マウスの毛包披針形エンディングで機械的に刺激された求心性の出力および神経ターミナルラベリングの複合記録

柵末端の機械的刺激による求心性分泌を記録するためのシンプルで新しい技術が提示されています。これは、マウスの耳の皮膚の毛包を神経支配するものです。

この手順の全体的な目標は、アクセスが困難で機械的に敏感なニューロン端末で、ライブセルイメージングと電気生理学的記録を組み合わせる迅速かつ簡単な方法を実証することです。この方法は、メカノセンセーションにおける重要な疑問に対処するのに役立ちます。例えば、シナプス様小胞の役割や、完全分化型末端における候補メカノトランスデューサーチャネルの薬理学

この技術の主な利点は、非常にシンプルでありながら、生理学的調査のために完全に分化した端末に視覚的にアクセスできることです。この方法は毛包求心性に焦点を当てていますが、筋紡錘、メルケル感覚終末、圧受容器など、他の低閾値機械感覚システムへの洞察も提供できます。この技術の意味するところは、異常な血圧調節の治療を含む、機械的センサーを調節する新しい薬剤標的の開発にまで及びます。

若い成体マウスの首を切った後、頭部の背側を上にして、ガス化したLileyの溶液に、幅50センチメートルの底皿にステレオ解剖ミルコスコープの下に置きます。約10分ごとに、解剖領域をガスシランで十分にすすいでください。次に、スプリングボウハサミと3番の鉗子を使用して、耳介の基部で皮膚を慎重に切開して分離します。

外耳道の神経支配と軟骨を露出させます。下顎関節の裂け目の頭蓋骨から出現する三叉神経と大耳介神経の下顎分裂の枝を特定します。これらの2つの神経枝は、軟骨を介して突出し、耳介の皮膚の凹面と凸面を神経支配します。

次に、顎と乳様突起の間の木立で、三叉神経枝がどこから出るかを特定します。耳介を頭蓋骨からそっと引き離して、それらの長さを露出させます。このように露出したら、頭蓋骨のできるだけ近くで神経を切断します。

次に、スプリングボウハサミを使用して、頭から耳介を取り除きます。分裂した神経の遠位端を切ることを避け、密集した毛の量を最小限に抑えます。気体を含ませたLileyの溶液で満たされたシリコーンゴムで裏打ちされた皿に耳介を移します。

次に、外耳道を最も狭い点で分割して開きます。次に、凹面を下にして耳介を平らにし、その辺を縁に沿って等間隔の非常に細い昆虫ピンでピン留めします。次に、はさみを使用して鈍的解剖することにより、耳介と下線軟骨から露出した背側の皮膚を完全に除去します。

このステップでは、前面を傷つけないでください。次に、鉗子を使用して、細い昆虫ピンをつかみ、皮膚と外耳道軟骨の間に後方に現れる下顎分裂の切断枝を穏やかに伸ばします。これらの神経枝を可能な限り細いピンでプレートに固定します。

結合組織を突き刺し、神経の塊自体ではなく、それらの切り口に隣接します。神経枝の周りから周囲の結合組織のほとんどを取り除いて組織の準備を完了しますが、過度に引っ張ったり切断したりして神経を傷つけないでください。毛包の機械感覚終末を重要な染料または薬物で治療するために、皮下脂肪層の泡状の線維弾性軟骨を耳介縁の5ミリメートルに沿って慎重に剥がします。

したがって、四角い窓を開けて、毛包の真皮と基部を露出させます。若いマウスを使用すると、前部と後部の皮膚層の間の接着と、下にある軟骨の除去が困難になります。これらの両方が、染色が成功する可能性を高めます。

調製物を記録チャンバーのシリコンライニングベースに移すことによって。細い昆虫ピンを使用して、耳の端の周りに耳を固定し、耳の付け根のきれいな神経を2つの吸引電極の近くに置きます。1つは記録用で、もう1つは無関心な電極で、中性信号を差動アンプに供給します。

記録電極については、開口部の開口部と内径を、記録用に選択した神経の厚さに慎重に一致させます。完了すると、これは通常、一連の実験で一定になります。適度な長さの神経がぴったりと内側に収まる必要があります。

神経を電極に引き込むには、シリコンチューブを介して取り付けられた2ミリリットルの注射器から穏やかに吸引します。記録電極では、吸引中に細い昆虫ピンで神経を静かに引き抜き、再挿入することにより、神経がまっすぐで、折りたたまれたり二重になったりしていないことを確認します。次に、周囲の結合組織または柔らかくしなやかな脂肪組織を吸い込み、電極オリフィスに水密シールを形成します。

電極間のインピーダンスをバランスよく形成することは、高品質で親しみやすい記録に不可欠です。これに重要なのは、神経の周囲に高抵抗の水密シールを開発することです。次に、自発的な毛細管現象によってまだ満たされていない場合は、吸引によって無関心電極に生理食塩水を充填します。

次に、同一の銀色の記録ワイヤを記録電極と無関心電極の内部穴に配置します。もう一方の端では、ワイヤを2芯スクリーンケーブルの異なるコアに接続する必要があります。記録電極のワイヤーが生理食塩水に接触し、神経の近くにあることを確認しますが、シールを乱すことはありません。

