血管内皮増殖因子の評価のための簡易バイオアッセイ

この簡便な細胞ベースのバイオアッセイの全体的な目的は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）ファミリーのリガンドの活性を検出し、定量し、モニターすることです。この手法は、VEGFファミリーのリガンドが疾患における重要なプロセスを制御している血管生物学、ウイルス学、癌、および眼科学における重要な疑問に答えることができます。このアッセイの主な利点は、特殊な上皮細胞を必要とせずに、さまざまな受容体に結合して架橋させる能力に基づいてVEGFファミリーのリガンドを評価できることです。

対数増殖期のWEHI-3D（IL3分泌細胞株）を5 × 10⁶個、50 mLの新鮮な培地を含む4〜10本のT175フラスコにピペッティングして播種し、培養する。細胞が対数増殖期を過ぎてから約24〜48時間経過するまで、または7日間インキュベートする。その後、フラスコから液量と細胞をデカントして回収する。

1,000 Gsで15分間遠心分離し、細胞および細胞残渣を除去します。その後、上清の90%を除去し、0.22 micronのフィルターユニットでろ過します。アッセイ準備のため、条件付き培地を1 mLずつ分注します。

因子依存性細胞株の継代用培地調製用に50 milliliterずつの分注を行い、20 degree Celsiusでの長期保存用に200 milliliterずつの分注を行います。少量分注分は20 Celsiusで保存してください。コントロールのBAF3細胞は、10% WEHI-3D条件付け培地を含む培地で培養します。

およびVegFR2-EPoR-BAF3細胞を、1 mg/mLのG418を添加した同一の培地で培養します。対数増殖期の細胞から1:15の希釈率で継代します。対数増殖期中期のコントロールBAF3細胞またはVegFR2VPoR-BAF3細胞を回収します。

ピペッティングでフラスコの底から細胞を穏やかに回収し、750 Gsで5分間遠心分離して細胞ペレットを回収します。ペレットを10 mLのマウス用等張リン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、再び750 Gsで5分間遠心分離します。IL3を含む培地を除去するため、この洗浄操作をさらに2回繰り返します。

DEHI-3D調製培地を含まない培地を用いて、細胞を1回洗浄します。偽陽性の結果や高いバックグラウンド活性が生じる可能性があるため、IL3を含む培養液を洗い流し、追加の成長因子が残らないようにすることが重要です。遠心分離して上清を捨てた後、細胞を同じIL3フリー培地を用いて 7.4 × 10⁴ cells/mL の濃度で再懸濁します。

最後に、PBSで希釈したトリパンブルーと細胞懸濁液を等量ずつ混合し、血球計数器に注入します。少なくとも100個の細胞をカウントしてください。色素を取り込んだ細胞は、死細胞または死にかけている細胞とみなされます。

アッセイに使用する細胞がアッセイ条件に確実に反応できるよう、高い生存率を維持することが極めて重要です。適切に校正されたP20自動ピペットとオートクレーブ済みチップを使用し、13.5 µLのIL欠乏培地に懸濁した1,000個の細胞を72ウェルプレートの各ウェルに分注します。分注中は細胞懸濁液を混ぜ合わせ、重力による細胞の沈降で細胞濃度に偏りが出ないように注意してください。

十分に校正されたP2ピペットを用いて、コントロールウェルにIL3不含培地を1.5 µLずつ3連で加えます。軽く混ぜ合わせます。同様の手順で、10% WEHI-3D 条件付培地および100 ng/mL VegFA（IL3不含）コントロールを目的のウェルに加えます。

最後に、テストサンプルを1.5 µLずつ3連に添加します。マイクロウェルプレートの未使用のウェルには、滅菌水、PBS、または培地を満たしてください。ガス透過性容器に水に浸したティッシュペーパーを入れ、ガス交換が可能な加湿チャンバーを作成します。

アッセイプレートをチャンバーに入れ、10%二酸化炭素の加湿雰囲気下で16時間インキュベートします。16時間のインキュベーション後、標準的な倒立位相顕微鏡を用い、40〜100倍の倍率でプレートを分析します。この時点で、陽性サンプルと陰性サンプルを判別することが可能です。

成長因子のサポートがないウェルまたは培地のみのウェルでは、円形細胞の数が減少し、死細胞や死滅しかけている細胞、および細胞破片が見られます。一方、IL3またはVegFR2のリガンドを含む培地で培養した細胞は大きく半透明であり、細胞質内の顆粒状構造や培養液中の細胞破 depanはほとんど、あるいは全く認められません。洗浄した細胞 10,000個を135 µLのIL3欠乏培地に懸濁し、標準的な96ウェルプレートの各ウェルに添加します。

校正済みのP20ピペットを使用して、15 µLのテストサンプルおよびコントロールをウェルに添加します。細胞、成長因子、および/または阻害剤の混合物を、前述と同様に48時間インキュベートします。インキュベーション期間の終了後、プロトコルの本文に記載された方法を用いて、ウェル内の生存細胞数を評価します。

ここでは、VEGF-R2に対する特異性を持つ3種類の組換えヒトリガンド（VEGF-A165、VEGF-C、VEGF-D）の活性を定量するために、VEGF-R2 EPoR BAF3バイオアッセイを用いた試験の結果を示します。活性の定量は、VEGF-A165に対する抑制性モノクローナル抗体であるベバシズマブの存在下、または非中和抗体であるトラスツズマブの存在下で行われました。

データはVEGF-A165単独に対する反応で正規化されました。予想通り、ベバシズマブはアッセイにおけるVEGF-A165の効果を阻害しましたが、VEGF-CおよびVEGF-Dの活性には影響しませんでした。IL3に曝露した細胞は高い生存率を示しました。

一方で、追加の成長因子にさらされなかった群は、生存率が低いことを示しています。この手順を試みる際は、アッセイの前に調製しておく必要のある、条件付き培地中のさまざまな制御剤が存在することを念頭に置くことが重要です。この手法は、血管生物学、ウイルス学、癌、眼科学における再興の道を開き、リガンドにおけるVEG-FMの役割を探索することを可能にしました。

このビデオを視聴することで、バイオアッセイ用細胞の調製方法、バイオアッセイの実施方法、およびVEG-FMリグニン活性の定量または半定量分析の手法について十分に理解することができます。