Name: マウスの毛包披針形エンディングで機械的に刺激された求心性の出力および神経ターミナルラベリングの複合記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 学ぶマウス毛包の機械刺激応答記録法。神経終末の可視化と電気生理学的記録を組み合わせ、感覚受容メカニズムの研究に応用可能。この手法は薬理学的解析や新規治療標的開発に貢献する。

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この作業は、G.S.B.とR.W.B.に対する英国医学研究評議会のプロジェクト助成金G0601253によって部分的に資金提供されました。

マウスの死後の組織の収穫が承認された倫理的な方法を使用する必要があります。英国では、頸椎脱臼は、成体マウス（英国動物の上場スケジュール1の方法（科学的手続）法、1986年から欧州指令63分の2010 / EU）のための政府承認された方法です。この法律は、以下のプロトコルで使用されるすべての手順を検討し、承認された動物福祉と倫理審査委員会によって、アバディーン大学で局所的に適用されます。 注：これらの方法は、銀行らに報告された研究で使用した7。 電気生理学1.準備耳<ol><li>解剖前に、このようなLileyの（1956）などの標準的な生理食塩水を調製し、90％O 2/5％CO 2でそれを飽和。 NaHCO 3（12）のKCl（4）、KH 2 PO 4（1）、塩化ナトリウム（138.8）のMgCl 2（1） の CaCl 2（2）及びグルコース：Lileyの生理食塩水（MM）が構成され（11）。 </li><li>人道的に耳の近くに頭蓋骨を損傷することなく、成体マウスを安楽死させます。ここでは、C57 / Bl6JとMF1マウスを使用していますが、任意の標準的な実験用マウス系統を使用することができます。理想的には、電気的記録が大きく、マウスにおける標識は信頼性が低いとして、スチリル色素標識と組み合わせることである場合は、&lt;25グラムであるマウスを使用し、多くの場合にのみ限定さ外接地域で発見されています。 </li><li>大きなはさみや骨ハサミで頭を削除します。 </li><li>ステレオ解剖顕微鏡のステージ上で（50センチメートルが通常便利である）は、広い底解剖皿に毒ガスLileyの中で頭の背側を上に置きます。定期的に（〜10分）水門や毒ガス生理食塩水で頭を沈めます。 </li><li>慎重外耳道（EAM）の軟骨を露出させ、springbowはさみと＃3鉗子で外耳（耳介）の付け根に皮膚を切開し、分離します。彼らはFをemergeとして三叉神経の枝（下顎部門、MDV）と大きな耳介神経を特定ROM軟骨ベースを介して、顎関節やプロジェクトの裂け目で頭蓋骨はそれぞれ、凹（前方）と凸（後部）耳介皮膚の側面を支配します。 </li><li>頭蓋骨の近く、どこ顎および乳様突起のプロセス間の溝内の2つの神経枝出口を識別します。静かに頭蓋骨から耳介を引いて、その長さを最大化し、可能な限り頭蓋骨に近い神経を切断します。 </li><li>分割された神経の遠位断端を避けるように注意しながら、除去される耳の付け根に密な毛の量を最小限に抑え、springbowはさみで頭から耳介を削除します。 </li><li>柔軟なシリコーンゴム（PDMS）毒ガスLileyの流体で満たさ-lined皿に耳介を転送します。最も狭い（最前方）の時点でそれを分割してEAMを開きます。 〜6-8との縁で慎重にPDMSに耳介、前方皮膚（凹）ダウンサイドピンを平らにし、定期的に（〜0.2ミリメートルの直径）昆虫ピン非常に微細な間隔を置いて配置。 </li><li>レム耳介の後面の皮オベ完全および部分的に＃3鉗子で鈍的切開により耳介軟骨を除去し、前方の皮膚がそのまま残されている保証します。 </li><li>細かい虫ピンの点で軽く肌とEAM軟骨の間に後方に現れるMDVの枝（通常は2）を拡張、＃3鉗子で把持。その切断端ではなく、神経幹自身に隣接する結合組織を突き刺す、可能な限り微細昆虫ピンでPDMSにこれらをピン。 </li><li>慎重に引っ張っ過剰または切断による損傷を避けること、彼らの周りの周囲の結合組織の大部分を削除してください。 </li></ol> 2.電気生理学的記録の設定<ol><li>に（記録のために一から二の吸引電極に近い耳の付け根で洗浄神経を配置し、（〜耳あたり6-8）エッジの周りに細かい虫ピンで記録チャンバーのPDMS-並ぶベースに耳介皮膚をピン神経を取る）とOT彼女の不関電極（7を参照して 、差動増幅器にニュートラル信号を提供します）。 </li><li>記録電極の場合は、慎重に絞りと2神経の合計の厚さへの開口部の内径に一致するので、可能な限り、できるだけ大きい長さとしてぴったりとフィット。 </li><li>シリコーンゴム管と他の端部に取り付けられた2ミリリットルの注射器から穏やかな吸引によって電極に神経を描画します。折り畳まれたまたはダブルアップしていない、神経がまっすぐであることを確認してください。 </li><li>しっかりと神経の周りの開口部を封止するプラグを形成するために、結合組織や脂肪組織を描画するために強力な吸引力を利用して高電気抵抗/インピーダンスフィットを開発します。 </li><li> （それは毛管作用によって充填することができる）、必要に応じて吸引することにより、生理食塩水と他の（無関心）電極を埋めます。 </li><li>生理食塩水と神経に接触するように記録電極の内部ボア内に同一の記録ワイヤー（銀や白金）を配置電極の（記録）または狭め、火災研磨終了（無関心）。各電極は、2芯シールドケーブルの異なるコアに個別にはんだ付けされています。浴中に浴（アース）電極（銀/塩化銀ペレット）を配置し、記録電極に接続された2つのコアケーブルの画面に、それを接地してください。 </li><li>オシロスコープの画面上の差動アンプ、フィルタ（バンド渡さ0.2-2 kHzの）、およびビューの別々のチャンネルに二つの電極からの電気的活動をフィード。電気ノイズレベルが似ているチャネルA（記録）とチャネルB（無関心）を確認してください。