単分散微小液滴のサイズ制御可能な形成のためのキャピラリーベースの遠心マイクロ流体デバイス
2016年2月22日
ここでは、キャピラリーベースの遠心マイクロ流体デバイスを使用して、サイズ制御可能な単分散油中水型(W / O)マイクロ液滴の簡単な生成方法を示します。この方法は、少量のサンプルしか必要とせず、高収率の生産を可能にします。この方法は、迅速な生化学的および細胞分析に役立つと期待しています。
この手順の全体的な目標は、キャピラリーベースの遠心軸対称共流マイクロ流体デバイスを使用して、生物学的研究用の単分散水および油の微小液滴を生成することです。この方法は、生化学分野向けの単分散微小液滴の生成に役立ち、合成、単一分子PCR、単一カプセル化、および生細胞の単純なモデリングにおける研究を進めることができます。この手法の主な利点は、簡単で調整可能であることです。
必要なサンプル溶液は1マイクロリットル未満で、必要なサイズの単分散微液滴を生成できます。その手順を実演するのは、私の研究室のポスドクである森田さんです。キャピラリーベースのマイクロ流体アセンブリは、キャピラリーホルダーの準備から始まります。
まず、厚さ2mmのポリアセチルプラスチック板から4枚のディスクをフライス盤でフライス加工します。ディスクは、ロッドとネジで支えられたコラムを形成するために使用されます。M.2ネジを使用して、プレートを組み立てます。
まず、ディスク1とディスク2から、ホルダーの底を組み立てます。次に、ネジをねじ山部分で切って短くします。4つの穴のうち3つを接続して2つのディスクを固定し、0.9センチメートルのスタックを作ります。
同様に、ホルダーの上部をディスク3と4から組み立てます。各プレートの2つの穴を使用して、プレートを接続します。スタックの高さを0.7センチにします。
次に、長いネジを使用して、ホルダーの上部にある2つの空の穴をホルダーの下部にある2つの空の穴と結合します。長いネジは、ホルダー間に約2〜3ミリメートルの隙間を空け、ネジの頭が完成したホルダーに約2.2センチメートル張り出す必要があります。各実験では、2 つのキャピラリーから作製された新しいキャピラリーのセットを使用します。
90mmのキャピラリーから、ガラスカッターを使用して2つの内側のキャピラリーを作成します。同じサイズのセクションを 2 つ作成します。150mmのキャピラリーから、内側のキャピラリーセクションを3つ作ります。
次に、ガラスプーラーを使用して、各キャピラリーセクションをシャープにします。プーラーウェイトを最大に設定し、熱レベルを外側のキャピラリーで60〜70度、内側のキャピラリーで70〜80度に設定します。次に、ガラスを慎重に研ぎます。
毛細血管のくびれた部分の長さを推奨範囲内に保ちます。先端の長さが長すぎるか短すぎる場合は、正しい長さになるまで発熱体を調整します。次に、先端をカットする準備をします。
まず、透明なテープを使用して、キャピラリーを顕微鏡ステージに固定します。対物レンズの下に先端を張り出します。次に、ガラスビーズで覆われたプラチナワイヤーを使用して、先端を3段階で切断します。
まず、切れ目が発生するはずの場所にキャピラリーを冷たいビーズと接触させて置きます。次に、ワイヤーを1〜2秒間加熱します。次に、3番目に、プラチナ線を冷却して先端を切り取ります。
この操作は、フットペダルコントロールを使用してワイヤーを加熱するために実行する必要があります。次に、マイクロフォージを使用して、キャピラリーオリフィスの直径を調整します。外側の2つのガラスキャピラリーは、オリフィスを60ミクロンにします。
3つの内側の毛細血管については、直径5、10、20ミクロンのオリフィスを作ります。微小液滴を生成するには、まず外側のガラスキャピラリーに、モノオレイン酸モノオレチンが2重量%のヘキサデカンなどの含油界面活性剤を充填します。10マイクロリットルの溶液をキャピラリーにロードします。
次に、装填したコピラリーをホルダーの底部に固定します。次に、キャピラリー作用を利用して、約0.1マイクロリットルの水溶液を内側のガラスキャピラリーにロードします。ロードされたインナーキャピラリーをホルダーの上部に配置します。
次に、内側の毛細管をホルダーを横切って外側の毛細管に挿入します。先端を顕微鏡で観察しながら、ホルダーの長いネジを回して、内側の毛細血管をゆっくりと慎重に外側の毛細血管に進めます。内側のキャピラリーを、外側のキャピラリーの直径が100〜150ミクロンのところまで進めます。
次に、界面活性剤を含む同じオイルを100マイクロリットル、1.5ミリリットルのマイクロチューブの底に導入します。これは、マイクロドプレット収集チューブとして機能します。ホルダーとキャピラリーをロードされたマイクロチューブに慎重に配置します。
外側のキャピラリーがマイクロチューブ内の溶液と接触していないことを確認してください。次に、チューブを卓上スイングアウトタイプの遠心分離機にロードします。微小液滴を生成するには、遠心分離機を重力の1,600倍で1〜2秒間運転します。
次に、キャピラリーとホルダーをチューブから取り外し、チューブに集めた水-油の微小液滴を分量します。微小液滴をスライドガラスに噴射し、画像化して分析します。このプロトコルを使用して、2%モノオレエートソルビチンを含むヘキサデカンから作られたさまざまな水油微小液滴。
オリフィス径5ミクロンのインナーピペットで作製した液滴は、平均で8.3ミクロンと測定されました。オリフィス径10ミクロンのインナーピペットで作製した液滴は、平均で直径12.7ミクロンと測定されました。オリフィスが20ミクロンのインナーピペットで作製した液滴は、直径が約17.9ミクロンでした。
したがって、この方法では、内側の毛細血管オリフィスのサイズに近い直径を持つ単分散微小液滴が生成されます。このビデオを見れば、定量的化学実験のための単分散水および油微小液滴の生成方法とサイズ制御方法について十分に理解できるはずです。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、5〜10分で実行できます。
