コンプリートの蛍光タイムラプスイメージング S。ベネズエラライフサイクル

この蛍光タイムラプス顕微鏡プロトコルの全体的な目標は、胞子形成糸状細菌Streptomyces venezuelaeの発生と細胞分化を支える生物学的細胞プロセスを研究する方法を提供することです。この記述法は、動的タンパク質の局在化、分極成長、胞子形成中隔など、Streptomycesのライフサイクルの中心となる細胞生物学的プロセスを研究するための優れたプラットフォームを提供します。この技術の主な利点は、Streptomyces venezuelaeが液体中で胞子を形成するため、マイクロ流体デバイスで細胞を増殖させ、ライフサイクル全体を顕微鏡で監視できることです。

この方法は、多中心菌糸体の胞子鎖への分化の生細胞イメージングを可能にするため、Streptomyces venezuelae属の新たな発生システムとしての計り知れない可能性を示しています。まず、30ミリリットルのサプリメント成長培地に、イメージングするS.ベネズエラ株の胞子10マイクロリットルを接種します。細胞の一貫した増殖と胞子形成のためには、バッフルフラスコまたはスプリングを含むフラスコを使用して、十分な曝気を可能にします。

細胞を摂氏30度、250RPMで35〜40時間培養します。準備ができたら、液剤封入位相差顕微鏡で菌糸体の断片や胞子を見ることができるはずです。1ミリリットルの培養物を卓上型遠心分離機で400倍Gの遠心分離機で1分間遠心分離し、菌糸体とより大きな細胞断片をペレット化します。

次に、胞子の懸濁液を含む約300マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリメートルチューブに移し、チューブを氷の上に置きます。残りの培地は、後のステップで使用するために保持します。次に、補充された増殖培地で胞子を1〜20に希釈し、希釈した胞子が必要になるまで氷上に保ちます。

残りの培地を50ミリリットルのビーカーに注ぎ、シリンジで10ミリリットルを引き上げ、滅菌済みの22マイクロメートルシリンジフィルターを使用して残りの培地をろ過滅菌します。胞子や菌糸体の断片を含まない使用済みのサプリメント成長培地を入手するため。同様の成長条件を使用して追加の実験を行う場合は、ろ過した使用済みのサプリメント増殖培地を摂氏4度で数日間保管します。

各マイクロ流体プレートは、最大4つの独立した実験に使用できます。未使用のフローチャンバーが汚染されないように、実験のセットアップ時には無菌溶液と作業条件を使用してください。まず、マイクロ流体プレートから輸送用溶液を取り出します。

次に、滅菌済みの補充された増殖培地でウェルをすすぎます。すすぎたら、300マイクロリットルの補充増殖培地をウェル1の入口に加え、300マイクロリットルの使用済みサプリメント増殖培地をウェル2〜6のウェルに追加します。次に、希釈した胞子の40マイクロリットルをレーンAの8番ウェルにロードし、製造元の指示に従ってマニホールドをプレートにシールします。

マイクロ流体の制御ソフトウェアを起動し、適切なプレートタイプを選択します。インレットウェル1から5まで、ウェルあたり6psiで培地を2分間流し、流路と培養チャンバーをプライミングするフロープログラムを設定します。次に、6 psiで補充された増殖培地をインレットウェル1に6時間流します。

これにより、発芽と栄養成長が起こります。6時間後にプログラムを使用済みのサプリメント増殖培地に切り替え、残りの実験で6psiで2〜5の井戸に流します。事前に環境チャンバーを摂氏30度に予温してください。

次に、顕微鏡と顕微鏡制御ソフトウェアの電源を入れます。高開口数油浸対物レンズを所定の位置に置き、黄色の蛍光灯と赤色の蛍光タンパク質融合の画像とともに、差動干渉コントラスト画像を取得するために設定された適切なフィルターと図式ミラーが所定の位置にあることを確認します。対物レンズとマイクロ流体プレート上のイメージングウィンドウの底にも液浸油を一滴注ぎます。

