Name: 治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 学ぶ 密度勾配遠心分離による好中球単離法とリンパ腫細胞への治療薬感度への役割解析。2D・3D培養モデルを用いて免疫細胞とがん細胞の相互作用を研究する方法です。

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この作業は国立がん研究所（INCa-DGOS-4664）の支援を受けました。

初代白血病細胞1.好中球の単離と共培養注：手順は、すべての患者がインフォームドコンセントに署名リヨン病院倫理委員会の承認の下で行いました。 <ol><li> 初代白血病細胞と好中球の単離 <ol><li>慢性リンパ性白血病（CLL）と診断された患者からEDTA（血液1ミリリットル当たり1.8ミリグラムのEDTA）に末梢血のチューブを収集します。 </li><li>滅菌50mlチューブに血液の各15ミリリットルを追加し、15ミリリットルRPMI（希釈1：1）で希釈し、その後、慎重にゆっくりと相を混合することなく、チューブの底に密度勾配溶液15mlを加えます。密度勾配液を調製するためにRTであることを確認してください。 </li><li> RTでブレーキなしで35分間300×gで遠心分離します。血液は、 図1（a）に示すように 、4つの別個の相に分離底部へ戻るべきである：血小板および血漿、単核細胞（Wハイト環）、密度勾配溶液、顆粒球および赤血球。 </li><li>プラスチック製パスツールピペットと新しい50mlチューブへの転送と、一次白血病細胞を表す白いリングを収集します。 <ol><li> RTで10分間、300gで合計し、遠心分離機で50ミリリットルまでのPBS（カルシウムおよびマグネシウムを含有する）でチューブを埋めます。 </li><li> PBSは、その後、室温で10分間、300グラムのPBSを合計し、遠心分離機で最大50ミリリットルを追加5mlでペレットを再懸濁。 </li><li>完全RPMI培地でペレットを再懸濁（RPMI 1640、10％ウシ胎児血清（FBS）、2mMグルタミン、100 Uを補充/ mlのペニシリンおよび100mg / mlストレプトマイシン）細胞生存率カウンターを用いて計数します。 </li></ol></li><li>その後、合計で50ミリリットルに0.9％NaClupの3％デキストランを追加顆粒球および赤血球相を残して、上部相を吸引し、25ミリリットルまでのPBSを追加します。チューブを10回混合し、混合することなく、室温で30分間保管してください。 </li><li>上位RBC-乏しい好中球層ANを収集清潔な無菌50mlチューブ中に置き、室温で10分間、300gで管を遠心dは。 PBSは、その後、合計50 mlまでの赤血球溶解緩衝液を追加5mlで再懸濁し、各ペレット。 </li><li> RTで10分間、500gで遠心分離後、室温で15分間、暗所でチューブを保管してください。次いで、室温で10分間、500gで遠心分離する（合計で50ミリリットルまでのPBSを追加）PBSでペレットを洗ってください。 </li><li>細胞生存率カウンターを用いてカウントするための完全RPMI培地でペレットを再懸濁します。フローサイトメトリーを用いて、それらの単離の純度を決定するために、5mlの50μlのPBS-FBS（4％）にプラスチックチューブを、各細胞型の3×10 5を保ちます。 </li></ol></li><li> 単離された細胞集団の形態学的外観を分析 <ol><li>これを行うには、それぞれ3×10 4の好中球および150μlの完全RPMI培地中で3×10 4の単核細胞を再懸濁します。そのTを確実に、サイトスピン遠心分離機ガラススライド、フィルタカード、およびサンプルチャンバを組み立てます彼はよくバランスが取れて遠心します。 </li><li> RTで10分間、750×gで試料室とCYTO-遠心機に各細胞型を置き、遠心分離機からスライドし、フィルタカード、およびサンプル室を削除します。スライド上の細胞を損傷しないように、慎重に分解します。フィルタカードとサンプル室を捨てます。 </li><li>ギムザ染色キットを用いて細胞を染色し、乾燥さ1時間のスライドを保ちます。 100Xの倍率の顕微鏡で細胞を調べます。 </li></ol></li><li> FACSによって単離された細胞の純度をテスト <ol><li> APCに結 ​​合させた抗ヒトCD19抗体（5μL/ 10 6細胞）を用いて、単離された一次白血病細胞にラベルを付けます。 