この段階では、2つの電極がバランスする前に、チャネルAにおける通常の自発的活動電位を見ることができない場合があります。 </li><li>記録（チャネルA）または無関心（チャネルB）電極のインピーダンスを増加させることにより、電極間のバックグラウンドノイズの違いを是正。いずれかの電極へのさらなる乳輪（脂肪）結合組織を吸引することでこれを行い、および/または50 mlシリンジに大きな吸引力を加えます。 <ol><li>このように「バランスのとれた」後は、（AB）記録を微分し、トレースに、またはとき耳介の縁に毛をなでる自発的な活動電位（APS）を探しに切り替えます。通常より厳しい（高抵抗）シール及び2におけるより平等インピーダンス - アクティビティ（スパイク）が見られない場合は、記録電極における神経のタイトなフィット感と不関電極で疎性結合組織を再確認電極、より良いです。信号：ノイズ比：練習では​​、これは良い品質の（1&gt; 2）を実現します。 </li></ol></li><li>コンピュータ上で実行されているラボインターフェースと電気生理学ソフトウェアを介しelectroneurogramを記録します。スパイクのオーディオ出力は、非常に有用であり、オーディオアンプと関連オーディオスピーカーを通して神経像を供給することによって達成することができます。ちょうど白-nが存在しないことによって特定されたベースラインノイズ（上になるように閾値を調整オワーズ）「ヒス」。 </li><li>披針形の語尾に薬物または蛍光スチリル色素のアクセスを向上させるために、慎重に卵胞の真皮とベースをさらすのx 5ミリメートル（ 図1A、B〜5mmの窓を開け、耳介マージンの近くに皮下脂肪層をはがします）。 </li><li> （該当する場合は、単に生産窓のレベルで）並置スキン層の間に明確な生理食塩水で満たされたギャップを残して、前余白で脂肪クリア耳皮膚の〜1ミリメートルの折り目を背面端子です。ゆっくりストローク毛がオシロスコープで最大AP出力の領域を見つけるために、皮膚に触れることなく、ピンまたは接地された微細な鉗子で折られた縁部に沿って突出して独特の「クリック」し、オーディオ出力に「ポップ」。 </li></ol> 3.録音刺激誘発活動電位<ol><li>位置機械的刺激プローブ - セラミに取り付けられた火造り10cmのホウケイ酸微小電極ガラスCの圧電アクチュエータは、 - そのように動きが皮膚のひだに平行です。それは毛ではなく、肌に触れるので、皮膚のひだから先端約0.5〜1ミリメートルを置きます。ゆっくりとスパイクを聞く/毛を偏向し、観察するために、手動でプローブ先端を移動させることにより、効果的な刺激を確認します。 </li><li> 1-3毛の機械的な刺激駆動するためのソフトウェアを使用します（5 Hzの正弦波で例えば 3秒、10秒毎に。変位200-500ミクロンの探査）、および神経における刺激誘発応答を記録。 </li><li> 10秒間隔で複数の同一の機械的刺激列を与えます。その後、（ 例えば、30秒に10秒からリピート率を落とす）実験プロトコルに従って、刺激の頻度を減らす、再現するためのプローブの位置を最適化します。 </li><li>高周波ノイズの振幅と最大APの〜25％〜2倍に設定し、単純なしきい値を使用して、 例えば AP-様活性を区別するためにソフトウェアを使用してください。 </li><li>しきい値を超えるAPをカウント生産APの頻度や特性を定量化する「イベント」、。 </li></ol> 4.録音刺激誘発N-（3-triethylammoniumpropyl）-4-（4-（ジブチルアミノ）スチリル）と組み合わせることで焼成ピリジブロマイドラベリング<ol><li>刺激誘発求心性発射と末端標識上のスチリル色素の影響を調べるために、入浴液に、選択肢のスチリル色素の適切な濃度を追加し、電気的記録を続行します。 </li><li>必要な露光時間（通常は少なくとも30分）した後、卵胞を表示するための準備を準備します。保持ピンを除去することにより、皮膚弁を展開し、末端標識を明らかにクリア真皮領域を露出させます。 </li><li>生理食塩水の3完全な変更を行う、無染料の生理食塩水で外部染料を洗い流します。 </li><li>最も永続的な色素汚染が露出/外部膜から浸出することを可能にするために10〜15分間毒ガス無染料の生理食塩水の最終的な変更でインキュベートします。 </li><li>金属イオン封鎖剤（スルホブチルβ-シクロデキストリン、1 mMの、5分）、生理食塩水のある膜上に残りの非内在化色素を除去。 </li><li>直立落射蛍光顕微鏡のステージに記録チャンバーを転送し、ステージ/スライド移動機構を備えたチャンバに係合します。 </li><li>スチリル色素の励起光の適切なと準備を照らします。卵胞標識（ 図1）を観察するために10Xや25X蛍光顕微鏡の対物レンズを使用してください。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここで、我々は急速に解剖することができ、比較的簡単な準備を開発した、低毛包の密度を有しており、毛包の少数の比較的選択機械的刺激を可能にします。これは、機械的に刺激し、毛包、定義された電気生理学的応答を持つ、すなわちイメージング包を可視化するアプリケーションを染色するための応答を含む電気生理学的記録および生細胞蛍光イメージングのために容易にアクセス可能です。我々が行っていないが、このシステムは、単一のユニットのための感覚神経（単一感覚軸索）記録および形態を終了感覚の端末を可視化するための標的とGFP-式を用いて細分に容易に適しているようです。 私たちは、内在化および蛍光膜スチリルpridinium染料7のリリースの特性を調査するためにローカライズされたvesicを研究するために独自に開発した技術を耳の皮膚の準備を使用していましたシナプス終末8におけるル膜のリサイクル。シナプスでは、イメージングも容易に識別端子8,9における応答の同時電気生理学的記録と組み合わされます。それは我々が最初に述べた染料はまた、機械刺激終末10によって内在化されたこれらの初期の研究でした。