Name: ソーシャル・コミュニケーションを評価するためにマウスの超音波発声を記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 学ぶマウスの超音波発声記録法。遺伝変異が社会性コミュニケーションに与える影響を神経精神疾患モデルで評価し、mouseTubeデータベースを通じてデータ共有を促進する標準化プロトコルです。

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この作業は、フランス財団、ANR FLEXNEURIM [ANR09BLAN034003]、ANR [ANR- 08-MNPS-037-01-SynGen]、Neuron-ERANET (EUHF-AUTISM)、オレンジ財団、フォンダ・メンターレ財団、フランス財団、ベッテンコート・シューラー財団の支援を受けました。本論文につながった研究は、欧州連合(EU)の第7次フレームワークプログラム(FP7/2007-2013)からの財政的貢献とEFPIA企業の現物寄付で構成される、助成金契約番号115300に基づくInnovative Medicine Initiative Joint Undertakingの支援も受けています。原稿について有益なコメントをくださったJulie Lévi-Strauss氏と、原稿を著しく改善したコメントをいただいた6人の匿名の査読者に感謝します。

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著者らは開示するものは何もない。

ここで紹介するプロトコルは、実験室でマウスの超音波発声を収集するための標準化と信頼性の高い方法を提供しています。これらの非常に制約の状況は、標準化の利点を提示します。彼らは株18,19,26,27内の株または遺伝子型を比較するのに成功して使用されています。代表的な結果に示されるように、これらの方法はShank2のために突然変異したマウスでは非定型社会的コミュニケーション、自閉症スペクトラム障害に関連する遺伝子の同定を可能にします。異なるコンテキスト間で、あるいは研究所間のマウス系統間の比較は、mouseTubeデータベース上でより大きなデータセットの利用可能性によってトリガされます。このツールは、多変量解析を可能にすることにより、マウスの超音波発声の研究を後押しする必要があります。 それは遺伝Cをモデル化研究の大部分で行われているように、ここで記載されているプロトコルは、株内の異なる遺伝子型のマウスをテストするために最適化されています神経精神障害にontribution。実験的に可能な限り最高のコントロールを持つように各研究を設計することが推奨されます。確かに、ごみの影響は、マスクまたは人工的に遺伝的影響28,29を膨らませる可能性があります。各遺伝子型のための同腹のコントロールを含めることが賢明です。それはゴミの中に変異マウスおよび対照マウスの正確なマッチングを可能にするため、繁殖ヘテロ接合の両親は、したがって、好まれるべきです。これは、2日ごとに録音を通じて個人を追跡するために、すべての仔（遺伝子型を知らされていない）のマーキングが足の入れ墨を正当化します。ジェノタイピングは、尾のサンプルを取ることによって、離乳で行われます。上のP2から子犬の分離呼び出しを記録する場合、この操作は補助的な操作と記録セッションに時間的に非常に近いストレスを含んでいるので、我々は、子犬にすでに尾のサンプルを採取することをお勧めしません。 成人の超音波発声を引き出すためにここで提案プロトコルは、EMIの明確な同定を可能にしません。発声のtter。我々は試験動物のモチベーションを操作する理由を説明します。実際、試験マウスは単離されているといない新しいコーナーと試験動物は同性間の相互作用の間に試験ケージに長い時間のために慣らします。男女の相互作用では、導入された女性は、単離されたものではなく、テスト男性は動機は、この性的な文脈で高くなる可能性がありますので、短い時間habituates。モチベーションのこれらの操作は、発声ではなく、導入された1つを放出試験マウスの確率を最大化する必要があります。性的な文脈での男性の超音波発声を記録するには、発情期の雌の新鮮な（ すなわち 、凍結していない）尿と単純な綿棒もケージ30内に導入することができます。この方法は、100％確実にテスト男性に超音波発声の割り当てを可能にするが、それはこれらの発声の排出量の実際の社会的状況に関する特定の情報を収集しないようにします。したがって、我々はprotocoを好みますlは（自由に移動発情メスで）ここで説明します。