無関心な電極の端にワイヤーを入れます。次に、銀-塩化銀ペレットである接地電極を浴に入れます。この電極を、記録電極に接続された2芯ケーブルのスクリーンに取り付けます。

オシロスコープで個々の信号を表示し、2つのチャンネルの電気的ノイズレベルが類似していることを確認します。記録電極の自発的な活動電位は、2つの電極のバランスがとれるまで見えない場合があります。バックグラウンドノイズの違いを補正するには、脂肪結合組織を電極にさらに吸い込み、1つのチャンネルのインピーダンスを増加させます。

電極の背景がバランスのとれたら、差動記録に切り替えて自発的な活動電位を探すか、火で磨かれたガラス棒で耳介の縁の毛をなでることによって活動電位を呼び出します。次に、コンピューターインターフェースを介して心電図を記録します。また、サウンドシステムを介してニューログラムを送り込み、ベースラインノイズのすぐ上でスパイクが聞こえるようにします。

この聴覚フィードバックリレーは、実験を行う際に非常に便利です。次に、手動で毛を刺激することにより、クリアされた領域の近くの毛包の神経支配が損なわれていないことを確認します。次に、脂肪がクリアされた窓のレベルで耳の皮膚の縁の1〜2ミリメートルを折りたたんで、下にある毛を露出させます。

対向する皮膚層の間に生理食塩水で満たされた隙間を残します。じっくりと耳を澄ましながら、折りたたまれた端に突き出た毛をガラス棒で優しく撫でます。肌に触れないでください。

必要に応じて、オシロスコープをチェックして出力を評価します。刺激誘発活動電位の制御された記録を作成するには、セラミック圧電アクチュエータに取り付けられたファイヤーポリッシュされた10cmのホウケイ酸微小電極ガラスの機械的プローブを使用します。プローブを皮膚のひだと平行に移動し、皮膚ではなく毛に触れるように配置します。

皮膚表面から約2分の1〜1ミリメートル上に置きます。次に、プローブが動いたときにオーディオ出力を聞いて、手動で刺激を確認します。次に、髪の毛の小さな領域の機械的刺激を駆動するようにソフトウェアを設定します。

たとえば、10 秒ごとに 5 ヘルツの正弦波で 3 秒間のシミュレーションをプログラムします。これには、200 から 2, 000 ミクロンのプローブ変位が必要です。次に、自動刺激を繰り返し使用して、神経に記録された応答の一貫性を確認します。

再現性のある結果は達成可能である必要があります。結果が一貫している場合は、リピート レートを 30 秒ごとに下げます。詳細な手順は、テキストプロトコルで提供されています。

機械感覚チャネルの特性を調査し、毛包の周りの機械感覚終末を標識するには、溶液に10マイクロモルのFM1-43を加え、60分間放置します。振動プローブで毛を刺激し続けます。この色素は、培養物および蝸牛有毛細胞の候補トランスデューサーチャネルおよび感覚ニューロンをブロックします。

ただし、成熟した毛包の求心性in situでの発火をブロックしません。エンディングのラベリングは、色素が曝露中に機械的刺激に応答し続ける末端に色素がアクセスすることを示しています。記載されたプロトコルを使用して作成された電気ニューログラムは、典型的には、最大サイズの活動電位を含む、手動刺激がない場合でも進行中の活動電位活動を示した。

自発的な活動は毎秒約10〜20回のスパイクで発生し、構造や緊張性の兆候は示されませんでした。刺激期間間の間隔の自己相関は常に非常に平坦でした。5ヘルツ、500ミクロンの毛幹への機械的刺激の間、全体の出力は通常、毎秒約50スパイクに上昇しました。

サイクルヒストグラムの構築により、応答の強い同調が明らかになり、正弦波サイクルごとに4〜10のスパイクが見られました。もちろん、これは非常に再現性があり、応答がロックされる波形の位相は、振動プローブが髪の毛に接触した場所とそのポイントでの移動方向に依存していました。その後、毛包、披針形、神経終末チャネルの薬理学を調査しました。

このチャネルは、FM1-43に曝露されても応答し続け、培養中の感覚ニューロンや生体内軟体細胞の感覚細胞など、一部の機械感覚チャネルをブロックする可能性があります。この技術を習得すると、電気ニューログラムの記録開始まで、60〜90分で完了します。この手順を試みている間、電極に高抵抗の電気的収縮を発生させ、卵胞の視覚化と組み合わせて小さなマウスを使用して色素の浸透と光学的透明度を向上させることが重要です。

この方法のアイデアは、親しい同僚で現在は退職している教授のクラーク・スレーターと彼の修士課程の学生であるナクル・ケインによって開発された方法から適応したもので、筋紡錘の機械感覚におけるシナプス様小胞の可能な役割と、FM1-43でそれらを視覚化するより良い方法の必要性について彼らに話しました。この手順に続いて、薬理学やバイタル色素の標識方法などを用いて、メカノトランスデューサーのチャネルや分化した末端はin situはどれか、機械的刺激がシナプス様小胞のリサイクルを調節して色素の取り込みと放出を調節できるかどうかなどの疑問に答えることができます。FM1-43はその毒性について評価されておらず、危険であるかのように扱うべきであることを忘れないでください。