Name: Marginating肺白血球の選択的ハーベスティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶマージネーティング肺白血球の選択的ハーベスティング法。ラットとマウスの肺毛細血管内皮に付着する白血球を灌流法で単離し、免疫機能と疾患感受性の研究に活用する。

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著者とこの作品は、NIH / NCI助成金＃（SBE）はR01CA172138によってサポートされていました。

動物を対象とする手順は、テルアビブ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 1.ラットプロトコル<ol><li>準備<ol><li> 2バタフライ21 G針を配置します。必要に応じて、針の鋭いエッジを提出することにより、2鈍いエッジの蝶21 G針を準備します。 </li><li>重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブにより滅菌はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、止血鉗子、歯組織鉗子：手術器具を滅菌します。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水（1×PBS）溶液1mlあたりヘパリン30単位を添加することにより、ヘパリン化PBS（30単位/ ml）を調製します。 RTで使用してください。 35ミリリットルは、動物ごとに必要な最小量です。 </li><li>気泡を回避するために、蠕動ポンプラインバタフライ針にヘパリン化PBSを流します。 </li></ol></li><li> MP-白血球の肺およびコレクションの灌流<ol><li> 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。呼吸停止を監視することによって安楽死を確認してください。 </li><li>呼吸が停止すると、すぐに滅菌はさみや歯組織鉗子を使用して、腹膜や胸の空洞を開きます。剣状突起に腹部に沿って正中腹部切開を行います。 </li><li>あらゆる臓器や大血管を穿刺することなく、慎重に両側の肋骨を切断、ピンセットを用いて胸骨を持ち上げます。胸骨上の止血剤をクランプし、吻側心肺複合体を露出させるために胸郭を折ります。 </li><li>心臓の右心室に翼状針を挿入し、約分以内（〜250グラムの動物から6ミリリットル）をシリンジに血液の最大量を収集します。 </li><li> （ 説明を参照）は、肝臓の後方灌流を回避するために、止血剤と大静脈をクランプします。 </li><li> Pの流出管に血液を含む注射器を交換しながら、右心室の中に蝶の針を保持しますeristalticポンプ。 </li><li>心室中隔の浸透を回避し、左心室に5ミリリットルの収穫シリンジに接続された第二の翼状針を挿入します。 </li><li>約5ミリリットル/分の速度で蠕動ポンプの電源を入れ、ゆっくりとシリンジに血液で汚染された灌流液の最初のミリリットルを集めます。灌流液の色が淡赤色暗からなるまで続けます。 （血液汚染perfusteを捨てます）。 </li><li>蠕動ポンプの停止することなく、速やかに20ミリリットル収穫シリンジで5ミリリットルの収穫シリンジを交換し、灌流の高速（最大7 ml /分）を用いた肺灌流液の20ミリリットルを集めます。真空形成を回避しながら継続的に、収集シリンジへの灌流液の流れを監視します。 </li><li>蠕動ポンプの流れを止めます。 </li></ol></li><li>白血球の抽出<ol><li> 400×gで10分間の灌流液を遠心。 </li><li>流体を吸引します。 </li><li>、10 mlのPBSまたは培地を追加し、10分間400×gで遠心分離し、液体を吸引除去します。二回、この手順を繰り返します。 PBSまたは培地の使用は、サンプルの結果としての用途に依存します。 </li><li> 10分間400×gで20ミリリットルPBSまたは培地、遠心分離機を追加し、流体を吸引。 </li><li>使用例（FACS、PCR、 等 ）に基づいて、所望の濃度に細胞を再構成します。 </li></ol></li></ol> 2.マウスプロトコル<ol><li>準備<ol><li> 2バタフライ25 G針を配置します。必要に応じて、針の鋭いエッジを提出することにより、2鈍いエッジの蝶25 Gの針を準備します。 </li><li>重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブにより滅菌はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、止血鉗子、歯組織鉗子：手術器具を滅菌します。 </li><li> 1×PBS溶液1ml当たりヘパリンの30ユニットを追加することにより、ヘパリン化PBS（30単位/ ml）を準備します。 RTで使用してください。 25ミリリットルは、動物ごとに必要な最小量です。 </li><li> STRE気泡を回避するために、蠕動ポンプラインバタフライ針にPBSをヘパリン化しています。 </li></ol></li><li> MP-白血球の肺およびコレクションの灌流<ol><li> 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。呼吸停止を監視することによって安楽死を確認してください。 </li><li>呼吸が停止すると、すぐに滅菌はさみや歯組織鉗子を使用して、腹膜や胸の空洞を開きます。剣状突起に腹部に沿って正中腹部切開を行います。 </li><li>あらゆる臓器や大血管を穿刺することなく、慎重に両側の肋骨を切断、ピンセットを用いて胸骨を持ち上げます。胸骨上の止血剤をクランプし、吻側心肺複合体を露出させるために胸郭を折ります。 </li><li> （説明を参照）は、肝臓の後方灌流を回避するために、止血剤と大静脈をクランプします。 </li><li>右ヴェンに蠕動ポンプの流出管に接続された翼状針を挿入心のtricle、および心臓の左心室、心室中隔のavoidingpenetrationに2ミリリットルの収穫シリンジに接続された第二の翼状針。 </li><li>約2ミリリットル/分の速度にポンプの電源をオンにし、灌流液は淡赤色暗からなるまで（血液汚染perfusteを捨てる）収穫シリンジに血液で汚染された灌流液の最初のミリリットルを集めます。 </li><li>蠕動ポンプの停止することなく、速やかに10ミリリットル収穫シリンジを用いて2ミリリットルの収穫シリンジを交換し、灌流の高速（最大4 ml /分）を用いた肺灌流の10ミリリットルを集めます。真空形成を回避しながら継続的に、収集シリンジへの灌流液の流れを監視します。 </li><li>蠕動ポンプの流れを止めます。 </li></ol></li><li>白血球の抽出<ol><li> 400×gで10分間の灌流液を遠心。 </li><li>流体を吸引します。 </li><li> 400で10 mlのPBSまたは培地、遠心分離機を追加10分間XG、および流体を吸引。この手順を3回繰り返します。 PBSまたは培地の使用は、サンプルの結果としての用途に依存します。 </li><li> 、10 mlのPBSまたは培地を追加し、10分間400×gで遠心分離し、液体を吸引除去します。 </li><li>使用例（FACS、PCR、 等 ）に基づいて、所望の濃度に細胞を再構成します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuebler, W. M., Goetz, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginated+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">The marginated pool.</a> Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).</li>
