.
- Demands rigorous quality control for DNA fragmentation, linker ligation, and PCR amplification steps.
- Adaptable to different retroviral systems and restriction/sonication fragmentation strategies.
- Dependent on robust reference genomes and annotation databases for accurate site mapping.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:39
Generation of Retroviral Stock
2:20
Viral Infection of HEK293T Cells
4:30
Genomic DNA Fragmentation
5:33
Ligation of Linker Oligonucleotide to Fragmented Genomic DNA
6:58
Amplification of Viral LTR-host Genomic DNA Junctions by Semi-nested PCR
8:02
Results: Sequence Logos Depicting HIV-1 Base Preferences from Representative Experiment Libraries
8:52
Conclusion
