胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

これらのクロマチン免疫共沈降法を分化中の胚性幹細胞や心臓胚組織に適用する全体の目的は、心臓形成におけるエピジェネティックな制御を明らかにすることです。胚の心臓形成過程における遺伝子転写の微調整は、エピジェネティックな構成要素によって制御されているため、クロマチン免疫共沈降法はこのプロセスを理解するための適切なアプローチとなります。

この手法の主な利点は、特定の遺伝子座を特異的に標的とし、その特定のDNA断片上に存在するエピジェネティックな標識を調べることができる点にあります。この方法は、心臓の発達におけるエピジェネティックな制御に関する知見を提供します。また、他の器官やあらゆる細胞型にも適用可能です。

こちらはImenです。彼女はこの研究室の博士課程の学生で、本日の実験を担当します。この手順では、胚性幹細胞（ES細胞）を使用します。

ES細胞から作製した胚様体およびE9.5マウス胚から摘出した胚心臓組織。細胞および組織を固定する。細胞にはPBS中の1% formaldehydeを、胚組織にはPB2透過化バッファーを使用する。

チューブをオービタルシェーカーに設置し、室温、60 RPMの速度で正確に10分間振盪します。グリシンの最終濃度が125 millimolarになるように加えて架橋反応を停止させ、オービタルシェーカーを用いて室温、60 RPMで5分間インキュベートします。この手順を開始するには、ペレットを10 millilitersのPBSに再懸濁してください。

そして、1 mLのPB2に胚組織を加えます。4 °Cで1000 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、2回目の洗浄のためにそれぞれのバッファーを加えます。

氷上で、バッファーPB1およびPB2にプロテアーゼ阻害剤を添加します。プロテアーゼ阻害剤を添加したバッファーPB1を1 mL加え、ピペッティングして細胞を再懸濁します。同様に、プロテアーゼ阻害剤を添加したバッファーPB2を1 mL加え、胚組織を再懸濁します。

その後、21ゲージの針を装着した1 mLシリンジを用いて、細胞または組織を均質化します。細胞懸濁液を清潔な1.5 mLチューブに移します。均質化した細胞および組織を4 °Cで10分間インキュベートします。

4°Cで3000 ×g、5分間遠心分離します。上清を捨て、各ペレットをプロテアーゼ阻害剤を添加した各超音波処理用バッファー300 µLで再懸濁します。DNAの分解を防ぐため、細胞懸濁液を認定済みのRNase、DNase、およびパイロジェンフリーチューブに移し、氷上で15〜30分間インキュベートします。

クロマチンをせん断するため、各試料に適したソニケーションプログラムを用いて4 °Cで超音波処理を行います。DNAをPCRに使用するか、あるいはシーケンシングに使用するかによって、ソニケーションの時間を調整してください。次に、超音波処理した細胞溶解液を10分間遠心分離します。

各サンプルから、クロマチンが溶解している上清を清潔な1.5 milliliterチューブに移し、ペレットを廃棄します。各サンプルから1.5 microliter分を分注し、水で1:10に希釈します。ナノ分光光度計を用いて全サンプルの光学密度を測定し、タンパク質濃度を決定します。

クロマチン免疫沈降に先立ち、プロトコルの説明に従って洗浄し、プロテインA結合ビーズを準備します。清潔な1.5 mLチューブに、修飾ヒストンまたは転写因子に対する抗体、洗浄済みプロテインA結合ビーズ 20 µL、およびプロテアーゼ阻害剤を添加したバッファーC 1 mLを混合します。サンプルをローテーターを用いて40 RPMで、4 °Cで少なくとも2時間インキュベートします。

プロトコルの本文に記載されている通り、抗体ビーズ複合体を1 mLのバッファーCで3回洗浄します。2本のチューブを用意し、一方に150 µgのクロマチンと抗体ビーズ複合体を、もう一方に150 µgのクロマチンと20 µLの洗浄済みビーズを分注します。それぞれのチューブにプロテアーゼ阻害剤を添加した1 mLのバッファーCを加え、サンプルを回転ディスクを用いて40 RPMで、4 °Cで一晩インキュベートします。

一晩の免疫沈降が完了したら、サンプルをマグネティックラックにセットし、未結合の抗体クロマチンを含む上清を回収します。洗浄済み試料に150 µLの緩衝液D1を加えて、抗体結合タンパク質を溶出させます。サンプルをヒーティングブロックを用い、50 °Cで20分間インキュベートします。

