Name: 胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 3 s
Description: 学ぶクロマチン免疫沈降法による心臓分化のエピジェネティック制御機構。胚性幹細胞や組織を用いて遺伝子転写調節を解析し、心臓発生における細胞運命決定の理解に役立つ。

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著者は、資金提供機関、IMI StemBANCC欧州共同体プログラム、leducq Foundation(SHAPEHEART)、Agence Nationale de la Recherche(Genopath)に感謝します。

1. DNA-タンパク質架橋<ol><li> ES細胞と胚の心臓組織から発生した15ミリリットルチューブに修正収穫-ES細胞（レギュラーチップ用の2×10 6細胞、マイクロチップのための2×10 5細胞）、胚様体（EB）はE9.5のマウス胚から切開（房室細胞または胚組織のために透過処理PB2バッファにPBS中の1％ホルムアルデヒドを用いて運河、流出路及び心室）。正確に10分間、室温で60回転の速度でオービタルシェーカー上でチューブを入れます。 </li><li> 125 mMの最終濃度のグリシンを添加することによって架橋反応を停止させ、60回転の速度でオービタルシェーカー上で室温で5分間インキュベートします。 </li></ol> 2.細胞溶解とクロマチン断片化<ol><li> 10mlのPBS 1Xまたは1ミリリットルPB2に再懸濁胚組織に再懸濁回架橋された細胞を洗浄します。 4℃で5分間1,000×gで遠心分離します。上清を捨てます。&lt;/李&gt; <li> PB1またはPB2（2 / mlのロイペプチン、1 / mlのアプロチニン、および0.1mM PMSF）（ 表1）をバッファリングするためにプロテアーゼ阻害剤を追加します。それぞれバッファPB1またはPB2の1ミリリットルのステップ2.1から細胞ペレットまたは胚組織を再懸濁します。ピペットで上下および細胞または組織を再懸濁します。細胞または組織を均質化するために21ゲージ針で1ミリリットル注射器を使用してください。 10分間4℃（ホイール上）でインキュベートします。 </li><li> 4℃で5分間、3000×gでスピンダウンし、上清を捨てます。 </li><li>きれいなチューブにプロテアーゼ阻害剤を補充したそれぞれのSBバッファ（ 表1）300μlの中にペレットを再懸濁（のRNase、DNase-認定、および発熱物質を含まない）は、任意のDNA分解を防ぐために。氷上で15〜30分間インキュベートします。 </li><li>各材料について、表2に記載されたプログラムに従って超音波処理器を用いてクロマチンを剪断するために4℃で試料を超音波処理します。 &lt;（次の用途に応じて超音波処理時間を調整しますem&gt;のすなわち、PCRまたは配列決定）。剪断されたDNAの大きさは、PCRおよび配列決定のための300bpのための約500塩基対でなければなりません。 </li><li>遠心分離機は、新しい1.5 mlチューブに上清（クロマチン）を転送し、ペレットを廃棄し、4℃、6,000×gで10分間、細胞溶解物を超音波処理しました。 </li><li>水で10倍のため、溶液中のクロマチン（上清緩衝液B）を希釈し、ナノ分光光度計で1.5μLを使用して光学密度を評価します。 0.76のx OD 260から1.55のx OD 280：次の式を使用して、μgの/μlの中のタンパク質の濃度を得ます。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> バッファ </td><td> 利用 </td><td colspan="4"> 組成 </td><td> 材料 </td></tr><tr><td rowspan="2"> A </td><td rowspan="2">透過化</td><td colspan="4"> PB1：5 mMのパイプpHが8; 85メートルMのKCl; 0.5％NP40 </td><td>すべて</td></tr><tr><td colspan="4"> PB2：15mMのHEPES pH7.6の、15mMの塩化ナトリウム、4のMgCl 2 60mMの塩化カリウム、0.5％TRITON X-100 </td><td>胚組織</td></tr><tr><td rowspan="3"> B </td><td rowspan="3">溶解/超音波処理</td><td colspan="4"> SB1：1％SDS。 10mMのEDTA; 50mMトリス - 塩酸pHが8 </td><td> ESC </td></tr><tr><td colspan="4"> SB2：50mMのHEPES-KOH pH7.9; 140 mMの。 1mMのEDTA; 0.1％デオキシコール酸塩、 0.1％SDS </td><td> EB </td></tr><tr><td colspan="4"> SB3：15mMのHEPES pH7.6、15mMのNaClを。 60のKCl、1mMのEDTA、0.5mMのEGTA; 1％TRITON-X100、0.1％SDS、0.5％ラウリルサルコシン</td><td>胚組織</td></tr><tr><td> C言語</td><td>チップバッファ</td><td colspan="4"> 150mMのNaCl; 50mMのトリス塩酸pH7.5で、 5 mMのEDTA; 0.5％NP40。 1％TRITON-X100。 </td><td>すべて</td></tr><tr><td> D </td><td> DNA /タンパク質の溶出</td><td colspan="4"> D1：1％SDS。 