<li>Benish, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+mice+exhibits+increased+NK+cytotoxicity+and+unique+cellular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics.</a> Immunol Res. 58, 28-39 (2014).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
<li>Shakhar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+operation-induced+suppression+of+marginating+pulmonary+NK+activity+using+poly+IC%3A+a+potential+approach+to+reduce+postoperative+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis.</a> Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).</li>
<li>Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+tumor+immunosurveillance+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy.</a> Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).</li>
<li>Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NK+cells+in+tumour+growth+and+metastasis+in+beige+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice.</a> Nature. 284, 622-624 (1980).</li>
<li>Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine-activated+killer+cell+phenomenon.+Lysis+of+natural+killer-resistant+fresh+solid+tumor+cells+by+interleukin+2-activated+autologous+human+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes.</a> J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).</li>
<li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+pulmonary-NK+activity+and+resistance+to+experimental+tumor+metastasis%3A+suppression+by+surgery+and+the+prophylactic+use+of+a+beta-adrenergic+antagonist+and+a+prostaglandin+synthesis+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor.</a> Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).</li>
<li>O'Dea, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-marginated+monocytes+modulate+pulmonary+microvascular+injury+during+early+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia.</a> Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. Annual Meeting of the Psychoneuroimmunology Research Society, Philadelphia, USA.(2014, , (2014).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+stress+disrupts+immunostimulatory+effects+of+IL-12%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12).</a> Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本明細書に提示された方法は、MP-白血球のユニー​​クな人口の選択的ハーベスティングと勉強を可能にします。循環または脾臓の白血球に比べて、MP集団は、白血球の亜集団の別個の組成物は、より高い活性化レベル、種々のサイトカインのより高い放出、ならびにプロおよび抗炎症性サイトカイン2,3の高いmRNAレベルによって特徴づけられます。具体的には、MP-NK細胞は、様々な標的細胞3,4-に対して循環NK細胞よりも細胞傷害性であり、及びインターフェロンγのより高いレベルで発現することが示されています。全体として、我々の結果は、MP-NKの白血球が血液媒介転移および肺転移を制御する上でより大きな生物学的意義を意味するものであり、したがって、NK細胞を循環し、より高い細胞毒性を有することを示唆しています。したがって、脾臓または循環白血球が金本位制や免疫学的状態を反映するためのデフォルトの人口、およびヒトでの研究と考えるべきではないというコムmonlyは慎重に解釈されるべきである循環白血球のみに依存しています。また、様々な疾患は、特に肺を与えるように、免疫がこの器官内に研究されるべきであり、実際に私たちの灌流ア...