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概要
本記事では、キャピラリーベースの遠心マイクロ流体デバイスを用いて、サイズ制御可能な単分散水中油（W/O）マイクロドロップレットを生成する方法を実演します。この手法は効率的であり、最小限のサンプル量で済み、生化学分析に向けた高収率な生成が可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- マイクロフルイディクス
- 生化学
- 細胞解析
背景
- マイクロドロップレットは、さまざまな生物学的研究において不可欠です。
- 実験の再現性を確保するには、単分散性が極めて重要です。
- 従来の手法では、より多くのサンプル量が必要となる場合があります。
- キャピラリーベースのデバイスは、サイズ制御と効率の面で利点があります。
研究目的
- 単分散マイクロドロップレットを生成するための簡便な手法を開発すること。
- 生化学的および細胞学的解析を容易にすること。
- 本手法の簡便性と調整可能性を実証すること。
使用された手法
- キャピラリーベースの遠心マイクロ流体デバイスのセットアップ。
- キャピラリーホルダーの準備。
- 共流マイクロ流体アセンブリ。
- サイズ制御されたマイクロドロップレットの作製。
主要な結果
- 単分散マイクロドロップレットの生成に成功した。
- 最小限のサンプル量で高収率であることを実証した。
- 作製したマイクロドロップレットは、さまざまな生化学的アプリケーションに適している。
- 手順は容易に導入可能であり、調整も可能である。
結論
- この手法は、マイクロドロップレット作製のための信頼性の高いアプローチを提供します。
- これにより、迅速な生化学分析の能力が向上します。
- この技術は、シングル分子PCRおよび細胞モデリングの研究を前進させることができます。
よくある質問
産業界における重要性
サイズ制御が可能な単分散マイクロドロップレットを迅速に生成することで、初期探索ワークフローにおける生化学的アッセイおよび単一細胞解析のスケーラブルな小型化が可能になります。このキャピラリーベースの遠心マイクロ流体デバイスは、貴重な生物学的試料を節約しつつ、ハイスループットで定量的な実験を支援します。このアプローチは、バイオ医薬品の研究開発パイプラインにおける重要な局面での予測信頼性と再現性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- シングル分子PCRおよびシングルセル研究のための精密な封入を可能にします。
- 最小限のサンプル投入量で、生物学的パスウェイの機能的な解析をサポートします。
- 均一なアッセイ条件を構築することで、メカニズムのリスク低減を促進します。
- 標的バリデーション実験における予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの生化学的スクリーニングに向けた、再現性の高いマイクロドロップレット系を構築します。
- ドロップレットサイズを標準化し、アッセイ間での定量的な比較可能性を確保します。
- アッセイに使用可能なマイクロドロップレットの、迅速かつスケーラブルな作製を可能にします。
- 小型化されたフォーマットにおける化合物効果の信頼性ある評価をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 単一細胞または低容量での分析を必要とするトランスレーショナルバイオマーカー研究に適しています。
- 希少なサンプルを保存することで、探索段階から前臨床検証までの連続性を維持します。
- 堅牢で定量的なデータ生成をサポートし、候補物質の推進におけるリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本デバイスは、ターゲットのバリデーション、スクリーニング、およびトランスレーショナルリサーチのための小型化された定量アッセイを可能にすることで、創薬から前臨床試験に至る一連の流れに統合されます。
- 探索生物学：制御された微小環境により、仮説検証およびパスウェイ解析をサポートします。
- スクリーニング：化合物評価のための、再現性のある定量的な液滴ベースのアッセイを提供します。
- 分析：統計的比較のため、液滴サイズおよび封入内容の精密な測定を行います。
- トランスレーショナルリサーチ：最小限のサンプル量で、バイオマーカーおよび単一細胞研究を促進します。
- 企業での再利用：多様な研究開発アプリケーションに適応可能な、拡張性のあるプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：初期段階の研究における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：アッセイ開発における標準化、再現性、およびスループットを向上させます。
- 戦略的価値：限られたサンプルで堅牢なデータを生成することを可能にし、Go/No-go判断の質と資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けと、創薬プログラムの推進を支援します。
実施上の検討事項
- マイクロ流体アセンブリおよびキャピラリー操作の専門知識が必要です。
- キャピラリー作製およびイメージングのための精密機器へのアクセスが必要です。
- 液滴サイズおよびアッセイプロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- 軽微な調整により、さまざまな生物学的および化学的なモデルシステムに適応可能です。
- 微量サンプルおよびデバイスコンポーネントの慎重な取り扱いが必要である点に制約があります。