100mMの炭酸水素ナトリウム D2：50 mMトリスpHが7.6 / 5 mMのEDTA、15mMのDTT、2％SDS </td><td></td></tr><tr><td> E </td><td> DNA結合ビーズの準備</td><td colspan="4"> E：20％PEG 8000; 2.5 MのNaCl; 10mMトリス - 塩酸pHが8と1mMのEDTA </td><td></td></tr></tbody></table> 表1のChIPバッファー 。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 材料 </td><td> 超音波処理プログラム </td></tr><tr><td>胚性幹細胞</td><td> ON 30秒と30秒OFFの15サイクル</td></tr><tr><td>胚様体</td><td> ON 30秒と30秒OFFの30サイクル</td></tr><tr><td>胚組織</td><td> ON 30秒と30秒OFFの21サイクル</td></tr></tbody></table> 表2.超音波処理プログラム。 3.免疫沈降および洗い上げ<ol><li>バッファーCで3回のプロテインA結合ビーズを洗ってください。新しい1.5 mlチューブにビーズを100μlを取り、緩衝液C（ 表1）の1ミリリットルを追加します。次に、チューブを磁石上に転写されます。 1分間待ち、上清を吸引除去します。二回洗浄工程を繰り返します。 </li><li>バッファCの20洗浄蛋白μlの結合ビーズを1 mlの修飾ヒストンまたは転写因子に対する抗体（ 表3に示す濃度）インキュベート新しい1.5 mlのチューブにプロテアーゼ阻害剤を補充しました。 4℃で少なくとも2時間、40 rpmで回転体のサンプルを設定します。 </li><li>洗浄抗体ビーズを、緩衝液Cを1ml（3.1に記載の操作）で3回錯体。 </li><li> 2チューブ、クロマチンと抗体 - ビーズ複合体およびクロマチン150μgのを含む他のチューブと洗浄したビーズを20μlの150μgのを含む1を準備し;各チューブにプロテアーゼ阻害剤を補充した緩衝液Cを1ml加えますそして4℃で一晩40 rpmで回転ホイール上でサンプルをインキュベートします。 注：クロマチンの濃度は、転写因子またはシーケンシャルチップ用を免疫沈降するために、少なくとも300μgのでなければなりません。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 標準 </td><td> 濃度（ngの/μL） </td><td> 容量（μL） </td><td> 全DNA濃度（NG） </td></tr><tr><td> A </td><td> 10.0 </td><td> 1 </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> B </td><td> 5.00 </td><td> 1 </td><td> 5.00 </td></tr><tr><td> C言語</td><td> 2.50 </td><td> 1 </td><td> 2.50 </td></tr><tr><td> D </td><td> 1.25 </td><td> 1 </td><td> 1.25 </td></tr><tr><td> E </td><td> 0.625 </td><td> 1 </td><td> 0.625 </td></tr><tr><td> F </td><td> 0.3125 </td><td> 1 </td><td> 00.3125 </td></tr><tr><td> G </td><td> 0.156 </td><td> 1 </td><td> 0.156 </td></tr><tr><td> H </td><td> 0.0 </td><td> 1 </td><td> 0.0 </td></tr></tbody></table> 表3基準濃度。 4. DNA溶出、クロスリンクの逆転とプロテイナーゼK消化<ol><li>磁気ラック内のサンプルを設定します。非結合抗体のクロマチンを含む上清を回収。 注：サンプルは、すぐにその段階で、液体窒素中で凍結し、-80℃で保存することができます。クロマチンは、他の抗体と他の免疫沈降アッセイに使用することができます。バッファCの1ミリリットル（前述の操作）で各サンプルを3回洗浄。 </li><li>シーケンシャルチップが洗浄のChIP材料を（ 表1）を行わなければならない場合、バッファD1またはD2の150μLを添加することによって、抗体結合タンパク質を溶出し、加熱ブロック中で50℃で20分間、サンプルをインキュベートします。 </li><li>からチューブを外します加熱ブロックとは、磁気ラックにサンプルを入れて、（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定）新しい1.5 mlチューブに上清を回収し、ビーズを捨てます。 </li><li>バッファCの2倍量の第二の抗体の3μgのに1を加え、順次チップ用の上清を使用するか、または200 mMのの最終濃度を得るために、5 MのNaClを添加することにより架橋逆転。 </li><li>新しい1.5 mlチューブにクロマチンの入力サンプルを準備する（のRNase、DNase-認定、および発熱物質を含まない）水を150μlの最終容量でIPサンプル（150μgの）のようなクロマチンの同じ量を取ります（RNアーゼDNアーゼを含まない水）。 200 mMの最終濃度が5MのNaClを追加します。 65℃で一晩サンプルをインキュベートします。 </li><li>翌日、加熱ブロックからサンプルを除去するのChIP材料中に250μg/ mlの最終濃度を得て、2時間55℃で消化し12.5ミリモルおよびプロテイナーゼKの最終濃度を得るために、250 mMのEDTAを加えます加熱ブロック。 </li></ol><ol><li>ビーズの作製<ol><li>少なくとも30分間室温でビーズを持って開始し、非常に徹底的にビーズをボルテックス。ビーズは落ち着くので、ピペッティング時に高速に動作します。転送（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定）きれいな1.5ミリリットルチューブ中のビーズの1ミリリットル。 </li><li> 、明確上清を廃棄するソリューションの3分 - 磁石に設定し、2を待ちます。 、磁石から削除0.5 M EDTAの1ミリリットルを追加し、短時間のボルテックスで混和します。 </li><li>二回ステップ5.1.2を繰り返し、最後に上清を捨てます。 </li><li> 、磁石から削除バッファEの1ミリリットルを追加し、ゆっくりとビーズを再懸濁します。シェーカー上にバッファE.プレイス50mlに全体のミックス（緩衝液E中のビーズ）を転送し、それを1時間室温でゆっくりと混ぜてみましょう。 </li><li> 3実験条件を用いて説明精製プロトコールを以下の試験DNA結合ビーズ：ビーズを50μl/ DNAを50μl（1ボリューム/ 1容量）、ビーズを100μl/ DNA50μlの（2ボリューム/ 1容量）とビーズの125μlのDNA /50μlの（2.5容量/ 1容量）。フラグメント（ 図1A）の大きさを確認するために、1.5％アガロースゲル上で精製されたDNAを移行しましょう。 </li></ol></li><li> DNA精製<ol><li>各DNAサンプル（約170μl）をした磁気ビーズを結合するDNAの425μL（2.5容量）を追加します。ダウン（約10倍）、ピペッティングによりゆっくりと再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。 </li><li>その後、上清を吸引し、（磁石に）捨て、5分間磁石上に置きます。 </li><li> 、1分間待機し、磁石上にチューブに新たに作製した80％エタノール600μlを添加し上清を吸引して廃棄した後、もう一度、前の手順を繰り返します。 </li><li> 5秒（マイクロフュージ）のために、迅速なスピンを与える、磁石上にチューブを置き、エタノールの最後の滴を除去します。室温で1分間乾燥させ</li><li> DNアーゼRNaseを含まない水20μlを加えることによって、DNAを溶出します。磁石から取り外し、サンプルをボルテックス。 </li><li>室温で3分間インキュベートし、その後、磁石上にサンプルを置きます。新しいチューブに吸引し溶出したDNAは（のRNase、DNase-、および発熱物質を含まない認定します）。 </li><li> DNAフラグメント（ 図1B）の大きさを確認するために、1.5％アガロースゲル上で入力画分からDNAを実行します。 </li></ol></li></ol> 6. DNA定量は、蛍光検出機器の使用します<ol><li>シリアル7希釈液を加えた無DNA点（ 表3に集まった希釈液）の合計を与えるために水に1μgのDNA（1キロバイトラダー）で希釈します。 </li><li> PCRグリーンI色素の溶液を準備し、すべてのサンプル（精製DNA及び標準希釈液AH）のための十分な：1×TE緩衝液中グリーン色素を10,000倍希釈します。 </li><li>毛細血管のキュベット中で10μlの1×緑の色素ミックスに各DNAサンプル（精製DNA及び標準希釈液AH）の1μLを加えるには、488 nmの波長での蛍光光度計で読み取ることができます。無DNAアッセイのために、1×TE緩衝液1μLを使用しています。 </li><li>ビルドグラフィックソフトを使用して検量線とNG /μlの中のDNAサンプルの範囲に相対濃度を決定します。次いで、DNAをPCRのために準備ができているか、シーケンシングライブラリを作成します。 </li></ol> 7. PCR <ol><li>プライマーの選択<ol><li>関心の設計プライマーは、関心のあるゲノム領域を調べることができます。設計プライマーは、UCSCゲノムブラウザを使用して遺伝子のエンハンサー領域を増幅します。エンハンサーはさらにGEOデータセット内の9データ利用可能H3K4me1またはP300のChIP-seqのを用いて予測しています。 </li></ol></li><li> PCR <ol><li> 45サイクル（8秒95℃、8秒、60℃、8秒72°C）25μlの緑の色素ミックス、2 ngのDNAを、および0.5μlのプライマーミックスでリアルタイムPCRサーマルサイクラーを使用するためのファイル名を指定して実行のPCR反応（20 μMストック溶液）10。 </li></ol></li><li>濃縮の分析<ol><li>ヌクレオソームのせいぜい1％が11を免疫沈降したと仮定して絶対濃縮を計算します。 </li><li> ConsideRゲノム投入DNAの0.1 ngのと比較すると10 ngののIPサンプルが大きい濃縮を示す場合に富むように。 </li><li>非特異的対照試料と入力し、調整の正規化後の非濃縮領域にわたって濃縮度の増加倍数として結果を表現します。 </li><li>入力DNAは100（希釈係数またはDF）によって希釈されるように考えてみましょう。 </li><li> Ct [DF X入力] - X 100％以下の式2-ΔCt、-ΔCt= Ctを[IP]を使用して入力を正規化します。 </li><li> NSは、非特定のサンプル（抗体なしIP、またはIgG IP）であるとして、次の式（ΔCtを[IP]-ΔCt[NS]）を使用してコントロールを調整します。 </li><li> 2-ΔΔCTとしてサンプルの倍の濃縮を計算します。唯一各PCRサンプルは、結果の分析を容易に入力することができる式で計算のすべてのステップを含むファイル。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