肺の毛細血管（ すなわち 、marginating肺（MP）白血球）1は、他の免疫の区画（ 例えば 、循環、脾臓、骨髄）からの白血球に比べて明確な白血球の組成とユニークな活性を示すことが示された、2-に付着した白血球4。例えば、循環および脾臓NK細胞、並びに分化したメッセンジャーRNA（mRNA）レベルおよびプロおよび抗炎症性サイトカインの分泌増加と比較して、種々の腫瘍細胞に対するMP-白血球展示高いナチュラルキラー（NK）細胞の細胞毒性。 MP-白血球は循環白血球（50％対それぞれ、30％）と比較して、先天性/適応免疫の高い比を有するように、細胞の組成物はまた、循環白血球から区別されます。本明細書に提示された方法の目標は、この重要かつユニークな免疫コンパートメント（細胞集団）を研究するために、およびelucに、MP-白血球の選択的ハーベスティングを可能にすることですこれらの特定の細胞上の各種操作（ 例えば 、免疫活性化）の影響をIDATE。 このユニークな集団の意義を理解するために、免疫系の細胞性免疫（CMI）のインビボでの機能を介して腫瘍細胞、微小転移、および残留疾患、循環制御することができることに留意することが重要です。この能力は、原発腫瘍を制御するために、免疫系の先行障害が発生しても明らかであり、かつ癌患者および動物モデル5 in vivoでの証拠で十分でサポートされています。重要なことには、これらの知見は、多くの場合、インビトロと矛盾しており、ほとんどの自己腫瘍細胞（細胞傷害性アッセイによって測定される）は、ヒトおよび動物から血液試料中の白血球を循環させることにより細胞毒性に抵抗性であることを報告エクスビボ研究6,7。この不一致は、前述のように異なる白血球集団のin vivoでの存在に起因し得ます前記MPの白血球集団、および活性化NK細胞3の特にその亜集団。実際に、循環および脾臓白血球に対して耐性であることが見出された同系腫瘍細胞（MADB106）は、MP-NK細胞3,8によって溶解されることが示されました。したがって、fischer344（F344）ラットの肺に転移容疑「NK抵抗性」MADB106細胞ではなく、循環または一般アクセスの容易さを与えられた研究された脾臓NK細胞によってMP-NK細胞により制御されます。 精製された、アクティブMP-白血球は肺組織の研削または生物学的分解9に基づいており、肺からの白血球の標準的な収穫方法、を介してアクセスできません。我々のアプローチは、組織処理の手法と比較して、2つの主要な利点を有します。まず、灌流アプローチは、選択的に肺実質、間質、および気管支肺胞比較例に由来する他の細胞からそれらを分離、MP-白血球を収穫しますtments。第二に、潅流技術は、より良い研削および生物学的処理が損傷細胞は、その形態を変化させることをアプローチとは異なり、完全性およびMP-白血球の生理的環境を維持し、生産および免疫活性を調節し、特にNKを抑制する様々な因子の放出を誘発します細胞毒性10。 肺は、癌転移のためにと、さまざまな感染症の主要な標的器官です。すべての循環悪性細胞と感染した細胞は、それらが変形し、毛細血管内皮細胞と常駐白血球と対話する必要が肺毛細血管を通過します。これらの条件下では、循環細胞は、容易に常駐MP-白血球によって標的化することができます。従って、この免疫コンパートメントに白血球を活性化しているように、生物学的に有利なようで、別の、生物学的実験、及び臨床現場では、このユニークなMP-人口を検討することが重要です。そのSYを注意する価値があります様々な生物学的応答調整剤によってstemic免疫活性化（ 例えば 、ポリイノシン-ポリシチジル酸（ポリI：C）またはC型CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CPG-C ODNは））より白血球3を循環させるよりもMP-白血球を活性化することが示されています、 8,11。