我々はまた、変異株からマウスをテストするときに常に同じ株から導入されたマウスを使用し、発声マウスのペアとしてデータを分析することをお勧めします。一つの最近の研究では、エミッタ31をローカライズするために三角測量の使用を推進しています。この研究では、女性も男性との遭遇時に超音波発声を放出することが見出されました。これは、記録セッションの前に少なくとも2週間のために単離されたという事実によって説明されるかもしれません。ビデオ録画が適切に同期される場合は、この研究で提案した三角測量の利用の一般化は、それにもかかわらず、ほとんどの場合、発声のエミッタの同定を可能にする必要があります。 開発中に記録された仔マウスからの単離・コールは、寝具からのバックグラウンドノイズによって妨害されていません。通常、自動分析が主な変数を抽出するために非常によく動作します。これとは対照的に、大人から記録された発声がdであります寝具に移動する動物からのバックグラウンドノイズによってisturbed。自動解析が失敗する可能性がありますので、手動分析を使用する必要があります。それにもかかわらず、試験ケージに寝具を追加すると（マウスは好きではないこと）裸地よりも動物にとってストレスの少ないな条件を提供する必要があります。コミュニティのさらなる努力があっても、バックグラウンドノイズを暗示しているものを、様々な条件下での超音波発声の自動検出を向上させることに集中しています。例えば、音声ソフトウェアを手動で背景雑音32が存在しないために選択された発声を分析することを可能にします。このソフトウェアでは、音響変数の抽出は自動ですが、初期手動で選択する必要があります。 個体間変動が、マウスのボーカル動作において非常に重要であることに留意すべきです。例えば、発情期の雌の存在下で、成人男性のコールレートは非常に（ 図1）が配布されます。私たちのsu実験的コンテキストに関連する変動を制限するために、すでに超音波発声を引き出すために、これらの標準化されたプロトコルをggest。それにもかかわらず、我々はデータの平均値及びSEMないだけを提示することの重要性を指摘したいと思いますが、小さなサイズ33のサンプルの中で最も重要なのは個々の点。代表的なデータを収集するために、各グループ/遺伝子型の少なくとも12個体を記録するために - そうでない場合は、必要な - それはまた、非常に関連性があります。多くの場合、個体間変動は、（通常はそれをすることはできません）隠されるべきではない、それは任意の非定型表現型を示す研究の遺伝的変異を保有するではなく、個人を識別するために非常に重要であるかもしれません。このような個体は、遺伝性疾患の治療のための新しい経路を開くことがあります補償、についての手がかりを提供することができます。 精神神経疾患、ボーカルの行動や社会的接触のためのマウスモデルのほとんどの行動の特徴付けで検討されていますエド離れて（ 例えば 、19,27,34,35）。最近の分析方法は今（例えばMiceProfilerを使用して）相互作用36、ならびにオーディオ録音からのデータと、この分析を組み合わせる可能性の間に社会的なイベントとイベントのシーケンスの半自動詳細な特徴づけを提供しています。この方法の主な利点は、より正確に社会的コミュニケーションの側面が影響を受けているかを識別するために、ASDのマウスモデルにおいて、社会的コミュニケーションの包括的なビューを提供することにあります。現在のプロトコルでは、同期はまだマニュアルですが、これはオーディオ録音ソフトウェアを介してビデオ録画をトリガすることによって改善することができます。分析のこのタイプは、精神神経疾患のマウスモデルにおけるソーシャルコミュニケーション障害のより包括的なビューを提供するための標準となるべきです。また、今までの、ボーカル信号は主にエミッタ側から分析している（ すなわち 、テストはVOの排出量を優先するように構築されていますテストしたマウスによるCAL信号は、本プロトコルのように）。焦点は、今も、より良いこれらの音響信号の機能を識別するために、これらの信号の受信機に設定する必要があります。これはまた、（例えばMiceProfilerを使用して）、成人に存在するプロトコルで新しいコーナーマウス36の動作を評価することによって、再生実験16を使用して、または新しいプロトコルを設定することによって行われるべきです。実際、本プロトコルは、マウスでの発声放射の正確な動物行動学の条件を反映していない可能性があり、非常に制約された状況を提供します。超音波発声の自然放出は、マウスの自発的なボーカルの行動に、より多くの光を当てるために連続的なオーディオおよびビデオ録画を使用して、より良い特徴づけする必要があります。