エピジェネティクスは、発生生物学の研究の重要な分野となっています。遺伝的プログラムは、胚系統内の特定のIDを取得するに細胞を可能にするために胚細胞で活性化されているどのくらいの時間のために、発生生物学者にとって重要な問題となっています。 チップは広く最後の年以内に使用し、シークエンシングの解像性の向上、次のDNA配列決定に組み合わされています。これは、ゲノムワイド依存的に細胞または特定の胚および成体組織のエピジェネティックな風景を調べるための強力な技術となっています。 ChIPアッセイ緩​​衝液および超音波処理条件が大幅に生物学的材料の少量のためのアッセイを可能にするために改善されました。これは、顕微解剖により、または蛍光レポータータンパク質を発現するFACS選別細胞によって得られた胚の心臓の特定の領域を含みます。実際にチップが不均一な細胞集団13 14缶上で実行しました解釈するのが困難な誤った結果につながります。エピジェネティックな署名は非常に正確に細胞集団をマーク。その署名は、それらへの分化の特定の可能性を与え、彼らの運命を決定します...

<html>心臓は最初の器官が形成されると、胚における機能的になることです。心臓は、第1および第2の胚性心臓フィールド1から発生する多くの細胞系譜から構築されています。受精後の胚盤胞は、成形心まで段階から、胚細胞は、多くの細胞の運命決定を行うためにこのようにしてあります。遺伝子の転写は、時間と空間依存的に調節され、胚発生の間の細胞運命の決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。このような方法は、心臓構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノム内の調節領域に結合する特異的転写因子によって媒介されます。 DNAは、例えば、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、および/またはリン酸化などの修飾に供されたヒストンの周りに巻かれています。ヒストン修飾は、ヒストンのリジン残基が2に変更されているに応じて活性化し、抑圧や構え遺伝子転写につながります。 jove_content &quot;&gt;クロマチン免疫沈降アッセイ（チップ）年前に3を設定し、4。ヒストンや転写因子の免疫沈降後に変更されたヒストンや転写因子のいずれかの標的を同定するために、現在最も広く使用されている技術であるされてきた、結合したDNAをすることができますいずれかのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅または配列決定した。チップは、技術的挑戦ゲル遅延アッセイ5を克服している。しかし、チップはDNA、ゲル遅延アッセイの利点の転写因子の結合を直接意味するものではない。一方、チップ上DNAシークエンシングに合わせた遺伝子調節に関する新たなゲノムワイドな視点をオープンしました。 ES細胞（ES細胞）を6胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養において心臓の開発の初期段階を再現し、チップのための原則に十分な材料に提供します。また、ヒトES細胞は、CAのヒト細胞モデルを表しますその心原性の潜在的なもののrdiogenesisはそのエピジェネティックな署名7に依存します。開発の後期段階では、マウス胚組織は、セル識別の決意に必要な特定のエピジェネティックな景観を調査することを可能にします。しかし、ゲノムは時間と細胞型に特異的な様式8に転写されます。遺伝子転写のエピジェネティック制御は、局所領域内で検討されなければなりません。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚領域を使用して、PCRまたは配列決定に続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。