表1に記載されている抗ヒト抗体（5μL/ 10 6細胞）の混合物で精製した好中球にラベルを付けます。 4 O℃で30分間、暗所で細胞をインキュベート</li><li> 500μlのPBS-FBS（4％）、室温で5分間300グラムでチューブを遠心分離で細胞を洗浄。 </li><li>200μlのPBS-FBS（4％）の各ペレットを再懸濁。 </li><li> 、SSC-A（488 / 10BP）、FITC（BP 530/30）、PerCPを-のCy5.5（40分の695 BP FSC-A（488 nM）を：488 nmレーザー：以下の光学構成を使用して、フローサイトメーターで分析）、PE（BPを575/26）; 633 nmレーザー：APC（BPを660/20）、APC-Cy7の（BPを780/60）。色補正を確認してください。 </li></ol></li><li> 自家好中球との一次白血病細胞の共培養 <ol><li>シード一次白血病細胞の2×10 5細胞/ ml単独または完全RPMI培地中で比1:10での自己好中球です。これを行うには、細胞懸濁液を希釈して細胞数を調整し、2×10 6細胞/ mlの好中球への一次白血病細胞の2×10 5細胞/ mlを追加します。慎重に混ぜます。 </li><li>細胞にブルートンチロシンキナーゼ（Btk）阻害剤（ibrutinib）の25μMを追加します。 5％CO 2、37℃で24時間インキュベートします。 </li></ol></li><li> セルハーベストおよびFACS分析 <ol><li>コルECT FACS分析5mlのプラスチックチューブ中の細胞、室温で5分間、300gで管を遠心。 1mlのPBS-FBSでペレットを洗浄し（4％）、次いで、室温で5分間300gで遠心分離します。 </li><li>市販のキットを用いて、アネキシンVおよびPIでの再懸濁ペレットとRTで10分間、暗所で細胞をインキュベートします。 488nmレーザー：FSC-A（488 nM）を、SSC-A（488 / 10BP）、FITC（BPを530/30）、PI（610、図2Aおよび以下の光学構成のゲート戦略を使用して、フローサイトメーターで分析/ 20 BP）。色補正を確認してください。 </li></ol></li></ol>顆粒球経路と3DモデルでRLリンパ腫B細胞との共培養に沿ってHL60細胞の2分化<ol><li> 好中球様細胞にヒト前骨髄球性（HL60）細胞の分化 <ol><li> 3×10 5細胞/ mlにHL60細胞数を調整し、その後、それらの分化を誘導するために、1μMのレチノイン酸（RA）および1.25％DMSOを加えます。各3×10 5をシード</s48ウェルプレート中のウェルあたりHL60細胞は、5％CO 2、37℃で48時間インキュベート&gt;まで。 </li><li>その後、室温で5分間300グラムで細胞と遠心分離を収集します。細胞生存率カウンターを用いて計数する完全RPMI培地で細胞を再懸濁します。 </li><li>次いで、3×10 5細胞/ mlにHL60細胞数を調整し、1μMのレチノイン酸（RA）および1.25％DMSOを添加することによって再び分化を誘導するために、完全RPMI培地で細胞懸濁液を希釈します。ウェルあたり48ウェルプレートの各3×10 5個のHL60細胞を播種し、5％CO 2、37℃でさらに48時間インキュベートします。 </li></ol></li><li> HL60分化の解析（HL60 デフ ） <ol><li>細胞を収集し、室温で5分間300グラムでチューブを遠心します。細胞生存率カウンターを用いて計数する完全RPMI培地でペレットを再懸濁。 </li><li>フローサイトメトリーによる細胞表面マーカー発現の変化を分析します。各3×10 5を配置</suFACS分析のため（細胞培養物から）、P&gt;未分化のHL60細胞および5ml中3×10 5 HL60 差分細胞プラスチックチューブ、室温で5分間、300gで管を遠心。 </li><li> 50μlのPBS-FBS（4％）でペレットを再懸濁します。 AF700またはAPCに結 ​​合させた抗ヒトCD38（5μL/ 10 6細胞）に結合した抗ヒトのCD11bと細胞を標識。 4 O℃で30分間、暗所で細胞をインキュベート</li><li>その後、室温で5分間、300gで遠心分離（4％）、500μlのPBS-FBSで洗浄します。 