文化および蝸牛の有毛細胞における感覚ニューロンの場合は、スチリルピリジニウム色素によって標識化の多くは、彼らはその後、11,12をブロックする機械刺激チャネルを通過する色素を含んでいるようです。染料は、その後、細胞内膜にラベルを付け、この標識は不可逆的です。しかし、ではない有毛細胞に機械的に13,14を刺激し、そのようなIaの終末としてその場で完全に分化した一次感覚神経終末における筋紡錘で15、ここで7披針形の語尾に、スチリル色素標識は、膜のエンドサイトーシスを反映しているようです標識は可逆的であり、機械刺激解像度をブロックしないので、ponses 7,15,16。これらの終末におけるチャネル透過による一部の染料内在化を完全に排除できないが、 その場で差別端末での標識の大部分はリサイクル小胞に内在化によるものであることを染料インキュベーションの間継続焼成およびラベリングの可逆性から明らかです膜。したがって、この単純な手法は、容易にエクスビボ組織における機械刺激端末機能の範囲の複合電気的および光学的監視のために使用されます。 最も実用的な技術と同様に、再現性が反復と練習が必要になります。特に注目に値する重要なポイントのいくつかを説明します。解剖と記録セッションを通して、準備が常に完全に95％O 2/5％CO 2で飽和食塩水で灌流さを保証することによって、組織の生存率と生存率を最大化します。毛包がこのプロセスの間に変位されていないことを確認し、WHICHは、感覚終了発射を刺激します。いずれかの準備からの距離で罰金チューブ付き器官槽を通して連続、層流灌流システム、または慎重にバブルガスを使用するか、慎重にすべての回で生理食塩水の表面の下準備を保​​ち、ソリューションごとに20-30分を更新します。吸引記録電極は、通常、細胞内記録用の鋭い電極ホウケイ酸ピペットを変更することによって作製されます。まず、慎重に（2.4および2.5を参​​照）ブンゼンバーナーの炎に非常に短い（&lt;1秒）の暴露によって神経や火ポリッシュに合わせて適切な内径を与えるために＃3鉗子で鋭い先端を断ちます。記録良好な信号対雑音比を得るために、これら2つの電極における電気インピーダンス（抵抗）が最大と同等の両方であることが必須です。二つの電極に、以下に注意を払ってこれを行います。記録電極の場合、内径は、神経のためにぴったりとフィットし、NEの最大の長さであることを確認RVEは、記録電極に引き込まれます。効果的に電極チップを封止するために神経を周囲の結合組織を使用してみてください。あるいは、またはさらに、神経と一緒に脂肪組織の適切な大きさ、テーパーピースの狭い方の端を描画します。その後、チューブに取り付けられた50ミリリットルの注射器で約1分間の強力な吸引を適用することによって、電極先端を差し込みます。しっかりと密封されて先端部については、強力な吸引を適用することは、単にプラグインの有効性を強化し、より多くの液体または神経に描画されません。神経損傷を避けるために、しかし、結合組織が周囲の材料とEAM軟骨に圧縮から神経を緩衝されていることを確認。不関電極はできるだけ記録電極の抵抗/インピーダンスを模倣する必要があります。これは慎重に火研磨実際にそれを封止することなく、可能な限り小さな開口部に先端をすることによって助けられます。さらに抵抗が必要な場合、脂肪と不関電極の端部を差し込み記録電極のための上記のようにそれ自体結合組織、。 電子セラミックは、空間的にも時間的にも、機械的変位を超える絶妙に制御することができます。しかし、電気的な接続を行う世話をする - 高温がそれらを破壊する、とても暑いはんだを使用しないでください。金属配合エポキシ接着剤を使用するか、または供給業者が推奨する専門家押し込み型ソケットを使用しています。これは、両方しっかりとそれを保持し、電気的な接続を確立します。標準的なエポキシ樹脂と電子セラミックにガラス刺激プローブを接続します。組織損傷のリスクを最小化するために電気生理学的記録のためのパッチまたは鋭い電極を製造するために使用される耐火研磨標準10cmの端部は、x直径1.5mmのホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ。単一の毛包の刺激が必要な場合は、火ポリッシュ先端は、単一の毛に合わせて、絞り開放内側単一毛でプローブを位置決めします。これは、単一の毛の上に絶妙に制御することができます。スチリルDYのため電子ラベルは、それが一般的に若い動物からの組織においてより均一です。これは、なぜ、必ずしも明らかではないが、これはおそらくあまり機械的​​外傷と若い組織からのより効果的な深部組織の除去を反映しています。毛包の拠点を覆う泡状層類似する発泡ポリスチレンを除去するのに十分なこと。これは神経叢層と関連披針形端子を取り外すリスクしかし、激しすぎることを避けます。ほとんど、あるいはまったく電気毛包の動きに応じ、及びスチリル色素のアプリケーションがある場合は、（オレンジ/黄色）むしろ披針形語尾より毛幹の基部の明確な自家蛍光と、（/黄色白）皮脂腺の主なラベリングにつながりますオーバー熱狂的なクリアランスが下にある組織を損傷しています。最後に、非常に撮像前染料キレート剤を使用して、最終的な画像の画像コントラスト及び品質を向上させます。 この技術は、さらなる研究の範囲内で有用であり得ます。これらの共ULDは、候補チャネルに対する選択的な薬理学的リガンドと準備をインキュベートまたは遺伝的に削除されたようなチャネルを有するマウス系統をスクリーニングすることにより、ストレッチ誘発反​​応を担う機械刺激チャネル（複数可）についてのスクリーニング、例えば、含まれています。後者はNpy2rにリンクされたGFP発現17で例えばマウス系統における遺伝的操作に端子形態の変更、の蛍光評価と組み合わせることができます。最後の例では、ストレッチ誘発反応及びスチリル色素の取り込みに対するSLVの売上高（カルシウム、マグネシウム、ラトロトキシン、グルタミン酸受容体リガンド）のモジュレーターの効果を調べることによって、これらの披針形端子におけるシナプスのような小胞（SLVS）7の役割を調査することができます/リリース。したがって、この新しい技術はmechansensory神経科学の研究の潜在的に興味深い道の範囲を開きます。