<table><tbody><tr><td>ホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>細胞固定&nbsp;</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>シグマ</td><td>G8898</td><td>架橋ストップ</td></tr><tr><td>アプロチニン</td><td>フルーカ</td><td>10820</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>ロイペプチンヘミスルフェート</td><td>シグマ</td><td>L2882</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>シグマ</td><td>P7626</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>プロテインA磁気ビーズ&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>10001D</td><td>免疫沈降</td></tr><tr><td>SPRI 磁気ビーズ</td><td>Thermo Scientific</td><td>15002-01</td><td>DNA 精製</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Life technologies</td><td>25530-015</td><td>タンパク質消化&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA BR標準&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Q32850</td><td>校正範囲&nbsp;</td></tr><tr><td>Syber green</td><td>Molecular Probes</td><td>S-11484</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>TE バッファー&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>PBX 1x</td><td>Life technologies</td><td>14190-094</td><td>洗浄</td></tr><tr><td>DNase RNase 遊離水</td><td>Life technologies</td><td>10977-035</td><td>希釈</td></tr><tr><td>Axygen チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td>ChIP purifiction</td></tr><tr><td>抗体&nbsp;</td><td>Company</td><td>Reference</td><td>ChIP concentration</td></tr><tr><td>H3K27ac</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td>3 &micro;ESCおよびEB用のg、1&micro;組織</td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410194 (pAb-194-050)</td><td>3 &micro;ESCおよびEB用のg、1&micro;組織</td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410058 (pAb-058-050)</td><td>3 &micro;ESCおよびEB用のg、1&micro;組織</td></tr><tr><td>H3K9me2</td><td>Diagenode</td><td>C15410060 (pAb-060-050)</td><td>3 &micro;ESCおよびEB用のg、1&micro;組織</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410030 (pAb-030-050)</td><td>3 &micro;ESCおよびEB用のg、1&micro;組織用g:</td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410069 (pAb-069-050)</td><td>3 &micro;ESCおよびEB用のg、1&micro;ティッシュペーパーのg</td></tr></tbody></table>