神経精神障害の患者は通常、社会的コミュニケーションの欠損を表示する（ 例えば 、自閉症スペクトラム障害、統合失調症、またはアルツハイマー病患者）1。遺伝子操作されたマウスは、より多くのであり、より頻繁に、これらの障害2の遺伝的原因をモデル化するために使用されます。これらのマウスモデルにおいて、社会的コミュニケーションを研究することは、非定型社会的機能不全につながる遺伝子変異のメカニズムを理解するための、新しい治療法をテストするために高い関心があります。マウスは社会的動物であり、嗅覚、触覚、視覚と音響信号を使用して、お互いに通信するので、彼らは社会的コミュニケーションを評価するのに適したモデルです。 マウス超音波発声は、今現在、3,4声帯通信障害の遺伝的基盤をモデル化するためのプロキシとして使用されている（しかし、この種で発声学習の存在は、最近の研究はにargU場合であっても、5,6をまだ議論されて発声学習7）の不在のための電子。実験用マウスは、（参照して見直さ8）、同性社会的相互作用では、男女の社会の性的相互作用に、母子の関係の中での超音波発声を放出することが見出されていると若年若年社会的相互作用9インチ仔マウスは、ダムや同腹子10から分離された生活の最初の2週間の間に分離・コールを発します。男性は時発情メス（または彼女からの尿の合図）11,12の存在下で超音波発声を発します。同性13,14の未知の同種と相互作用する場合、男性と女性は、超音波発声を放ちます。組織とこれらの発声の機能は完全には明らかではなく、さらなる調査が必要です。機能面での現在の知識は、子犬の分離・コール、成人男性vocalizatに向け成人女性の近接の円滑化を聞いた母親における検索行動の誘発に限定されていますイオン15と成人女性発声16を聞い成人男性の増加探索行動。 精神神経疾患のマウスモデルでボーカル通信の異常を特徴づけることは、実験条件の主要な貢献を除外するために標準化された条件で実施されるべきです。同時に社会的相互作用や神経生物学の研究の評価と組み合わせたこのような特徴付けは、様々な遺伝的モデルでマウスの超音波通信の異なる側面への遺伝的寄与に関する知識を向上させる必要があります。長期的に、それは、ヒトにおける社会的コミュニケーションのいくつかの神経生物学的基盤の更なる光を与える必要があります。我々は現在、確実に、実験室でのオスとメスのマウスの両方のために開発中および成人期に超音波発声を引き出すために、単純なプロトコルを提供することを目指しています。このようなプロトコルは、より確実ultrを比較するために記録の標準化を容易にする必要があります株と研究所間asonic発声の排出量。また、マウスの超音波発声の録音との経験を有していない実験室で、このような記録の設定アップを促進すべきです。また、社会的な障害でだけでなく、超音波発声の排出の状況に重要な情報を得るために、成体マウスにおける社会的相互作用の間に同時に収集され、詳細な行動データを用いて超音波発声のデータを結合するために、現在の可能性を強調表示します。このような分析は、マウスの超音波発声の組織と機能に新たな光を当てるます。最後に、我々はまた、mouseTubeデータベース （http://mousetube.pasteur.fr）上の全体の科学界で超音波発声の録音を共有する可能性をアドバタイズします。録音データへのオープンアクセスは、科学者たちは、他のラボに記録されている超音波発声で自分のデータを比較できるようにすることで、マウスの超音波通信に関する知識を高める必要があります（類似のまたは異なる株/プロトコルと）ratories、および/または異なる条件下で記録されたファイルとその分析方法に挑戦します。