感覚軸索の披針形端子は、哺乳動物における毛包が毛シャフト上皮の周りに柵を形成する神経支配します。その目的は、それらが取り囲む毛の機械的変位を検出することです。彼らは急速に、ゆっくりと、主に髪の動きに応じて活動の短いバーストを生成語尾を適応が混在しています。動きが停止したときに活性があっても継続的な変位の存在下で、非常に迅速に停止します。ここでは、披針形端子における構造と機能の相関研究のため、このネズミの耳介モデルの開発について説明します。耳介は、これらの語尾を研究するための多くの有利な特徴を持っています。まず、耳介は、本質的に皮膚の二つの層は、卵胞や端末へのアクセスを妨害する間にほとんど他の組織で、背中合わせに並置されています。皮膚は非常に薄く、簡単に起因するタフな結合組織の最小量に解剖です。神経支配は、簡単にアクセスし、識別可能です。ヘアfolliclながら、ESが存在する場合、それらは比較的まばらに機械的に卵胞の個人または小グループの刺激を容易に分散されています。薄い下層の真皮層は、薬理学的薬剤や染料による神経終末への良好なアクセスを提供します。これは、蛍光顕微鏡を用いて画像化研究のために特に最適です。イメージングは​​、いずれかの生きている端末で、または固定し、さらに組織学的処理の後にすることができます。 機械刺激ニューロンの応答は、毛包が伝統的に孤立した皮膚の準備3,4に、より少ない程度に、1,2鼻毛げっ歯類で研究されている支配します。これらは私たちに、毛幹の周囲の神経終末における機械刺激生理学の一般原則について多くを教えてきました。感覚毛の準備は、単一の毛包の動きの上に絶妙なコントロールを可能にします。しかし、感覚毛のように、その複雑さのために出力を解読することは困難です卵胞は、解剖学的に明確な機械刺激エンディング5の少なくとも8つの異なる種類が含まれており、特定の電気生理学的応答にこれらの形態学的なタイプのマッチングは依然として論争の問題です。マウス皮膚/伏在神経の準備は、ほとんどの場合、タッチ及び疼痛応答を調査するために、その脱毛状態で使用されます。そのような製剤中の毛包の神経支配はそれほど複雑ではなく、毛包の密度は、プラス、このような近接6 3つの異なる毛包タイプ（ガード、AWL / aucheneとジグザグ毛）の存在は、特定の応答を研究する意味しますエンディングの単一卵胞または単一の型が再び困難です。また、この製剤は、複雑な解剖を伴います。最後に、感覚毛および他の皮膚製剤の両方では、ex vivoでの製剤がまだ生きている間関与終末を視覚化することは困難です。したがって、組織切片であっても、GFPを発現するマウス系統に必要とされます。 Alternatively、そのような免疫蛍光のための固定および/または抗体のインキュベーションなどのさらなる組織学的/免疫学的処理を必要とします。 したがって、我々は、耳介の準備を開発し、毛包の求心性神経の制限された集団からの電気録音を行い、膜のサイクリングは、スチリルピリジニウム色素の取り込みによって証明される、これらの披針形の語尾で起こることを示すためにそれを使用しています。最後に、我々は色素が、それがメカノチャネルをブロックしませんを示す、機械的感受性を妨害しないことを示しました。単純な刺激と分析プロトコルの結果が示されています。