<table><tbody><tr><td>オートクルード蠕動ポンプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バタフライニードル</td><td>OMG</td><td></td><td>26G</td></tr><tr><td>バタフライニードル</td><td>OMG</td><td></td><td>21G*3/4インチ</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Pic 溶液</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Pic 溶液</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Pic 溶液</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ピック溶液</td><td></td><td>10ml</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ピック溶液</td><td></td><td>25ml</td></tr><tr><td>鈍い刃の鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr> は<tr><td>さみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>止血</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン ナトリウム ブタ粘膜 (保存剤フリー)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

marginating肺白血球の選択的ハーベスティング

Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes

辺縁肺(MP)白血球は、肺毛細血管の内側の内皮に付着する白血球です。MP白血球は、他の免疫区画の白血球と比較して、特異な組成および特性を示すことが示された。証拠は、ナチュラルキラー細胞のより高い細胞毒性、および循環免疫細胞または脾臓免疫細胞と比較して、MP白血球集団の明確な炎症誘発性および抗炎症性プロファイルを示唆しています。本明細書に提示する方法は、マウスまたはラットのいずれかにおける肺の強制灌流によるMP−白血球の選択的回収を可能にする。肺白血球を抽出するために使用される他の方法、例えば組織粉砕や生物学的分解とは対照的に、この方法は、実質細胞、間質細胞、および気管支肺胞細胞で汚染されていない肺毛細血管から白血球のみを生成します。さらに、灌流技術は、組織処理による生理学的反応を誘発することなく、MP白血球の完全性と生理学的環境をよりよく保存します。このユニークなMP白血球集団は、すべての循環悪性細胞と感染細胞が肺毛細血管を通過する間に保持され、内皮細胞や常在白血球と物理的に相互作用するため、異常な循環細胞を特定して反応するために戦略的に配置されています。したがって、MP白血球の選択的捕捉とさまざまな条件下での研究は、特に循環異常細胞と肺関連疾患の制御に関して、それらの生物学的および臨床的意義の理解を前進させる可能性があります。

MP-コンパートメント展示循環白血球に比べて異なる白血球サブセット組成物。フローサイトメトリー分析を用いて、白血球の亜集団が同定され、両方の循環及びMP白血球の組成を特徴付けるために定量化しました。顆粒球およびリンパ球は、前方および側方散乱体に基づいて同定しました。リンパ内、NKRP-1 明るい細胞は、NK細胞、単球のようなT細胞のようなCD3 +、RM1 +、及びCD4 + / CD8 + / CD25として同定された+ T細胞亜集団の同定のために使用しました。顆粒球、単球、およびNK細胞を含む先天性免疫は、血液循環（P &lt;0.05）27.9％（0.66±％）と比較して、MP-白血球集団の52％（±1.52％）を構成します。逆に、CD4 +、CD4 + CD8 + T細胞、および調節（CD4 + CD25 +）を含むT細胞亜...

Marginating-pulmonary leukocytesは、他の白血球集団と比較して、独特の特徴と明確な免疫学的機能を示します。ここでは、ラットとマウスの肺の強制灌流による、この肺白血球の亜集団の選択的採取について説明します。辺縁性肺白血球は、血液媒介性疾患および肺関連疾患に対する感受性を決定する上で重要であるようです。

Marginating肺白血球の選択的ハーベスティング

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit ...