200μlのPBS-FBS（4％）でペレットを再懸濁します。 </li><li> 488nmレーザー： 図3Aおよび以下の光学構成のゲート戦略を使用して、フローサイトメーター上で分析FSC-A（488 nM）を、SSC-A（488 / 10BP）。 633 nmレーザー：APC（660/20 BP）、アレクサフルオロ700（BPを730/45）。 </li><li> HL60 デフの形態変化をテストするには、顕微鏡検査のためのスライドガラス上に細胞を固定化します。 <ol><li>これを行うには、それぞれ3×10を再懸濁<su（細胞培養物から）のp&gt; 4未分化のHL60細胞および150μlの完全RPMI培地中で3×10 4 HL60 デフ 。遠心分離機はバランスが取れていることを確認して、サイ​​トスピン遠心分離機ガラススライド、フィルタカード、およびサンプルチャンバを組み立てます。 </li><li> RTで10分間、1,500rpmで試料室とCYTO-遠心機に各細胞型を置きます。遠心分離機からのスライド、フィルタカード、およびサンプル室を削除します。スライド上の細胞を損傷しないように、慎重に分解します。フィルタカードとサンプル室を捨てます。 </li><li>ギムザ染色キットを用いて細胞を染色し、乾燥さ1時間のスライドを保ちます。 100Xの倍率の顕微鏡で細胞を調べます。 </li></ol></li></ol></li><li> 3次元（3D）培養 注：この実験で用いた材料が冷えていることを確認し、実験が氷の上で行われています。 <ol><li>単独で、またはHL60 デフと混合のいずれかで、それぞれ5×10 4 RL細胞を再懸濁</em&gt;比RLで：HL60 デフ午前1時10分、2〜3mm程度に開口部を広げるために、滅菌はさみで切断し1ミリリットルピペットチップを使用して、300μlの基底膜マトリックスを持ちます。このステップの間に気泡を避けてください。 </li><li> 24ウェルプレート中の細胞懸濁液/各300μLをシード。このステップの間に気泡を避けてください。次いで、各ウェルについてRPMI培地を完了し、5％CO 2、37℃で7日間インキュベートML 1を追加、5％CO 2で37℃で30分間、プレートをインキュベートします。 2日毎に培地を変更します。 5日目に10 nMのビンクリスチンを追加します。 </li></ol></li><li> FACS分析 <ol><li> 7日間の培養後、培地を吸引し、二回1ミリリットルの氷冷PBSで各ウェルを洗浄します。氷冷PBS-EDTA（5ミリモル）の3ミリリットル/ウェルを追加します。 200μlのピペットチップの底を使用して、こすることによってウェルの底からゲルを外します。氷上で30分間静かにプレートを振ります。 </li><li>滅菌15ミリリットルチューブに細胞懸濁液を移し、ICを軽くチューブを振ります別の30分間の電子。均一な細胞懸濁液の外観を確認してください。 （それはケースではない場合には、長い時間のための細胞を振る以上のPBS-EDTAを追加します）。 </li><li> RTで10分間、300×gでチューブを遠心。その後、室温で10分間、300×gで遠心分離し、PBSでペレットを洗ってください。 </li><li> PBS-FBS（4％）で再懸濁し、PE-Cy7をし、APCに結 ​​合した抗ヒトCD38抗体（5μL/ 10 6細胞）を結合させた抗ヒトCD19抗体で標識します。 4 O℃で30分間、暗所でインキュベート</li><li> RTで5分間300gで、次いで遠心チューブ500μlのPBS-FBS（4％）で洗浄しました。市販のキットを使用してアネキシンVおよびPIで細胞を再懸濁します。 </li><li> 図4Aのゲート戦略を使用して、フローサイトメーター上で分析し、以下の光学構成：488 nmレーザー：FSC-A（488 nM）を、SSC-A（488 / 10BP）、FITC（530/30 BP）、PI（610 / 20 BP）、PE-Cy7の（780/60 BP）。 633 nmレーザー：APC（BPを660/20）。色補正を確認してください。 </li></ol></li&gt; 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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