<table><tbody><tr><td>PDMS - Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>柔軟性があり、不活性で、半透明の固体シリコーンポリマー。</td></tr><tr><td>No. 3 デュモン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>アウステルリッツ昆虫ピン</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26002-10</td><td>ピンの準備をPDMSにしっかりと取り付けるための非常に細いピンで、ダメージを最小限に抑えます。</td></tr><tr><td>AC差動プリアンプ</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL104A</td><td>入力される求心性心電図のサイズを増幅します。差動記録により、外部の電気ノイズとベースラインドリフトが最小限に抑えられます。&nbsp;</td></tr><tr><td>ハイ/ローパスフィルター</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL125</td><td>シグナルコンディショニングは、外来の電気ノイズを低減し、最適な信号対雑音比を確保します。</td></tr><tr><td>スパイクトリガー</td><td>デジタイマー</td><td>Neurolog NL201</td><td>イベント検出器のしきい値を設定し、オシロスコープに表示します。これは、活動電位検出の有効性を示しています。&nbsp;</td></tr><tr><td>オーディオアンプ&スピーカー</td><td>Digitimer</td><td>Neurolog NL120S</td><td>顕微鏡で機械的刺激の準備を調整しながら、感覚終末の電気的発火の存在を示す有用なオーディオモニタリング&nbsp;</td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>デジタイマー</td><td>PM3380A</td><td>この古いモデルを使用していますが、標準のオシロスコープで十分です。</td></tr><tr><td>ピエゾエレクトロセラミック&nbsp;ウェーハ</td>モー<td>ガンエレクトロセラミックス、サウサンプトン英国</td><td>PZT507</td><td>電気生理学/コンピュータインターフェース</td></tr>ピ<tr><td>エゾエレクトロセラミックス&nbsp;電源</td><td>ホームは</td>、セラミックウェーハの変位を駆動するために0-200V DC出力を作り<td></td><td>、記録/刺激ソフトウェアとコンピュータインターフェースを介して出力の可変電子制御を行います。Spike2ソフトウェアと1401microコンピューターインターフェースを使用しています。</td></tr><tr><td>電気生理学ソフトウェア</td><td>ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン (CED)</td><td>Spike2 v7</td><td>電気生理学記録・刺激・データ分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>ラボラトリーインターフェース</td><td>ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン (CED)</td><td>1401 マイクロ</td><td>エレクトロ生理学インターフェース、アンプ/フィルターとコンピュータの間。それは心電図を入力し、また電気セラミック運動を駆動します。</td></tr><tr><td>FM1-43/Synaptogreen C4</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70020</td><td>細胞膜の外尖に可逆的に仕切る蛍光膜プローブ。主に小胞膜のエンドサイトーシス/エキソサイトーシスのモニタリングに使用されます。</td></tr><tr><td>Advasep 7</td><td>Biotium/Cambridge Bioscience</td><td>BT70029</td><td>露出した膜からFM1-43(およびその他のスチリルピリジニウム染料)をキレート化するスルホン化b-シクロデキストリン誘導体で、バックグラウンドラベリング/蛍光を下げることで、内在化染料をよりはっきりと見ることができます。</td></tr><tr><td>Retiga Exi Fast 1394</td><td>Qimaging</td><td></td><td>モノクロ、冷却CCDカメラ - 基本モデル</td></tr><tr><td>Volocity 3D画像解析ソフトウェア</td><td>Perkin Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>画像キャプチャおよび解析ソフトウェア。</td></tr></tbody></table>