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

特定の遺伝子の転写は、胚発生の間の細胞運命決定の基礎となる重要な生物学的プロセスです。生物学的プロセスは、心臓、構成遺伝子のエンハンサー及びプロモーターを含むゲノムの調節領域に結合する転写因子によって媒介されます。 DNAは、化学修飾に供されるヒストンの周りに巻かれています。ヒストンの修飾は、さらにこのように、遺伝子転写の微調整調節の別のレベルをもたらし、抑圧、アクティブまたは構え遺伝子転写につながります。胚性幹細胞（ES細胞）は、心臓発生の初期段階の胚様体（ すなわち 、細胞凝集体）内または2D培養で再現します。それらは、クロマチン免疫沈降（チップ）のための原則に十分な材料、広く遺伝子調節領域を同定するために使用される技術の提供します。また、ヒトES細胞は、心臓のヒト細胞モデルを表します。開発の後期段階では、マウス胚組織はを可能にセルIDを決意するために必要な具体的なエピジェネティックな風景を調べます。ここで、我々は、チップ、ES細胞、胚様体および心臓特異的胚性領域を用いたPCRまたはチップ・シーケンシングに続いて、順次、チップのプロトコルを記述しています。これらのプロトコルは、心臓遺伝子転写のエピジェネティック制御を調査することができます。

図1Aは、まず、異なるサイズ（1kbのラダー）のDNAを用いたDNA結合ビーズおよび品質管理の調製を示します。 0ne、ビーズの2および2.5体積（1〜3）は、高および低分子サイズのDNA断片を精製する試料の量に添加しました。 図1 B、C、Dは、マウスES細胞、胚様体または心臓胚領域から抽出された全超音波処理DNAのDNAゲルの典型的な例では、それぞれ、（25 E9.5心室をプールしました）。 最初の中内胚葉、その後、中胚葉状態を経てES細胞が心筋細胞の運命に向かって分化し、それらのトランジット。このような発達の旅は上皮細胞がepithelio間葉移行を受けなければなられる工程を含み、 <p class="jove_content" fo:keep-t...

遺伝子転写の微調整規制が胚細胞の運命決定の基礎となります。ここで、我々は、幹細胞およびマウス胚の心臓の開発の両方心臓分化のエピジェネティックな調節を調査するために使用されるクロマチン免疫沈降アッセイを記載します。