<table><tbody><tr><td>針 0.3mm x 13 mm [30&nbsp;G 1/2"]</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>-</td></tr><tr><td>緑のタトゥーペースト</td><td>ケッチャムマニュファクチャムマニュファクチャム株式会社、オタワ、カナダ</td><td>329AA-</td><td></td></tr><tr><td>温度計</td><td>フィッシャーブランド、ウォルサム、米国</td><td>4126 (W255NA)</td><td>-</td></tr><tr><td>自作防音室 (子犬)</td> パス<td>ツール研究所、パリ</td><td>-</td><td>音響フォーム + プレキシガラス; 内寸 (幅 x 高さ x 奥行): 32 cm x 33 cm x 32 cm</td></tr><tr><td>小さな表面サーミスター+シングルプローブ熱電対</td><td>ハーバード装置</td><td>599814+</td><td></td></tr><tr><td>601956臭いのないペン</td><td>など:水で作られたジョット</td><td></td><td>インク、洗える:これらのペンは赤ちゃんのために設計されています</td></tr><tr><td>エタノールアブソリュート(100%)</td><td>シグマアルドリッチ、&nbsp;Saint-Quentin Fallavier、フランス</td><td>24103</td><td>希釈 1/10</td></tr><tr><td>コンデンサー超音波マイク Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPA</td><td>Avisoft Bioacoustics、ベルリン、ドイツ</td><td>#40011</td><td>Avisoft company</td></tr><tr><td>Ultrasound Gate 416H</td><td>Avisoft Bioacoustics、ベルリン、ドイツ</td><td>#34163</td><td>サウンドカード</td></tr><tr><td>Avisoft レコーダー USGH</td><td>Avisoft Bioacoustics、ベルリン、ドイツ</td><td>#10301; Windows</td><td>Vista、7 および 8</td></tr><tr><td>Avisoft SASLab Pro</td><td>Avisoft Bioacoustics、ベルリン、ドイツ</td> <td>#10101、10111、#10102、10112 の録音ソフトウェア。&nbsp;</td><td>Windows 10、8.1、8、7、Vista(Boot Camp、Parallels、または同様の仮想化ソフトウェアを実行しているIntelベースのApple Macintoshを含む)。</td></tr><tr><td>Boot Campを実行しているラップトップまたはApple Macintosh</td> <td>-</td><td></td> <td>Windows 10、8.1、8、7、またはVistaを実行している。Apple Macintoshの場合、Boot Campは、メモリの制約により、Parallelsなどの仮想化ソフトウェアよりも好まれ</td></tr>ます。<tr><td></td><td>ロック、チャッツウッド、アメリカ</td><td>HPL932D</td><td>ロック&ロックスタッカブル気密コンテナラウンド700&nbsp;ミリリットル;カバーなしで使用してください。寸法: 9&nbsp;直径 cm 、高さ 10 cm</td></tr><tr><td>PBS 1x (pH = 7.4)</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10010-023-slides</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Menzel-Gl&auml;ser、Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Superfrost Plus</td></tr><tr><td>May-Gr&uuml;nwald溶液500ml</td><td>RAL R&eacute;actifs、マルティヤック州、フランス</td><td>320070-0500-Giemsa</td><td></td></tr> <tr><td>R 500 ml</td><td>RAL R&eacute;actifs, Martillac, France</td><td>720-1107</td><td>diluted 1/20 in phosphate buffer solution</td></tr><tr><td>phosphate buffer solution (self-made)</td><td>-</td><td>-</td><td>pH = 7, 0.1 M: 39 ml NaH2PO4 0.2 M + 61 ml Na2HPO4 0.2 M + 100&nbsp;ml H2O (最終容量: 200&nbsp;ml)</td></tr><tr><td>テストケージ</td><td>Institut Pasteur,</td> <td>Paris-50</td><td>&nbsp;x&nbsp;25&nbsp;cm、30&nbsp;cmの高さ;プレキシガラス自</td></tr><tr><td>作防音室(アダルトレコーディング)</td><td>Institut Pasteur,</td> <td>Paris-acoustic</td> <td>foam + PVC; 内寸 (W x H x D): 66 cm x 90 cm x 46 cm</td></tr><tr><td>video camera</td><td>From Noldus Information Technologies, Wageningen, The</td><td></td> <td>Netherlands-high-resolution CamTech Super-Hi-Res video camera; 25 fps&nbsp;</td></tr><tr><td>EthoVision XT</td><td>Noldus Information Technology、ワーヘニンゲン、オランダ</td><td>http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt</td><td>ビデオ取得ソフトウェア</td></tr><tr>ICYプラットフォーム <td>Bio Image Analysis, Institut Pasteur, Paris</td><td>http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker</td> のビデオ取得ソフトウェア<td>Mice Profiler Tracker プラグイン</td> 社会的<td>相互作用中の行動イベントを分析するための追跡ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

ソーシャル・コミュニケーションを評価するためにマウスの超音波発声を記録

Recording Mouse Ultrasonic Vocalizations to Evaluate Social Communication

マウスは、発達中および成人期のさまざまな状況で超音波発声を発します。これらの音声信号は、現在、音声コミュニケーション障害の遺伝的基盤をモデル化するためのプロキシとして使用されています。自閉症スペクトラム障害などの神経精神障害に関連する遺伝子に変異を持つマウスモデルの発声行動を特徴づけることは、社会的コミュニケーション障害につながるメカニズムを理解するのに役立ちます。ここでは、子犬や成体マウスで超音波発声を確実に引き出すためのプロトコルを提供します。この標準化は、実験設定による研究間のばらつきを減らすのに役立ちます。子犬の隔離呼び出しは、ダムや同腹仔から隔離された個々の子犬から開発全体を通じて記録されます。成人期には、同性間の相互作用(性的要素なし)中に、社会的に動機付けられた男性または女性を未知の同性同性にさらすことにより、発声が記録されます。また、発情した女性に曝露された成人男性の発声を記録するためのプロトコルも提供しています。この文脈では、相互作用には性的な要素があります。これらのプロトコルは、実験用マウスで大量の超音波発声を誘発するために確立されています。しかし、マウスの発声行動には重要な個体間変動性があることを指摘しており、これは最小限の個体数(各条件で少なくとも12人)を記録することで考慮に入れる必要があります。これらの超音波発声の録音は、通話率、声のレパートリー、および通話の音響構造を評価するために使用されます。データは、同期ビデオ録画の分析と組み合わされて、マウスのソーシャルコミュニケーションについてより完全なビューを提供します。これらのプロトコルは、自閉症スペクトラム障害に関連する遺伝子であるProSAP1/Shank2を欠損したマウスの音声コミュニケーション障害を特徴付けるために使用されます。より多くの超音波発声録音は、そのようなデータの交換を促進するために開発されたmouseTubeデータベースでも見つけることができます。