マウスの毛包披針形エンディングで機械的に刺激された求心性の出力および神経ターミナルラベリングの複合記録

Combined Recording of Mechanically Stimulated Afferent Output and Nerve Terminal Labelling in Mouse Hair Follicle Lanceolate Endings

新規解剖記録技術は、マウスの耳介における毛の機械的変位によって引き起こさ求心性発火を監視するために記載されています。技術は非常に費用対効果の高い、容易に一般的にほとんどの電気生理学研究室で見つかった物質で行われ、または容易に購入です。解剖は、独自のソフトウェアによって制御される一般的な電気セラミックウェハが提供する機械的変位で、シンプルで早いのが特長です。同ソフトウェアは、レコードとelectroneurogram出力を分析します。誘発神経活動の記録は、火災研磨標準ガラス微小電極に接続されている商業用差動アンプを介して行われます。役立つヒントを準備刺激および記録品質を最適化する記録条件の品質を向上させるために与えられます。システムは、だけでなく、毛包の柵終末の披針形端子の電気生理学的および光学的特性を測定するのに適していますそれらの薬理学的および/または遺伝子操作からの結果。スチリルピリジニウム生体色素で機械的刺激とラベリングして電気的記録を組み合わせた例が与えられています。

電気生理学的記録装置は、毛包を露出するために除去し、皮下の脂肪組織で、 図1Aに示されています。この露出領域の一部が、図1Bに明視野照明でより高い倍率で示されています。このエリアにアップし、バック自体に耳介のマージンを折ることは、表皮表面を露出させます。これは、折り目の端に毛が鈍いプローブ（図示せず）と機械的刺激のための理想的な状況では、水平方向に突出するように配置する。 図1Cは、染料の暴露後にし、再び展開された位置に余裕を返すことを示し、刺激卵胞この位置でスチリルピリジニウム色素で標識されています。製剤からElectroneurogramsは、典型的には、最大サイズ（ 図2AのAPを含む、偶数ガラスファイバープローブの課さ運動の不在下で進行中のAP活性を示します<strオング&gt; I〜III）。活動は、刺激の期間の間の間隔の自動相関は非常に平坦であるように、張性のない構造や兆しを見せない、約10〜20インパルス/秒（「スパイク」のトレース）の割合で発生します。 5 Hzの時には、毛幹の100μmの機械的刺激は、全体の出力は、一般的に20から50インパルス/秒、または正弦波サイクル当たり4-10に上昇します。サイクルヒストグラムの建設は、その後の応答（ &#39;相ロックいわゆる&#39;）強い巻き込みを明らかにする（ 図2BI-III））。応答がロックされるときの波形の位相、 すなわち毛運動のどの点振動プローブそれ接点で、それらの位置に依存するが、これは、非常に再現性があります。 （水平線は、A（I-III）における神経像トレースを横切る）単純な閾値検出は、この分析のために使用されてきました。しかし、記録ソフトウェア機能は、多くの場合に、より洗練された方法で使用することができますスパイクの大きさ及び形状の特徴を識別する。そして、これは擬似シングルユニット記録の分析を行うことができるようにするために、これらの特性により、特定の求心性線維の応答を分離することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig1.jpg" /> 図1：耳介を示す電気生理学的実験のために設定電気生理学的記録の配置とN-（3-triethylammoniumpropyl）-4-（4-（ジブチルアミノ）スチリル）毛包求心性披針形の語尾のピリジブロマイドラベリング （A）Aの耳介の準備方位、神経の位置、記録電極と脂肪組織の除去後の毛包神経支配の露出面積。 （B）複数の毛包が真皮にまで上層の脂肪組織のクリアエリア内の明視野照明に表示されます。暗い、通常bilobed、形状は皮脂腺です。 （ <st栄&gt; C）スチリル色素N-（3-triethylammoniumpropyl）-4-（4-（ジブチルアミノ）スチリル）ピリジニウムブロミドと落射蛍光顕微鏡による機械的刺激後に撮像されたで標識された2つの披針形語尾を示すBで箱入りの領域）の拡大図。 7からは、許可を得て。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53854/53854fig2.jpg" /> 図2：マウス耳介から録画（A）刺激誘発活動。標準Lileyの生理食塩水溶液中介からの連続neurogramsからのアクティビティの、3つの異なる実験から採取した（ 愛-iii）の例としては、。各レコードは、の正弦波変位の3秒の期間を含む記録開始後5秒区間約5分を示しています毛幹のモールの数。機械的刺激は、通常、1〜2時間続いた連続記録、全体で30秒毎に繰り返しました。カスタムスクリプトファイルは、水平カーソル（スパイク）によって設定された閾値と、各正弦波の周期（期間）の発症を交差させ、個々のイベントをマーク。 （AIV）正弦波変位する指令信号。 （B）刺激誘発スパイク活動の分析。 3°のビンで（ バイiii）のサイクルヒストグラムは、ガラスプローブによって毛幹の5 Hzの正弦波変位による機械的刺激に対する推測披針形の語尾の応答を示す、（ 愛-iii）は 、それぞれ神経像サンプルから構成される。機械的プローブの開始位置への相対的な位置に応じて、周期の異なる段階で、マークされた位相ロックに注意してください。 （BIV）正規化されたプローブの変位正弦波;実際の振幅は約100でした1;メートル<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53854/53854fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

柵末端の機械的刺激による求心性分泌を記録するためのシンプルで新しい技術が提示されています。これは、マウスの耳の皮膚の毛包を神経支配するものです。

A novel dissection and recording technique is described for monitoring afferent firing evoked by mechanical displacement of hairs in the mouse pinna. The ...