また、分離回収され、密度勾配遠心分離法を用いて高純度のヒト血液から好中球の単離のために、同じ手順単核細胞内で、ここに有効な、簡単、迅速かつ安価なプロトコルを記載しています。単離された細胞集団は、≥90％純粋です。 いくつかの方法がヒトの血液から好中球の単離のために用意されています。これらは、不連続勾配11,12を使用して、または好中球は、免疫磁気かかるその後CD16-結合することによって濃縮された好中球の抗ヒトCD16のような特定の抗体で標識され、その間に正の免疫磁気選択により好中球を単離するための市販のキットを用いて同様の方法が挙げられます磁気カラム13に陽性細胞。負の免疫磁気選択を市販のキットは、全血または顆粒球懸濁液は、細胞の他の股関節に結合する抗体のカクテルで標識された時にもご利用いただけますnは好中球9（ すなわち、赤血球、血小板などCD2、CD3、CD9、CD19、CD36、CD56、グリコホリンAおよびデキストラン被覆磁性粒子のような望ましくない細胞を標識抗体複合体）、その後、好中球が...

自然免疫細胞は、腫瘍微小環境内の細胞の本質的な割合を構成し、患者や癌1の動物モデルにおいて腫瘍の悪性度と関連しています。最近では、より広く、慢性免疫応答は、化学療法2の腫瘍の進行、転移および抵抗の促進に重要な役割を果たしていることは理解となっています。マクロファージは、直接化学療法3,4に対する腫瘍細胞の応答を調節することが示されてきた重要な自然免疫細胞です。しかしながら、抗癌治療に対する腫瘍応答の調節に好中球、先天性免疫系において重要なプレーヤーの役割は、不明です。これらのプロトコルの目的は、CLL患者の血液サンプルからの好中球を分離し、抗リンパ腫剤に対するリンパ腫細胞の感受性の調節におけるそれらの役割を研究するために、顆粒球経路に沿ったHL60細胞を区別するために、高速かつ信頼できる方法を使用することです。 6の侵入に対する防御の第一線としての血液5と行為における自然免疫系の最も豊富な細胞成分です。好中球は、いくつかの病的状態7に可変エフェクター機能に加えて、効果的な自然免疫応答を上昇中で重要な役割を持っています。したがって、このような密度勾配分離法などの他の血液細胞から好中球を単離するための迅速かつ信頼できる方法は、in vitro試験のために必要とされます。好中球の単離のために、このメソッドを使用すると、インビボおよびex vivo での好中球媒介性の免疫機能に関するさらなる研究を促進します。 好中球の純粋な集団を得る能力は、免疫学的疾患8を有する患者の調査のための重要な第一歩です。密度勾配分離法は、細胞の高い収率が得られる理想的な技術です。メソジスト教徒dは休憩なしで35分間300gで遠心分離した希釈したヒト血液を含む管の底に密度勾配溶液を添加することを含みます。単核細胞のリングは、インターフェイスに表示され、好中球は、前者の下に常駐します。この方法は、はるかに9高価である好中球単離キットなど、他の利用可能な方法に対して大きな利点を持っています。また、ヒト好中球に特異的な表面マーカーに対する抗体を用いて市販のキットによって、ヒト血液から好中球を単離し、細胞の活性化または分化のリスクを高めます。密度勾配分離法は、短時間での好中球の単離を可能にします。同じステップ内では、単核細胞はまた、分離回収されています。これは、純粋な細胞の高い収率を機能的完全性を実現するために取得された基本的な技術です。 腫瘍microenvを模倣するために、ironment、3D実験を行いました。 in vitroでの好中球の半減期が短い考えると、新鮮なヒト好中球と3D実験は決定的なものではありません。このため、前骨髄球（HL60）細胞を、分化誘導剤、ジメチルスルホキシド（DMSO）及びレチノイン酸（RA）を使用して好中球様細胞に分化するように誘導されます。分化したHL60細胞（HL60 デフ）を使用すると、異なるドナーからの単離に起因する好中球の異なる応答を持つ防ぐことができます。 試験管 3D で培養モデルは、in vitroでの2Dモデル間およびin vivoモデル中間段階を表します。 2D培養では、細胞は、この合成表面に変性された堆積タンパク質への不自然な細胞の添付ファイルを形成するプラスチック表面に広がります。逆に、細胞を、それらが合成細胞外マトリックスからの3D培養フォーム天然細胞間添付の細胞は、それらが結合している天然物質です。この理由のために、特に癌細胞および他の細胞型との間の三次元共培養モデルは、腫瘍増殖、血管形成、および転移への寄与を示すために非常に有用でした。その結果、三次元培養は、細胞培養は、 インビボ 10 に存在する生理学的条件を模倣します。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBSにはカルシウムとマグネシウムが含まれています)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>14040-091</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチル-L-アラニル-L-グルタミン(L-グルタミン)</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン(ペン連鎖球菌</td>)<td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ブルトンチロシンキナーゼ(Btk)阻害剤(イブルチニブ)&nbsp;</td><td>クリニサイエンス</td><td>A3001</td><td></td></tr><tr><td>ヴィンクリスティン&nbsp;</td><td>EG labo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD マトリゲル基底膜マトリックス&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>実験日の前に 4 oC で一晩 (O/N) 置</td></tr>く <tr><td>赤血球溶解バッファー&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>フィコール(パンコール)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-60500</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Euromedex</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>付録 V-FLOUS 染色キット&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>11&nbsp;988&nbsp;549&nbsp;001</td><td></td></tr><tr><td>キット RAL 555 修正 Giemsa 染色キット</td><td>Cosmos Biomedical</td><td>CB361550-0000</td><td></td></tr><tr><td>LSRII フローサイトメトリー</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ DMR-XA 顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セロメーター オート T4 細胞生存率カウンター</td><td>Nexcelom&nbsp;バイオ サイエンス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