現在のプロトコルでは、我々はProSAP1 / Shank2、自閉症スペクトラム障害（ASD）23-25 ​​に関連する遺伝子を欠損したマウスのボーカル挙動を特徴とします。 ASDは、社会的コミュニケーションの欠損や常同行動1によって特徴付けられます。私たちのShank2 - / -マウスは多動、不安の増大および非定型ボーカル通信18,26を示しました 。 。マウスは、それらの野生型同腹子における典型的な逆U字カーブと比較して、子犬の分離・コールのその排出率の非定型発達のプロフィールを表示Shank2 - - / -確かに、我々はShank2ことに注意/ -マウスでは増加したコールレートを表示しましたP4において、それらの野生型同腹仔（ 図2）と比較してP6速度を呼び出す減少。 comparisoにメス- / -我々はまた、Shank2を伴う女性の相互作用に減少したコールレートを観察しました野生型同腹子（ 図2）を含む相互作用を有するN。私たちは、5種類のコールカテゴリのレパートリーを調べました。 （P2、P6とP10ここで例えば）仔の間で異なるように思われ、大人（ 図3）。遺伝子型関連の相違点は、主に成人期に有意でした。 - / -大人Shank2伴う社会的相互作用の間、C57BL / 6Nの女性と男性または女性を、より短い通話や非構造化の呼び出しは、それらの野生型同腹仔（ 図3DおよびE）を含む相互作用と比較して記録しました。 Shank2 + / +メス（ 図3E）を含む相互作用と比較して、女性- / -それほど複雑コールと周波数は電話も大人Shank2を含むC57BL / 6Nの女性との相互作用中に記録されたジャンプします。最後に、我々はまた、手動で音響の変数を測定しました。有意な遺伝子型関連の相違デュはありませんでしたリングの開発。対照的に、成人Shank2が関与する相互作用の間に記録されたコールの継続時間は、 - / -メスは、その野生型同腹仔（ 図4A）を含む相互作用の中に記録されるものよりも短かったです。また、超音波発声のピーク周波数が重要な遺伝子型関連の相違26せずに子犬の開発中に増加したことを強調しました。 Shank2が関与する相互作用の間に- / - C57BL / 6Nの女性と男性または女性は、超音波発声は、それらの野生型同腹仔（ 図4B）が関与する相互作用の中に記録されたコールと比較して低いピーク周波数を持っていました。 また、本プロトコルはMiceProfiler（ICYソフトウェア、研究所過去から抽出された行動データにオーディオ録音からのデータを組み合わせることにより、超音波発声の放出の文脈を検討することができユーロ、パリ）。動物が接触し、新コーナーの肛門性器領域を盗聴より具体的には、乗員にいたとき、例えば、雌同士の相互作用で、ほとんどの超音波発声は放出された、あるいは少なくとも乗員が新コーナーの後ろにあります。乗員が新コーナー（ 図5、上パネル）に近づいた時に、マウスはまた、多くの超音波発声を発せられました。 - / -マウス乗員が野生型マウスであったときよりも（新コーナーの肛門性器領域にスニッフィング、 例えば ）新コーナーと物理的に接触していた乗員Shank2が時より少ない発声を記録しました。それは野生型マウスであった場合よりもマウス- / -新コーナーの後ろに乗員がShank2をしたときに以下の発声がトリガされました。より多くの発声はまた、変異体（ 図5、下のパネル）よりも新しいコーナーが乗員マウスの視野にいたときに記録され、より多くのように野生型でました。 キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;&gt;：FO S = &quot;jove_content&quot; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig2.jpg" /> 図2：開発中および成体のオスとメス Shank2 における超音波発声の排出率 - / - マウスおよび野生型同腹子仔の割合呼び出します（2日毎P2からP12に、N = 18-19 Shank2 + / +、 n = 15-16 Shank2 - / - ）と成人男性発情メスの相互作用（N = 15 Shank2 + / +の間に、N = 16 Shank2 - / - ）と雌同士の相互作用（N = 15 Shank2 + / +、N = 13 Shank2 - / - ）は、野生型マウス（左パネル）およびShank2 - / -マウス（右パネル）。データは平均値として提示されている+/- SEM及び個々の点（非対ウィルコクソンのテスト：* p &lt;0.05、** P &lt;0.01、*** P &lt;0.001）。ge.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig3.jpg" /> 図3：Shank2のボーカルレパートリー - / - マウスと野生型同腹子 P2仔によって放出された五つの異なるコール・タイプの割合（; N = 20 Shank2 + / +、N = 18 Shank2 - / - ）、P6仔。 （B; N = 19 Shank2 + / +、N = 18 Shank2 - / - ）、P10仔（C; N = 20 Shank2 + / +、N = 18 Shank2 - / - ）、発情メスと成人男性（D ; nは= 16 Shank2 + / +、N = 16 Shank2 - / - ）と成人女性、別の女性（Eであり; n = 15 Shank2 + / +、N = 13 Shank2 </eM&gt; - / - ）は、野生型マウス（左パネル）およびShank2で- / -マウス（右のパネル）。 ：（* P &lt;0.05、** P &lt;0.01、*** P &lt;0.001カイ二乗検定）。データは平均+/- SEMおよび個々の点として表示されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig3large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig4.jpg" /> 図4：Shank2における超音波発声から抽出されたアコースティック変数 - / -すべてのコールタイプのマウスと野生型同腹子 （A）期間は、P2仔（N = 20 Shank2 + / +、N = 18 Shank2によって放出された混乱します- / - ）、P6仔（N = 19 Shank2 + / +、N = 18 Shank2 - / - ）、P10仔（N = 20 Shank2 + / + </sアップ&gt;、N = 18 Shank2 - / - ）、大人の発情メスとオス（N = 16 Shank2 + / +、N = 16 Shank2 - / -別の女性との）および成体の雌（N = 15 Shank2 + / +、 n = 13 Shank2 -野生型マウスにおける）（左パネル）およびShank2 - / - / -マウス（右パネル）。すべてのコールタイプで測定（B）最大ピーク周波数は、別の女性（同じNsの上記のような）との発情メスと成人女性とP2仔、P6仔、P10仔、成人男性で混乱しました。データは平均として提示されている+/- SEMおよび個々の点を（非対になったウィルコクソンのテスト：* P &lt;0.05、** P &lt;0.01、*** P &lt;0.001）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53871/53871fig5.jpg" /> 図5：コンテキストメス-メスの成体の社会的相互作用におけるマウスの超音波発声の発光のC57BL / 6NマウスとShank2 + / +を含むペアによって放出された超音波発声の割合（N = 16、A）とShank2を含むペア- 。/ -とC57BL / 6Nマウス（N = 13、B）行動イ ​​ベント（赤：乗員、緑：新コーナー）：次のタイプの中に社会的接触、乗員のマウスから口-経口接触、肛門性器スニッフィング、ano-乗員の背後に新コーナーマウスからスニッフィング性器、新コーナーの後ろに乗員、新コーナー、乗員の不動、乗員からの新コーナー、アプローチの不動＆新コーナーから新コーナー、アプローチから脱出＆乗員新コーナーの視野の乗員、乗客の視野での新コーナー、新しいコーナ以下、乗員、アプローチから脱出＆乗員、アプローチから逃れる＆新コーナーからの脱出。データは、pです憤慨、平均+/- SEM及び個々の点（非対ウィルコクソン検定：* p &lt;0.05、** P &lt;0.01）。未発表のデータ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53871/53871fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> コールタイプ </td><td> 説明 </td></tr><tr><td>ショート</td><td>期間≤5ミリ秒と周波数範囲≤6.25kHzの</td></tr><tr><td>シンプル</td><td>周波数範囲で一方向のみで期間&gt; 5ミリ秒と周波数範囲≤6.25キロヘルツ（フラット）、または周波数変調（上方または下方）&gt; 6.25 kHzの</td></tr><tr><td>複雑な</td><td>周波数の複数の方向及び周波数範囲&gt; 6.25キロヘルツで変調（変調）、または1つ以上の追加の周波数Cの封入creationCompleteコンポーネント（高調波または非線形現象が、飽和なし）が、周波数範囲に制限なし（複雑な） </td></tr><tr><td>周波数ジャンプ</td><td> 1ジャンプ（1周波数ジャンプ）の包含またはそれ以上のジャンプ（混合）で、連続した周波数成分間の時間差なしで周波数（周波数は、他のジャンプ）や純音コール内の任意のノイズの多い部分なし</td></tr><tr><td>体系化されていません</td><td>全く純粋なトーン成分の識別可能なありません。 「騒々しい」コール</td></tr></tbody></table> 表1：マウスの超音波発声の5種類の特性マウスの超音波発声内の5つの異なるコールタイプを決定するために使用される持続時間、周波数範囲、周波数変調と周波数ジャンプの基準の例。