20分後、サンプルをヒーティングブロックから取り出し、マグネットラックに設置します。上清を清潔な1.5 mLチューブに回収し、ビーズを廃棄します。架橋を解除するために、5 Mの塩化ナトリウムを上清に加え、最終濃度を200 mMにします。

清潔な1.5 mLチューブに、インプット用のクロマチン試料を調製します。免疫沈降試料と同量のクロマチンを、RNaseおよびDNaseフリーの水と5 M 塩化ナトリウムを用いて、最終的に200 mMの濃度になるように最終容量150 µLで調製します。試料を65 °Cで一晩インキュベートします。

翌日、サンプルをヒーティングブロックから取り出します。EDTAを最終濃度12.5 millimolar、Proteinase Kを最終濃度250 micrograms per milliliterになるように加え、55 degree Celsiusで2時間消化させます。まず、ビーズを準備してこの手順を開始してください。

まず、ビーズを室温で30分以上静置させます。次に、ビーズを十分にボルテックスし、1 mLのビーズを清潔な1.5 mLチューブに素早く分注します。ビーズの入ったチューブをマグネットの上に2～3分間置き、溶液が透明になったことを確認して上清を捨てます。

チューブをマグネットから取り出します。0.5 M EDTAを1 mL加え、短時間ボルテックスして混ぜ合わせます。この手順でビーズを2回洗浄し、最後の洗浄後に上清を捨てます。

チューブをマグネットから取り出します。1 mLのバッファーEを加え、ビーズをゆっくりと再懸濁させます。混合液全体を50 mLのバッファーEに移します。シェーカーに設置し、室温で1時間ゆっくりと混合させます。

続いて、1 KB DNAラダーと、ビーズ量に対するDNA量の3種類の異なる比率を用いて、DNA結合ビーズのテストを行います。検証の結果、DNA結合には2.5/1の比率が最適であることが判明しました。DNA精製にビーズを使用する場合は、各DNAサンプルに425 µLまたは2.5ボリュームのビーズを加え、ピぺッティングで10回ほどゆっくりと再懸濁してください。

室温で10分間インキュベートします。マグネット上に5分間静置します。その後、上清を吸引して廃棄します。

各チューブに600 µLの調製直後の80% ethanolを加え、2回洗浄する。1分間待機した後、上清を吸引して除去する。チューブを短時間遠心する。

チューブをマグネットの上に置きます。エタノールの最後の一滴まで取り除き、室温で1分間乾燥させます。サンプルをマグネットから取り外し、20 µLのDNaseおよびRNaseフリー水を加えてDNAを溶出させます。ボルテックスします。

マウスES細胞、胚様体、および胚心臓組織から抽出した超音波処理済み全DNAを逆架橋した後、アガロースゲル電気泳動により得られたDNA断片のサイズを確認した。本クロマチン免疫沈降実験は、ES細胞が中胚葉細胞へと分化する際の、野生型または遺伝子変異細胞における上皮間葉転換遺伝子のエピジェネティックな制御を調べるために設計された。修飾ヒストンの結合は、E-CadherinおよびTwist遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーのPCRによってモニタリングした。

ヒトES細胞株4種類から抽出したクロマチンを用い、クロマチン活性化マークに対する抗体、続いて抑制マークに対する抗体を使用して、連続クロマチン免疫沈降を行いました。これらのマークは、細胞が形態形成因子にさらされると修飾されますが、その程度はヒトES細胞株によって異なります。これは、おそらく由来となった元の胚盤胞の違いによるものと考えられます。

クロマチン免疫沈降は、胚の心臓の特定領域から抽出したクロマチンにも適用できます。この図は、修飾ヒストンの濃縮が見られた心臓遺伝子およびNkx2.5とTBx5のゲノム領域と、心室では発現しておらず濃縮も見られなかった心拍調節細胞特異的遺伝子Shox2のゲノム領域を示しています。習得すれば、適切に実施することでこの手法は3時間で完了させることができます。

この手順を行う際は、IPプロトコルを開始する前に、超音波処理の効率を確認することが重要です。本手順に続き、クロマチンの以前の状態（オープンかクローズか）の調査や、ヌクレオソームの間隔のモニタリングといった追加の疑問に答えるために、Eth-ek-se-ekなどの他の手法を実施することができます。この技術の開発により、エピジェネティクス分野の研究者が、あらゆる細胞型や胚器官において、細胞運命決定のあらゆるエピジェネティックな制御を探索する道が開かれました。

このビデオを視聴することで、クロマチン免疫共沈降（ChIP）アッセイの実施方法について十分に理解することができます。