アンジオテンシンII受容体のローカライズされた可視化のための受容体オートラジオグラフィープロトコル

この手順の全体的な目標は、受容体オートラジオグラフィーと脳構造の組織学的同定を利用して、脳切片におけるアンジオテンシンII受容体の発現を解剖学的に局在化し、定量化することです。この方法は、アンジオテンシンIIが行動、認知機能、および心血管系に影響を与える脳領域を特定し、神経変性疾患および心血管疾患の治療のための新しい治療法の開発に洞察を提供します。この技術の主な利点は、定量的、定性的であり、他の方法よりも高い特異性でアンジオテンシンIIの機能受容体を同定できることです。

この方法は、乱用薬物に関連する受容体など、全身の他のホルモン受容体システムの機能を特徴付けることもできます。採取後すぐに、頭蓋骨の内部を模した脳型に脳組織を入れ、型をアルミホイルで包んでマイナス20°Cで保存します。30分後、ティッシュを密封可能な冷凍保存袋に移し、マイナス80°Cで保管します。

切片化する前に、脳を脳の型からそっと取り出します。脳組織を切片にするには、目的の標本を摂氏マイナス10度からマイナス18度に設定されたクライオスタットに移します。組織が新しい温度に平衡化したら、グリコールと樹脂ベースの培地を使用して、標本のごく一部を組織マウントに垂直に埋め込み、冠状面の切片化を可能にします。

組織をミクロトームにロードし、マウントを所定の位置にしっかりと締めてから、希望の厚さで脳の切断を開始し、次に切片を顕微鏡スライドに垂直にマウントして、組織のより大きな表面積をスライドに適用します。セクションを5つの順番のセットで収集します。すべてのセクションが収集されたら、スライドを最大1時間風乾させます。

次に、サンプルをセルフシール式のフリーザーバッグに入れたプラスチック製のスライドボックスに入れ、摂氏マイナス20度で保管します。試料に無線標識を付けるには、5枚のスライドの各セットから1枚目と2枚目のスライドを取り外し、市販または3Dプリントされたスライドグリップに取り付けます。ダッシュ 1 のスライドは非特異的治療群用で、ダッシュ 2 のスライドは全治療群用です。

35〜40ミリリットルの室温AM5とそれぞれの阻害剤でスライドを反転させ、適切なインキュベーション前のCoplinジャーに入れます。複数のスライドセットを実行するのは大変なことです。したがって、乾燥ステップ中に重なり合わないように、スライドをインキュベーション前のジャーに4分間隔で配置することが非常に重要です。

30分後、スライドを、適切な濃度のI125 SIアンジオテンシンIIおよびそれぞれの処理群阻害剤を添加した10ミリリットルのAM5を含むインキュベーションスライドメーラーに室温で60〜90分間移します。125I SI Ang IIの正確な濃度を決定することは、アンジオテンシンII受容体をある日と次の日に比較するために重要です。インキュベーションの終わりに、スライドをスライドグリップに戻し、スライドをブロックし、400ミリリットルの蒸留水の2つの別々の容器で1〜2秒間静かに撫

2回目の水洗後、30〜40ミリリットルのAM5で1分間の洗浄を4回連続して行い、スライドをすすぎます。4回目の洗浄後、氷冷蒸留水を4回交換して、セクションを1〜2秒間静かに渦巻きます。次に、異なる角度に設定された4つのブロードライヤーを使用して、スライドを冷気で4分間乾燥させます。

すべてのセクションが乾いたら、スライドをペーパータオルに移します。次に、両面テープを使用して、スライドを組織側を上にして、スライドをX線フィルム用の段ボールの位置に取り付け、グループごとに少なくとも1つのヨウ素125キャリブレーション標準スライドを含めます。セクションを露出させるには、暗い部屋で、段ボールのスライドをストラップバックX線カセットの中に入れ、ライトをオフにします。

安全ライトをつけ、X線フィルムの箱を慎重に開けます。カセットのスライドの上に、右下隅のギザギザの端を持つように、光沢のある面を上にして1つのフィルムを置きます。次に、ロッキングバーをねじって光を遮断し、カセットをマイナス20°Cで保管しながら、カセットを慎重に閉じます。