マウスの超音波発声は、神経精神障害のマウスモデルにおける発声コミュニケーション障害の遺伝的基盤をモデル化するためのプロキシとして使用されます。本プロトコルは、子マウス(発生全体)および成体マウス(同性相互作用、雄発情雌相互作用)から超音波発声を確実に引き出す3つの実験的状況を説明しています。

Mice emit ultrasonic vocalizations in different contexts throughout development and in adulthood. These vocal signals are now currently used as proxies ...

このプロトコルの全体的な目標は、マウスの子犬または成体からの超音波発声を記録して分析し、そのデータをmouseTubeデータベースで公開することです。そのため、以前に自閉症の突然変異を特定したので、今ではこれらの遺伝子の役割を理解したいと考えています。私たちはマウスモデルを使用しており、特にマウスの超音波発声に注目しています。このモデルは、神経科学分野における重要な問題を理解するのに役立ちます。例えば、自閉症などの神経精神病性障害のマウスモデルにおいて、遺伝子変異が社会的コミュニケーションにどのように影響するか。このプロトコルの主な利点は、マウスのアドレッシング発声が確実に誘発されることです。これは、研究間の比較を改善するために、コンテキスト情報の標準化を優先する必要があります。この方法は、mouseTubeデータベースを使用したマウス音速通信に関する知識も向上させます。マウスを準備し、生まれたばかりの子犬を手に入れたら、彼らの鳴き声を録音するためのケージを設置します。防音ボックスまたは発泡スチロールボックスを使用してください。まず、内部温度を監視するための温度計をセットアップします。次に、ボックス上部の穴を通して、コンデンサー超音波マイクを下げて、マイクの膜が床から約12〜15センチメートル上にくるようにします。次に、マイクをコンピューターのサウンドカードに接続します。実験していない子犬を録音ボックス内の清潔なプラスチック製の子犬ホルダーに入れ、閉じます。ピーク録音サウンドが歪みなく利用可能な最大振幅を使用するようにします。実験中はこの設定を変更しないでください。さて、実験的な測定のために、子犬をできるだけ優しく、素早く清潔なプラスチックカップに入れます。次に、子犬をマイクの下に置き、できるだけ優しく静かに箱を閉じます。次に、16ビット、300キロヘルツの録音を行い、高品質のデータセットを作成します。最大5分間の録音後、子犬を取り出します。その足の入れ墨に注意し、次にデジタル温度計で皮膚温度を測定します。次に、水性インクを使用して子犬に小さな印をつけ、巣に戻します。テストの合間に、10%エタノールを使用してカップを洗い、完全に乾かします。成人用テストケージには、低強度の白色光で照らされた防音ボックスに収まるプレキシガラス製ケージを使用します。ケージを石鹸水できれいにし、乾かし、2センチメートルの新鮮な寝具で満たします。マイクをケージの片隅に固定し、マイクの角度を調整してケージ全体から音をキャプチャします。次に、ビデオカメラを防音チャンバーの上に置いて、マイクがコーナーを覆い隠さないようにテストケージの表面を表示します。実験的でない動物のペアを使用して、前と同じように録音のゲインを設定します。実験では、最初に1匹の動物をケージに導入して、乗員の役割を果たします。20分間慣れさせます。この間にベースライン記録が行われる場合があります。次に、ビデオとオーディオの録音を開始し、同性の2番目の動物を紹介して新人の役割を果たします。ケージに2回目のタッチでビープ音を鳴らすことで、録音を同期させます。動物の相互作用を必要なだけ(4分間など)記録します。このテストの準備として、テスト日の早朝に、各女性から膣塗抹標本を採取して、発情周期の状態を判断します。メスの尻尾をつかみ、ケージのグリッドをつかませます。ピペットを使用して、20マイクロリットルのPBSを注入して回収することにより、彼女の膣を数回すすぎます。PBSが膣から洗い流されるときに注意してください。少し曇っているときは、十分なセルが含まれています。粘液を作らないように、これを慎重に行ってください。サンプルをスライドに広げます。一度に4つまで調べることができます。先に進む前に、サンプルを乾かしてください。ドラフトの下で、スライドをPBS中の0.1モルのMay-Grunwald溶液の浴中で3分間インキュベートします。次に、スライドをPBSバスに1分間移します。次に、スライドをPBS中の体積重量5%のGiemsa Rの浴に移します。10分後、スライドを新しいPBSでさらに1分間すすぎます。次に、染色されたスライドを調べます。