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

これらのクロマチン免疫共沈降法を分化中の胚性幹細胞や心臓胚組織に適用する全体の目的は、心臓形成におけるエピジェネティックな制御を明らかにすることです。胚の心臓形成過程における遺伝子転写の微調整は、エピジェネティックな構成要素によって制御されているため、クロマチン免疫共沈降法はこのプロセスを理解するための適切なアプローチとなります。この手法の主な利点は、特定の遺伝子座を特異的に標的とし、その特定のDNA断片上に存在するエピジェネティックな標識を調べることができる点にあります。この方法は、心臓の発達におけるエピジェネティックな制御に関する知見を提供します。また、他の器官やあらゆる細胞型にも適用可能です。こちらはImenです。彼女はこの研究室の博士課程の学生で、本日の実験を担当します。この手順では、胚性幹細胞（ES細胞）を使用します。ES細胞から作製した胚様体およびE9.5マウス胚から摘出した胚心臓組織。細胞および組織を固定する。細胞にはPBS中の1% formaldehydeを、胚組織にはPB2透過化バッファーを使用する。チューブをオービタルシェーカーに設置し、室温、60 RPMの速度で正確に10分間振盪します。グリシンの最終濃度が125 millimolarになるように加えて架橋反応を停止させ、オービタルシェーカーを用いて室温、60 RPMで5分間インキュベートします。この手順を開始するには、ペレットを10 millilitersのPBSに再懸濁してください。そして、1 mLのPB2に胚組織を加えます。4 °Cで1000 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨て、2回目の洗浄のためにそれぞれのバッファーを加えます。氷上で、バッファーPB1およびPB2にプロテアーゼ阻害剤を添加します。プロテアーゼ阻害剤を添加したバッファーPB1を1 mL加え、ピペッティングして細胞を再懸濁します。同様に、プロテアーゼ阻害剤を添加したバッファーPB2を1 mL加え、胚組織を再懸濁します。その後、21ゲージの針を装着した1 mLシリンジを用いて、細胞または組織を均質化します。細胞懸濁液を清潔な1.5 mLチューブに移します。均質化した細胞および組織を4 °Cで10分間インキュベートします。4°Cで3000 ×g、5分間遠心分離します。上清を捨て、各ペレットをプロテアーゼ阻害剤を添加した各超音波処理用バッファー300 µLで再懸濁します。DNAの分解を防ぐため、細胞懸濁液を認定済みのRNase、DNase、およびパイロジェンフリーチューブに移し、氷上で15〜30分間インキュベートします。クロマチンをせん断するため、各試料に適したソニケーションプログラムを用いて4 °Cで超音波処理を行います。DNAをPCRに使用するか、あるいはシーケンシングに使用するかによって、ソニケーションの時間を調整してください。次に、超音波処理した細胞溶解液を10分間遠心分離します。各サンプルから、クロマチンが溶解している上清を清潔な1.5 milliliterチューブに移し、ペレットを廃棄します。各サンプルから1.5 microliter分を分注し、水で1:10に希釈します。ナノ分光光度計を用いて全サンプルの光学密度を測定し、タンパク質濃度を決定します。クロマチン免疫沈降に先立ち、プロトコルの説明に従って洗浄し、プロテインA結合ビーズを準備します。清潔な1.5 mLチューブに、修飾ヒストンまたは転写因子に対する抗体、洗浄済みプロテインA結合ビーズ 20 µL、およびプロテアーゼ阻害剤を添加したバッファーC 1 mLを混合します。サンプルをローテーターを用いて40 RPMで、4 °Cで少なくとも2時間インキュベートします。プロトコルの本文に記載されている通り、抗体ビーズ複合体を1 mLのバッファーCで3回洗浄します。2本のチューブを用意し、一方に150 µgのクロマチンと抗体ビーズ複合体を、もう一方に150 µgのクロマチンと20 µLの洗浄済みビーズを分注します。それぞれのチューブにプロテアーゼ阻害剤を添加した1 mLのバッファーCを加え、サンプルを回転ディスクを用いて40 RPMで、4 °Cで一晩インキュベートします。一晩の免疫沈降が完了したら、サンプルをマグネティックラックにセットし、未結合の抗体クロマチンを含む上清を回収します。洗浄済み試料に150 µLの緩衝液D1を加えて、抗体結合タンパク質を溶出させます。サンプルをヒーティングブロックを用い、50 °Cで20分間インキュベートします。20分後、サンプルをヒーティングブロックから取り出し、マグネットラックに設置します。上清を清潔な1.5 mLチューブに回収し、ビーズを廃棄します。架橋を解除するために、5 Mの塩化ナトリウムを上清に加え、最終濃度を200 mMにします。清潔な1.5 mLチューブに、インプット用のクロマチン試料を調製します。免疫沈降試料と同量のクロマチンを、RNaseおよびDNaseフリーの水と5 M 塩化ナトリウムを用いて、最終的に200 mMの濃度になるように最終容量150 µLで調製します。試料を65 °Cで一晩インキュベートします。翌日、サンプルをヒーティングブロックから取り出します。EDTAを最終濃度12.5 millimolar、Proteinase Kを最終濃度250 micrograms per milliliterになるように加え、55 degree Celsiusで2時間消化させます。まず、ビーズを準備してこの手順を開始してください。まず、ビーズを室温で30分以上静置させます。次に、ビーズを十分にボルテックスし、1 mLのビーズを清潔な1.5 mLチューブに素早く分注します。ビーズの入ったチューブをマグネットの上に2～3分間置き、溶液が透明になったことを確認して上清を捨てます。チューブをマグネットから取り出します。0.5 M EDTAを1 mL加え、短時間ボルテックスして混ぜ合わせます。この手順でビーズを2回洗浄し、最後の洗浄後に上清を捨てます。チューブをマグネットから取り出します。1 mLのバッファーEを加え、ビーズをゆっくりと再懸濁させます。混合液全体を50 mLのバッファーEに移します。シェーカーに設置し、室温で1時間ゆっくりと混合させます。続いて、1 KB DNAラダーと、ビーズ量に対するDNA量の3種類の異なる比率を用いて、DNA結合ビーズのテストを行います。検証の結果、DNA結合には2.5/1の比率が最適であることが判明しました。DNA精製にビーズを使用する場合は、各DNAサンプルに425 µLまたは2.5ボリュームのビーズを加え、ピぺッティングで10回ほどゆっくりと再懸濁してください。室温で10分間インキュベートします。マグネット上に5分間静置します。その後、上清を吸引して廃棄します。各チューブに600 µLの調製直後の80% ethanolを加え、2回洗浄する。1分間待機した後、上清を吸引して除去する。チューブを短時間遠心する。チューブをマグネットの上に置きます。エタノールの最後の一滴まで取り除き、室温で1分間乾燥させます。サンプルをマグネットから取り外し、20 µLのDNaseおよびRNaseフリー水を加えてDNAを溶出させます。ボルテックスします。マウスES細胞、胚様体、および胚心臓組織から抽出した超音波処理済み全DNAを逆架橋した後、アガロースゲル電気泳動により得られたDNA断片のサイズを確認した。本クロマチン免疫沈降実験は、ES細胞が中胚葉細胞へと分化する際の、野生型または遺伝子変異細胞における上皮間葉転換遺伝子のエピジェネティックな制御を調べるために設計された。修飾ヒストンの結合は、E-CadherinおよびTwist遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーのPCRによってモニタリングした。ヒトES細胞株4種類から抽出したクロマチンを用い、クロマチン活性化マークに対する抗体、続いて抑制マークに対する抗体を使用して、連続クロマチン免疫沈降を行いました。これらのマークは、細胞が形態形成因子にさらされると修飾されますが、その程度はヒトES細胞株によって異なります。これは、おそらく由来となった元の胚盤胞の違いによるものと考えられます。クロマチン免疫沈降は、胚の心臓の特定領域から抽出したクロマチンにも適用できます。この図は、修飾ヒストンの濃縮が見られた心臓遺伝子およびNkx2.5とTBx5のゲノム領域と、心室では発現しておらず濃縮も見られなかった心拍調節細胞特異的遺伝子Shox2のゲノム領域を示しています。習得すれば、適切に実施することでこの手法は3時間で完了させることができます。この手順を行う際は、IPプロトコルを開始する前に、超音波処理の効率を確認することが重要です。本手順に続き、クロマチンの以前の状態（オープンかクローズか）の調査や、ヌクレオソームの間隔のモニタリングといった追加の疑問に答えるために、Eth-ek-se-ekなどの他の手法を実施することができます。この技術の開発により、エピジェネティクス分野の研究者が、あらゆる細胞型や胚器官において、細胞運命決定のあらゆるエピジェネティックな制御を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、クロマチン免疫共沈降（ChIP）アッセイの実施方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