好中球は、最も豊富な(40%から75%)白血球の種類であり、炎症部位に向かって移動する最初の炎症細胞の一つです。彼らは自然免疫系の主要なプレーヤーであり、がん生物学において主要な役割を果たしています。好中球は、悪性形質転換、腫瘍進行、血管新生、および抗腫瘍免疫の調節の主要なメディエーターとして提案されています。可溶性因子の放出または腫瘍細胞との相互作用を通じて。好中球の特異的な機能を特徴付けるために、ヒトの血液から好中球をin vitroで単離するための迅速で信頼性の高い方法が切望されています。ここでは、血液中から好中球と単核球を分離するための密度勾配分離法が実証されています。この手順は、慢性リンパ性白血病(CLL)と診断された患者から得られた希釈血液の上にFicollなどの密度勾配溶液を慎重に重ね合わせ、続いて遠心分離、単核層の単離、デキストランによるRBCsbyからの好中球の分離、および残存赤血球の溶解を行うことで構成されます。この方法は、純度90≥好中球を単離することが示されています。腫瘍微小環境を模倣するために、マトリゲルなどの基底膜マトリックスを使用して3次元(3D)実験が行われました。in vitroでの好中球の半減期が短いため、新鮮なヒト好中球を用いた3D実験は実施できません。このため、前骨髄球HL60細胞は、分化誘導剤であるジメチルスルホキシド(DMSO)とレチノイン酸(RA)を使用して、顆粒球経路に沿って分化します。私たちの実験の目的は、抗リンパ腫薬に対するリンパ腫細胞の感受性に対する好中球の役割を研究することです。しかし、これらの方法は、好中球または好中球様細胞とさまざまな状況で幅広い細胞タイプとの相互作用を研究するために一般化することができます。

白いリングは、単核細胞を表し、血小板及び血漿：ここに記載の密度勾配分離法は、CLL患者の血液から単離した一次白血病細胞と非刺激好中球は、 図1Aは、上から下に（密度勾配遠心分離後に得られた異なる血液層を表し、提供します密度勾配溶液、顆粒球および赤血球）。 図1B及び1Cは、それぞれ好中球（マルチローブ核細胞）と単核細胞との間の形態学的外観の違いを示します。 図1Dの結果は、一次白血病細胞（単核細胞）の側方散乱（SSC）プロット対前方散乱（FSC）を表します。 APCに結 ​​合した抗ヒトCD19と、この集団のラベリングすることは一つだけで、ヒストグラム（ 図1E）の完全な右シフトを示していますこの集団は、CD19および純粋に陽性であることを示しているピーク。好中球は、純粋な％は、 表1</strong...