この手順の全体的な目的は、アクセスが困難で機械的な刺激に敏感な神経末端において、生細胞イメージングと電気生理学的記録を組み合わせる迅速かつ簡便な方法を提示することです。この手法は、メカノセンセーションにおける重要な疑問、例えば、完全に分化した末端におけるシナプス様小胞の役割や、候補となるメカノトランスデューサーチャネルの薬理学的特性をin situで解明するのに役立ちます。この手法の最大の利点は、非常に簡便でありながら、生理学的研究のために完全に分化した末端への視覚的アクセスを可能にする点にあります。本手法は毛包求心路に焦点を当てていますが、筋紡錘、メルケル感覚末端、圧受容器などの他の低閾値メカノセンサリシステムに関する知見を得ることも可能です。この技術の応用範囲は、異常な血圧調節の治療を含む、機械的センサーを制御するための新しい創薬標的の開発にまで及びます。若年成マウスを断頭した後、実体解剖顕微鏡下で、幅50cmの底面が広いディッシュに入れたガス飽和Liley溶液の中に、頭部を背側向けて配置します。約10分ごとに、解剖部位をガスシランで十分に洗浄してください。次に、スプリングバウシザーゼスと3番ピンセットを用いて、耳介の基部の皮膚を慎重に切開し、剥離します。外耳道の神経支配と軟骨を露出させます。下顎関節の裂隙から頭蓋骨的に現れる三叉神経下顎神経の分枝および大耳介神経を同定します。これら2つの神経分枝は軟骨を貫通し、耳介皮膚の凹面および凸面を支配しています。次に、下顎と乳様突起の間の溝において、三叉神経の分枝が出ている箇所を特定します。耳介を頭蓋骨からそっと引き離して、神経の走行を露出させます。露出後、神経を頭蓋骨にできるだけ近い位置で切断します。次に、スプリングボウ剪刀を用いて、頭部から耳介を切り離します。切断した神経の遠位端を切らないように注意し、密集した被毛が混入するのを最小限に抑えてください。切り離した耳介を、ガス飽和させたLiley溶液を満たしたシリコンゴム敷きのシャーレに移します。次に、外耳道を最も狭い部分で切開して開きます。その後、耳介を凹面が下になるように平らにし、その縁に沿って非常に細い昆虫ピンを等間隔に刺して固定します。続いて、ハサミを用いて鈍的に剥離し、耳介と下層の軟骨から露出した背側の皮膚を完全に除去します。このステップでは、前方皮膚を損傷しないようにしてください。次に、ピンセットを使用して細い昆虫針を掴み、皮膚と外耳道軟骨の間から後方に現れる、切断された下顎神経分枝をそっと広げます。これらの神経分枝を、可能な限り細いピンでプレートに固定します。神経の塊そのものではなく、その切断端に隣接する結合組織を突き刺し、接合させます。神経枝の周囲から周囲の結合組織の大部分を取り除いて組織標本の作製を完了させますが、過度な牽引や切断によって神経を損傷させないように注意してください。毛包メカノセンサ受容末端を生染料または薬剤で処理するために、耳介縁に沿って5 mmの範囲で皮下脂肪層の海綿状線維弾性軟骨を慎重に剥離します。したがって、正方形のウィンドウを開き、真皮と毛包の底部を露出させます。若いマウスを使用することで、前方および後方の皮膚層間の癒着や、下層の軟骨を除去する際の困難さを最小限に抑えることができます。これら両方の条件を満たすことで、染色の成功率が高まります。まず、準備した試料を記録室のシリコンライナー付きベースに転移させます。細い昆虫ピンを用いて、耳の周囲の縁を固定し、耳の基部の清潔な神経を2つの吸引電極の近くに配置します。一方の電極は記録用であり、もう一方は等電位電極として、差動増幅器にニュートラル信号を供給するために使用します。記録電極について、開口部のサイズと内径を、記録対象として選択した神経の太さに慎重に合わせてください。一度合わせれば、通常、一連の実験を通じて一定で問題ありません。十分な長さの神経が、内部にぴったりと収まるようにする必要があります。神経を電極内に引き込むには、シリコンチューブを介して接続した2 mLシリンジを用いて、緩やかに吸引します。記録電極内では、吸引中に細い昆虫針を用いて神経をゆっくりと引き出したり再挿入したりすることで、神経が直線的に配置され、折り畳まれたり二重になったりしていないことを確認してください。次に、周囲の結合組織または柔らかく柔軟な脂肪組織を少量吸引し、電極の開口部を水密に密封します。高品質で差動的な記録を行うには、電極間のインピーダンスのバランスを整えることが不可欠です。そのためには、神経の周囲に高抵抗で水密性の高いシールを作成することが極めて重要です。次に、自然な毛細管現象で満たされていない場合は、吸引によって対極に生理食塩水を充填します。次に、記録電極および不活性電極の内径に、同一の銀記録線を挿入します。そのもう一方の端で、電線は2芯シールドケーブルの異なる芯線に接続されている必要があります。記録電極内の電線が、シールを壊さないように注意しながら、生理食塩水に接し、神経の近くに配置されていることを確認してください。ワイヤーを無差別電極の端に挿入します。次に、銀-塩化銀ペレットである接地電極をバスに入れます。この電極を、記録電極に接続された2芯ケーブルのシールド線に取り付けます。オシロスコープで個々の信号を確認し、2つのチャネルの電気的ノイズレベルが同程度であることを確認します。2つの電極のバランスが整うまで、記録電極における自発的な活動電位が見えない場合があります。背景ノイズの差を補正するには、脂肪結合組織をさらに電極内に吸い込ませることで、片方のチャネルのインピーダンスを上げてください。電極のバックグラウンドが均衡したら、差動記録に切り替え、自発的な活動電位を確認するか、あるいは火炎研磨したガラス棒で耳介縁の毛を刺激して活動電位を誘発します。次に、コンピュータインターフェースを介して電気神経図を記録します。そして、この神経図をサウンドシステムに通し、スパイク音がベースラインノイズよりわずかに高いレベルで聞こえるようにします。この聴覚フィードバックリレーは、実験を行う際に非常に有用です。次に、毛を直接刺激することで、透明化した領域付近の毛包の神経支配が維持されていることを確認してください。続いて、脂肪を除去して作成したウィンドウの高さで耳の皮膚の縁を1〜2mm折り返し、その下にある毛を露出させます。対面する皮膚層の間に、生理食塩液で満たした隙間を設けます。注意深く音を聴きながら、ガラス棒を用いて、折りたたまれた縁に沿って突き出ている毛をそっとなぞります。このとき、皮膚に触れないようにしてください。必要に応じて、オシロスコープで出力を評価します。刺激誘発活動電位の制御された記録を行うには、セラミック製ピエゾ電気アクチュエータに取り付けられた、火炎研磨済みの10 cmホウケイ酸マイクロ電極ガラスのメカニカルプローブを使用します。プローブを、皮膚のひだと平行に移動し、皮膚ではなく毛に接触するように配置してください。皮膚表面から約0.5〜1 mm上に配置します。次に、プローブが移動した際の音声出力を聞き取り、刺激を手动で確認します。これで、少量の被毛領域に機械的刺激を加えるためのソフトウェア設定は完了です。例えば、10秒ごとに5 Hzの正弦波で3秒間のシミュレーションをプログラムします。これには200から2,000 µmのプローブ変位が必要です。その後、自動刺激を繰り返し行い、神経における記録応答の一貫性を確認します。再現性のある結果が得られるはずです。結果に一貫性が見られたら、繰り返し率を30秒ごとまで下げてください。詳細な手順はテキストプロトコルに記載されています。メカノセンサリーチャネルの特性を調査し、毛包周囲のメカノセンサリー末端を標識するために、10 µMのFM1-43を溶液に添加し、60分間静置します。その間、振動プローブによる毛髪への刺激を継続します。この色素は、培養細胞および蝸牛の有毛細胞において、候補となるトランスデューサーチャネルと感覚ニューロンを遮断します。しかしながら、成熟した毛包の求心性神経のin situでの発火を阻止することはありません。末端の標識からは、色素が末端に到達していることが分かり、これらの末端は色素への曝露中も機械的刺激に対して応答し続けました。記述されたプロトコルを用いて記録された電気神経図では、手動による刺激がない場合でも、最大サイズの活動電位を含む持続的な活動電位が通常認められました。自発活動は約10-20 spikes/secで発生し、構造や緊張性の兆候は見られませんでした。刺激期間の間の間隔に関する自己相関は、常にほぼ平坦でした。毛幹に対して5 Hz、500 µmの機械的刺激を与えている間、全体の出力は通常、約50 spikes/secまで上昇しました。サイクルヒストグラムを作成した結果、応答に強い引き込み（entrainment）があることが明らかになり、正弦波1サイクルあたり4本から10本のスパイクが観察されました。これは極めて再現性が高いものでしたが、当然ながら、応答がロックされる波形の位相は、振動プローブが毛髪のどの箇所に接触したか、およびその時点での移動方向に依存していました。次に、毛包披針形神経終末のチャネル薬理学について検討しました。これらのチャネルは、培養中の感覚ニューロンやex vivoの蝸牛有毛細胞におけるチャネルなど、一部の機械刺激感受性チャネルを遮断するFM1-43に曝露した状態でさえ、応答し続けました。この手法を習得すれば、電神経図（electroneurogram）の記録開始までの操作を60〜90分で完了できます。本手順を試みる際は、電極において高抵抗の電気的接触を確立させることが重要であり、また、毛包の可視化を併用する場合は、染料の浸透性と光学的な透明度を向上させるために小型のマウスを使用することが重要です。我々は、この手法のアイデアを、元同僚で現在は退職されたClarke Slater教授と、その修士課程の学生であるNakul Kain氏が開発したものから適応させました。これは、筋紡錘のメカノセンセーション（機械刺激受容）におけるシナプス様小胞の潜在的な役割と、FM1-43を用いてそれらを視覚化するより優れた手法の必要性を彼らに伝えた際に得られたものです。薬理学や生存染料標識などの手法とともにこの手順を実施することで、どのチャネルがメカノトランスデューサー（機械的刺激変換器）であるか、in situで分化した終末はどれか、また機械的刺激がシナプス様小胞のリサイクルを調節することで染料の取り込みと放出を変調させ得るかといった疑問に答えることができます。FM1-43は毒性の評価がなされていないため、有害物質として扱う必要があることに注意してください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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筋肉感覚ニューロンは自己受容体シグナル伝達に関与し、また代謝状態やけが関連するイベントについて報告している。私たちは、ストレッチ活性化筋求心性神経の研究のためのin vitroでの筋肉の神経に備えて成体マウスについて説明します。...