この手順の全体的な目的は、マウスまたはラットの肺に強制灌流を行い、肺毛細血管の内皮に接着している辺縁化肺白血球を選択的に回収することです。この手法により、独自の特性と明確な血液学的機能を持つこの特定の白血球集団の研究が可能になります。本技法の主な利点は、実質、間質、および気管支肺胞区画からの細胞を除外し、肺毛細血管のみから白血球を回収できることです。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるLiat SorskiとLee Shaashuaが行います。手順を開始する前に、ペリスタルティックポンプのラインとバタフライ針にヘパリン含有PBSを流し、気泡を取り除いてください。その後、呼吸停止直後に、滅菌済みハサミと組織用ピンセットを用いて、安楽死させたラットの腹部正中線を剣状突起まで切開し、腹腔および胸腔を開きます。次に、ピンセットで胸骨を持ち上げ、肋骨の両側を慎重に切断します。胸骨に止血鉗子を固定し、肋骨を吻側へ折り曲げて心肺複合体を露出させます。その後、心臓の右心室にバタフライ針を刺入し、最大量の血液を採取します。すべての血液を回収した後、肝臓への逆灌流を防ぐため、止血鉗子で大静脈をクランプします。次に、右心室内のバタフライ針を保持したまま、血液が入ったシリンジをペリスタティックポンプの流出パイプに交換し、5 mLの回収用シリンジに接続した2本目のバタフライ針を左心室に挿入します。ここで、ペリスタティックポンプを約 5 mL/min の速度で回し、灌流液が濃赤色から淡赤色に変わるまで、灌流液で汚染された最初の数ミリリットルの血液を回収用シリンジにゆっくりと回収します。次に、ポンプを停止させることなく、5 mLの回収用シリンジを迅速に20 mLの回収用シリンジに交換し、7 mL/minの速度で20 mLの肺灌流液を回収して、ラットの辺縁化肺白血球を採取します。肺の色が淡い赤色から透明な白色へと徐々に変化していくことを確認してください。これは灌流が正常に行われたことを示しています。灌流液の全量を回収した後、ペリスタティックポンプの流れを停止させ、回収した灌流液をチューブに移します。次に、灌流液を遠心分離し、上清を吸引します。ペリスタルティックポンプのラインとバタフライ針にヘパリン添加PBSを流し、気泡を除去します。マウスの辺縁化肺白血球を回収するため、呼吸が停止した直後に、滅菌ハサミと組織用ピンセットを用いて、剣状突起まで正中腹部切開を行い、腹腔と胸腔を開きます。次に、鉗子を用いて胸骨を持ち上げ、肋骨を両側から切断します。胸骨に止血鉗子を固定し、肋骨を吻側へ折り曲げて心肺複合体を露出させます。肝臓への逆流灌流を防ぐため、大静脈を止血鉗子で遮断し、心臓の右心室にバタフライ針を挿入します。次に、バタフライ針を右心室に留めたまま、バタフライ針をペリスタルティックポンプの吐出管に接続し、2 mLの回収用シリンジを接続した2本目のバタフライ針を左心室に挿入します。ポンプを約2 mL/minの速度で稼働させます。灌流液が濃い赤色から淡い赤色に変わるまで、灌流液が混入した最初の1 mLの血液を回収用シリンジに緩やかに採取します。次に、ペリスタルティックポンプを停止させずに、2 mLの回収用シリンジを速やかに10 mLの回収用シリンジに交換し、灌流速度4 mL/minで肺灌流液を10 mL回収します。肺の色が淡い赤色から透明な白色へと徐々に変化することは、灌流が成功したことを示しています。肺灌流液をすべて回収したら、ペリスタルティックポンプの流れを停止させ、回収した灌流液をチューブに移します。次に、灌流液を遠心分離し、上清を吸引します。辺縁肺区画は、血中白血球に見られるものとは異なる白血球サブセット組成を示します。実際、顆粒球、単球、ナチュラルキラー細胞を含む自然免疫細胞が、辺縁肺白血球集団の50%以上を占めています。循環細胞分画の30%未満と比較して。対照的に、T細胞および樹状細胞集団は、循環細胞と比較して辺縁肺分画においてより低い割合で認められます。大型ナチュラルキラー細胞の割合は、全体的なナチュラルキラー細胞の総数に大きな差はないものの、循環細胞分画よりも辺縁肺分画で3倍高くなっています。さらに、少なくとも2つの異なる腫瘍細胞株を用いた標準的なクロム放出試験による測定の結果、辺縁肺区画由来のナチュラルキラー細胞の腫瘍細胞溶解能は、血中循環ナチュラルキラー細胞よりも高いことが示されています。加えて、MADB106を標的とした場合、Poly I:Cのin vivo投与による免疫刺激は、血中循環ナチュラルキラー細胞よりも辺縁肺ナチュラルキラー細胞の細胞傷害性に、より深刻な影響を及ぼします。この手法を習得し、適切に実施すれば、数分で完了させることができます。これらの手法により、MP白血球を選択的に回収することが可能になります。これらの白血球を研究することは、特に循環中の異常細胞の制御および肺関連疾患に関して、生物学的および臨床的な意義の理解を深めることにつながります。本手順の後、細胞はフローサイトメトリー、PCR、またはその他の任意の分析法によって特性評価および解析を行うことができます。このビデオを視聴することで、辺縁化肺白血球の回収方法について十分に理解することができます。

selective-harvesting-of-marginating-pulmonary-leukocytes

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