密閉されたマイクロ流体デバイスを倒立顕微鏡のステージに慎重に取り付け、所定の位置に固定します。埋め込まれた位置マーカーを使用して、マイクロ流体培養チャンバーのイメージングウィンドウに焦点を合わせます。Aとラベル付けされた最初のフローチャンバーの左端の部分に焦点を合わせ、ステージをトラップサイズ5(トラップの高さ7マイクロメートルに対応する)に移動します。

マイクロ流体ソフトウェアで、インレットウェル8からセルを4psiで15秒間ロードするようにシステムを設定します。プロセスの実行後、イメージングウィンドウを横切ってステージを移動させることにより、培養チャンバー内の細胞密度を確認します。胞子が捕捉されなかった場合は、細胞ローディングステップを繰り返すか、またはイメージングウィンドウあたり1〜10個の胞子の所望の細胞密度が達成されるまで、ローディング圧力および/または時間を増やします。

培養室に過負荷がかからないように注意してください。次に、制御ソフトウェアで事前に準備したフロープログラムを開始し、顕微鏡ステージでマイクロ流体プレートを1時間加熱平衡化させてから、画像取得を開始します。顕微鏡制御ソフトウェアでは、まず画像ファイルを自動保存するディレクトリを指定することで、複数のステージ位置で複数の画像を経時的に撮影する多次元取得を設定します。

次に、照明設定に移動し、特定の構成ごとに事前に定義された最適な照明設定を入力します。次に、24 時間にわたって 40 分ごとに画像を取得するように時系列を設定します。ステージ位置を決定し、オートフォーカスを設定するには、培養チャンバーをスキャンし、目的の各イメージング位置のステージ位置を保存します。

1段の位置が十分に離れて配置されていることを確認し、光の漂白と光の毒性を最小限に抑えます。選択したステージ位置のZ座標を確認したら、ハードウェアオートフォーカスをアクティブにします。その後、顕微鏡制御ソフトウェアでタイムラプス実験を開始します。

24〜30時間後、または対象領域の菌糸が胞子に分化したときに、画像取得を停止します。次に、ソフトウェアでフロープログラムを停止し、マイクロ流体デバイスを分解します。使用済みのマイクロ流体プレートを短期保存用に準備するには、インレットウェル、廃ウェル、セルローディングウェルから残っている媒体をすべて取り除きます。

次に、レーンAの使用済みウェルと未使用のレーンのウェルを滅菌PBSで満たします。最後に、プレートを洋ナシフィルムで密封して、乾燥を防ぎます。そして、プレートは摂氏4度で保管します。

S.ベネズエラのライフサイクル全体のライブセルイメージングが成功したことで、発芽、栄養成長、胞子形成の主要な発生段階を含む連続的な時系列が得られます。発芽または栄養成長中、DivIVA-mCherryは、成長中のヒプナルチップまたは新たに形成されたハイフ分岐点に排他的に蓄積します。対照的に、FtsZ-YPetは、成長する菌糸体に不規則な間隔で単一のリング状構造を形成します。

これらの構造は、相互接続された菌糸コンパートメントの形成につながる非建設的な栄養交差壁の合成のための足場を提供します。胞子菌糸では、FtsZ-YPetの局在パターンが劇的に変化します。まず、らせん状のFtsZ-YPetフィラメントが菌糸に沿って転がり落ち、次に突然、ほぼ同期して、これらのらせんが合体して、等間隔のFtsZ-YPetリングのはしごになります。

最後に、胞子形成中隔が微分干渉コントラスト画像で識別可能になり、最終的に新しい胞子が放出されます。この技術は、ストレプトマイセスの全ライフサイクルのライブセルイメージングを実行するための堅牢なプロトコルを提供します。マイクロ流体システムは使いやすいです。

これは、実験の柔軟性を提供し、この実験セットアップの長期的な監視を可能にするこの実験セットアップは、変化する文化的条件やペプチドグリカン合成を監視するための蛍光色素の使用に応じて特定の発達イベントを調査するための優れた出発点を提供します。