アン体外成体マウス筋肉神経の準備

このビデオは、in vitroマウスの結腸直腸神経製剤で単繊維電気生理学的記録を行うためのプロトコルを示しています。...

マウス大腸求心性終末の体外機能解析では、

ここでは、ステリルピリジニウム染料による染色および脱染中にマウスの耳の皮膚の毛包を神経支配する柵末端の生きた披針形感覚終末をイメージングするための新しい準備について説明します。...

の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

腸間膜求心性神経は、正常な恒常性と病態生理学に関する情報を消化管から脳に伝えます。胃腸求心性神経活動は、求心性神経が付着した孤立した腸管セグメントを臓器浴に取り付け、神経を分離し、基礎活動と刺激活動を評価することで評価できます。...

マウス空腸および結腸セグメントにおける腸間膜求心性神経活動のin vitro記録で

このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ...

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

我々 は自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激への応答で下角と局所電界電位を同時に記録する技術を開発しました。この手法は、侵害受容情報の脳内処理の検討を容易にするメゾスコ ピックおよびマクロスコ ピック レベルで electrocortical...

大脳皮質の局所電界電位と自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激への応答で Electrocorticograms の同時録音

本研究は、マウスの前足の皮膚における低閾値機械受容体(LTMR)軸索末端の構造を可視化するための 生体内...

マウス皮膚における触覚感覚軸索形態のバイタル2光子イメージング

学ぶマウス毛包の機械刺激応答記録法。神経終末の可視化と電気生理学的記録を組み合わせ、感覚受容メカニズムの研究に応用可能。この手法は薬理学的解析や新規治療標的開発に貢献する。

マウスの毛包披針形エンディングで機械的に刺激された求心性の出力および神経ターミナルラベリングの複合記録

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