好中球は最も豊富な種類の白血球です。ここでは、密度勾配分離法によるヒト血液からの好中球の単離と、顆粒球経路に沿ったヒト前骨髄球(HL60)細胞の分化について説明します。抗リンパ腫薬に対するリンパ腫細胞の感受性に対するそれらの役割をテストするため。

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

これらの手順の全体的な目的は、密度勾配遠心分離法を用いてヒト血液サンプルから高純度の好中球を迅速に単離し、2Dおよび3D細胞培養モデルを用いて、リンパ腫細胞のがん治療に対する感受性における好中球の役割を調査することです。これらの手法は、好中球が媒介する腫瘍細胞応答ががん治療においてどのような役割を果たすかなど、自然免疫系とがんとの相互作用に関する重要な疑問への回答に役立ちます。密度勾配分離の主な利点は、細胞を機能変化を誘発する刺激にさらすことなく、短時間で純粋な免疫細胞集団を単離できることです。原発性白血病細胞および好中球を分離するために、まず、慢性リンパ性白血病患者のサンプルから得たEDTA処理血液15 millilitersを、個別の滅菌済み50 milliliterチューブに加えます。血液を15 millilitersのRPMIで希釈します。次に、層が混ざらないように注意しながら、室温の密度勾配溶液15 millilitersを血液の下に慎重にゆっくりと加えます。遠心分離によって細胞を分離させると、4つの異なる相が確認できます。上層から、血小板と血漿、単核細胞の白いリング、密度勾配溶液、そして最下層に顆粒球と赤血球が位置します。プラスチック製パスチャーピペットを用いて、まず白血病原細胞の白いリングを新しい50 milliliterチューブに回収します。カルシウムおよびマグネシウム含有PBSを用いて、細胞を最大50 millilitersで洗浄します。その後、ペレットを5 millilitersの新鮮なPBSに再懸濁します。次いで、さらに45 millilitersのPBSを細胞に加え、再度遠心分離して細胞を回収します。2回目の洗浄後、ペレットを完全RPMI培地で再懸濁します。そして、生存している原発性白血病細胞数をカウントします。次に、血小板血漿層と密度勾配層を除去し、顆粒球・赤血球相にPBS 25 milliliterと塩化ナトリウム含有デキストリン 25 millilitersを加えます。チューブを転倒混和で10回混ぜ合わせます。その後、室温で30分間静置し、細胞を沈降させます。平衡化後、上層の赤血球の少ない好中球層を滅菌済みの50 milliliterチューブに移し、遠心分離して細胞を回収します。ペレットを5 mLのPBSに再懸濁し、45 mLの赤血球溶解バッファーを用いて赤血球を溶解させます。室温・暗所で15分間静置した後、細胞を再度遠心分離して回収し、50 mLのPBSでペレットを洗浄します。洗浄後、細胞を完全RPMI培地に再懸濁し、生存好中球数をカウントします。両方の細胞群を、RPMI 50 µLあたり300,000個の濃度に希釈し、適切な数の5 mLファルコンチューブに分注します。遠心分離後、ペレットをFBS添加PBS 50 µLで再懸濁します。単離した細胞サブセットの純度を決定するため、一次白血病細胞のアリコートをAPC標識抗ヒトCD19抗体で、精製好中球のアリコートを表に記載された抗ヒト抗体混合液で、4 °Cの暗所にて30分間標識します。インキュベーションの終了後、FBS補充PBS 500 µLで細胞を洗浄し、新鮮なFBS PBS 200 µLでペレットを再懸濁します。次に、サンプルのカラー補正に注意しながら、フローサイトメトリーで細胞集団の純度を分析します。一次白血病細胞を自己好中球と共培養する場合、完全RPMI培地を用い、24ウェルプレートに白血病細胞単独または自己好中球との混合液を200,000 cells/mLの密度で播種してください。細胞を注意深く混合します。次に、37°C、5% CO2の条件下で、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤を用いて細胞を24時間処理します。翌日、細胞の一部を5 mLのプラスチック製ファルコチューブに回収します。次に、細胞を遠心分離して回収し、1 mLのFBS PBSでペレットを洗浄します。2回目の遠心分離後、製造元の指示に従い、Annexin Vおよびプロピジウムヨードで細胞を室温・暗所で10分間染色します。その後、図示したゲーティング戦略を用いて、フローサイトメトリーにより好中球および原発性白血病細胞を解析します。3D共培養を構築するために、滅菌済みの15 milliliterチューブに50,000個のRLリンパ腫B細胞単独、またはHL60分化細胞との混合液を加えます。