サンプルが核を持たず、青く染まる大きな角化した上皮細胞のみを示している場合、女性は完全に発情しています。そのような女性だけがテストに使用できます。次に、男性を乗員としてテストケージをセットアップします。彼に10分間慣れさせ、必要に応じてベースラインのオーディオ録音をします。次に、ビデオとオーディオの録音を開始し、完全に発情している女性を紹介します。ビープ音を使用して、前と同じようにレコードを同期します。次に、動物たちを必要なだけ、例えば4分間など、相互作用させます。録音が完了したら、マウスをそれぞれのケージに戻します。パスツール研究所のmouseTubeウェブサイトにデータをアップロードするには、まずログインしてください。から記録されたマウス系統がmouseTubeデータベースに存在するかどうかを確認するには、Strainsボタンをクリックしてください。そうでない場合は、管理者に作成を依頼してください。次に、動物の被写体を作成します。記録された動物の識別コードを入力します。それらをグループに集めて、後でデータを取得しやすくします。次に、使用されるプロトコルの説明を入力します。次に、レコーディング セッションごとに実験を作成します。プロトコル、記録された個人のグループ、使用されたハードウェアとソフトウェア、およびそれらの特異性を指定します。この実験では、発声ファイルに対応するすべてのメタデータが収集されます。次に、発声ファイルへのリンクを作成します。まず、リスト内の実験を選択します。次に、音声ファイルのURLをコピーして、[リンクするファイル]列の対応するフィールドに貼り付けます。このデータベースに配置しているリンクが実際には適切でない可能性があります。発声ファイルをホストしているサーバーが、コミュニティのメンバーのために所属機関の外部からアクセスできることを確認してください。[詳細] の [メモ] セクションで、必要に応じて提供します。たとえば、オーディオ ファイルに付随するビデオ ファイルへのリンクが入力されたことを指定します。最後に、入力を行った後、それらを検証します。ファイルごとに各ボックスに入力する必要はありません。必要に応じて、入力したリンクを変更します。自閉症スペクトラム障害に関連する遺伝子であるShank2の発現を欠くマウスを特徴付けました。これらのマウスは、非定型的な音声コミュニケーションを示し、最初に雌の相互作用における通話率の低下として観察されました。次に、子犬期から成年期に変化する5つの鳴き声の標準的なレパートリーが評価されました。測定は最初にP2の子犬で行われました。ボーカルのレパートリーはP6の子犬でも変わりませんでした。P10では、ボーカルのレパートリーは変わらなかった。この時点まで、Shank2 nullマウスには大きな差は見られませんでした。しかし、成人期になると、遺伝子型に関連する違いが明らかになりました。発情期のオスがメスと対話すると、突然変異したオスによる短くて構造化されていないコールの割合が顕著に増加しました。女性間で聞こえる通話パターンでは、Shank2 nullの女性は、通常の女性とペアになった場合、より短く構造化されていない通話を発し、複雑でない通話と頻度のジャンプ通話を発しました。雄または雌のShank2ヌルマウスのペアは、野生型の同腹仔のペアと比較して低いピーク周波数で発声されました。行動イベントと発声放射の解析を同期させることで、変異マウスにおける超音波発声の放出の文脈における障害の同定を可能にした。Shank2 nullマウスは、新参者と物理的に接触しているとき、特に肛門性器領域を嗅いでいるときに発声する頻度が少なかった。新参者がShank2ヌルマウスの視野にいたときに、より多くの発声が聞こえました。このビデオを見た後、マウスの超音波発声を記録する方法と、mouseTubeデータベースにデータをアップロードする方法をよく理解しているはずです。この手順を試みる際には、マウスの声帯の高さと内部生存率を考慮して、十分な数の個別プレコンディショニングを記録することを忘れないでください。

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JoVE Journal

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行動

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学ぶマウスの超音波発声記録法。遺伝変異が社会性コミュニケーションに与える影響を神経精神疾患モデルで評価し、mouseTubeデータベースを通じてデータ共有を促進する標準化プロトコルです。

ソーシャル・コミュニケーションを評価するためにマウスの超音波発声を記録

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