適切な露光期間の後、フィルムを現像液に2分間移し、続いてストップバスで30秒間、酢酸を含む二重蒸留水、次に固定液で5分間移します。フィルムを流水のトレイで20分間洗います。サーフェクタントに約10秒間移し、フィルムを吊るして乾かします。

脳組織切片の組織学的解析のために、スライドラックでダッシュの3つの切片を解凍します。次に、切片を脱イオン水で1分間洗浄した後、チオニン染色液で10分間インキュベートし、1つの脱イオン水容器に3回浸します。スライドをさらに30秒間脱イオン水洗浄するためにスライドを沈めます。

次に、スライドを図のように順次エタノール洗浄で洗浄します。最後の100%エタノール洗浄後、スライドをキシレンの2つの容器で3分と5分連続して洗浄します。2回目のキシレン洗浄の終わりに、一度に1つのスライドの上端を樹脂ベースの無機溶剤封入剤で覆います。

24 x 60 mmのカバーをスライドに取り付け、スライドを48時間乾燥させます。次に、スライドをスキャンして、2400DPIグレースケールでコンピューターにフィルムを送ります。デンシトメトリーでフィルムを分析するには、スキャン後、各フィルムの関心領域を経験的に概説します。

スキャンしたフィルムを画像解析プログラムで開いた後に生成される疑似カラー画像です。測定値には、密度、スキャン領域、および総ターゲット領域を含めます。スキャンエリアバーを調整して、各関心領域がハイライトのパラメーターの間に収ま

次に、データをスプレッドシートにエクスポートして、各サンプルに存在する特定のバインディングを決定します。定量用のキャリブレーション標準単位は、アッセイが実施された日付に基づいて決定されます。フィルムをスキャンした後、キャリブレーション値を使用して、その特定のフィルムのヨウ素125標準物質のさまざまな濃度に基づいて曲線を生成します。

キャリブレーション値と標準値は、精度のために3倍で記録されます。非特異的結合と全グループ、および組織標識との区別は、各データセットのデータを適切なサブグループに割り当てることによって確立されます。高いしきい値は、パラメータを赤から黒に調整して設定する必要がありますが、スキャンされた関心領域全体をより正確に測定できるように、低いしきい値をゼロに近づける必要があります。

例えば、ここでは、視床下部の傍脳室核の最終的に測定された領域を、全結合群と非特異的結合群で比較し、解剖学的確認のためにチオニン染色切片と比較します。非特異的結合とは、飽和濃度の非放射性アンジオテンシンI受容体リガンドの存在下で非アンジオテンシン受容体に結合する放射性リガンドの量であり、総結合とは、非放射性アンジオテンシンI受容体リガンドが存在しない状態で結合する放射性リガンドの量です。次に、非特異的結合値を総結合値から差し引いて、アンジオテンシンI受容体の特異的結合値を得ることができます。

一度習得すれば、受容体オートラジオグラフィーのステップは約4時間で完了しますが、フィルムの現像ステップはフィルムあたり約30分かかります。この手順を実行する際には、すべてのスライドが正確に同じ時間インキュベート、すすぎ、乾燥されていることを確認するために、時間を追跡することが重要です。この手順に続いて、脳の形態に関する追加の研究を実施して、アンジオテンシンII受容体の発現を示す領域のサイズの変化を評価することができます。

この技術は、受容体薬理学を研究する研究者が、さまざまな脳領域がさまざまな神経ホルモン、神経伝達物質、および薬物によってどのように影響を受けるかを決定する道を開きました。このビデオを見れば、受容体オートラジオグラフィーアッセイ、組織学的に染色されたスライド、および受容体を特定の脳領域に局在させるためのオートラジオグラムの評価を成功させる方法について十分に理解できるはずです。放射能を扱う作業は危険であり、放射能汚染を避けるために、適切な遮蔽、封じ込め、被ばく監視、廃棄などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。