サンプルを遠心分離し、先端を2～3 millimetersにカットした1 millimeterピペットチップを用いて、ペレットを300 microlitersの基底膜マトリックスに再懸濁します。次に、24ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を300 microlitersずつ分注し、37 degrees Celsius、5% CO2条件下で30分間インキュベートします。インキュベーションの終了後、各ウェルに完全RPMI培地を1 mL添加し、3D培養物をインキュベーターに戻してさらに7日間培養する。その間、2日ごとに培地交換を行う。5日目に、10 nMのincristineを培養物に添加する。1週間の培養後、培地を吸引し、各ウェルを氷冷PBS 1 mLで2回洗浄する。次に、各ウェルに氷冷したEDTA含有PBSを3 mL加え、200 µLピペットチップでウェルの底をスクレイピングしてゲルを剥離させます。プレートを氷上で30分間緩やかに振盪します。その後、細胞懸濁液を個別の滅菌済み15 mLチューブに移し、さらに氷上で30分間緩やかに振盪します。細胞懸濁液が均質であることを確認します。次に、細胞を遠心分離し、PBSで洗浄した後、FBSを含む新しいPBSでペレットを再懸濁します。最後に、先ほど実演したように適切な抗体と生存率染料で細胞をラベルし、図示したゲーティング戦略を用いてフローサイトメトリーによりRLおよびHL60分化細胞を解析します。フローサイトメトリーを用いて単離した細胞集団のすべてのイベントを解析したところ、この分離法により、CD19を発現する非常に純度の高い単一ピークの原代白血病細胞集団が得られることが示されました。また、白血球共通抗原であるCD45、および成熟好中球によって発現するCD15およびCD16抗原に陽性な、純度90%以上の好中球集団が得られました。好中球との共培養系から原代白血病細胞をゲーティングして解析した結果、原代白血病細胞単独の培養と比較して、生存している原代白血病細胞数が有意に多くなり、好中球がチロシンキナーゼ阻害剤であるibrutinibに対する細胞生存の保護効果を及ぼしていることが示されました。分化させたHL60細胞は、好中球よりも3D培養において安定しています。顆粒球への分化誘導後、これらの細胞は未分化のHL60細胞よりも小型になり、CD11BおよびCD38を高レベルで発現します。また、分化させたHL60細胞は分葉核を示します。これらの細胞はRL細胞に対して保護効果を示し、ビンクリスチン処理後の3D共培養における生存RL細胞数は、ビンクリスチン処理されたリンパ腫細胞単独培養と比較して有意に多くなりました。習得すれば、密度勾配遠心分離法は90分で完了させることができます。これらの手法の開発により、がん生物学分野の研究者が、前臨床モデルや患者サンプルを用いて、さまざまな白血球が腫瘍の悪性度に及ぼす影響を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、単核細胞と好中球を迅速かつ確実に単離する方法、好中球が抗がん剤に対する腫瘍細胞の反応を媒介する効果の解析方法、および3D共培養系の構築方法について深く理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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全血とバフィーコートからのヒト好中球の分離

このプロトコルは異なったシグナリング細道からの機能をカバーするスクリーニング方法として使用されるべき一組の好中球の機能試金を特色にする。プロトコルは好中球の細胞外トラップの細胞生存率、純度、活性酸素種の生産、実時間移動、食作用および予備の提案の初期および簡単な評価を含んでいる。...

好中球機能の概要を把握するための一連のスクリーニング技術

ここでは、磁気分離(ネガティブセレクション)と不連続密度勾配培地を使用して、全血から低密度および正常密度の好中球を分離するための信頼性の高いアプローチを提供します。高純度細胞(≥93%)を手つかずで分離し、健康や疾患における好中球亜集団の役割を理解するために重要な、好中球亜集団の正確な下流分析を促進します。...

全血からの低密度および正常密度好中球の単離と特性評価

低密度好中球の効率的な精製のための迅速な磁気マイクロビーズ法

学ぶ 密度勾配遠心分離による好中球単離法とリンパ腫細胞への治療薬感度への役割解析。2D・3D培養モデルを用いて免疫細胞とがん細胞の相互作用を研究する方法です。

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

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