私たちは、人間の心臓前駆細胞の大量供給と心血管修復のための機能的な心筋細胞の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接cardioblastsの誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

多能性幹細胞は、胚又は人工多能性幹細胞（iPS細胞）のいずれかで、心筋細胞を含むヒト分化細胞の貴重な情報源を構成する。ここでは、胚様体ベースのプロトコルを介して機能的なヒト心筋細胞を得るためにそれらを使用する方法を示す、iPS細胞の心筋誘導に焦点を当てます。...

ヒト心筋細胞の生成：フィーダーフリーヒト人工多能性幹細胞からの分化プロトコル

物品を効率よく選択的に集団の均質性および同一性を評価するための基準マーカーのフローサイトメトリー分析を行っWnt経路を変調することにより、心筋細胞へのヒト多能性幹細胞を分化するための詳細な方法論を記載している。...

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

このプロトコルでは、マウスとヒトの胚性幹細胞の両方からの心前駆細胞の誘導が説明されます。このプロトコールの主な戦略は、胚性幹細胞株に改変された蛍光レポーターを使用して、フローサイトメトリーで心前駆細胞を濃縮することです。...

胚性幹細胞から心臓前駆細胞の誘導

多能性幹細胞から心筋細胞をin vitroで生成することで、基礎科学と臨床応用のための大量の心臓組織へのアクセスが可能になります。...

BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

このプロトコルは、成体マウス心筋細胞の再現性のある単離と長期培養のための段階的な方法を説明しています。これは、高収率、純度、および生存率を備えています。...

成体マウスの心筋細胞の単離、培養および形質導入

この原稿は、レトロウイルスが媒介するGata4、Hand2、Mef2c、およびTbx5の送達を使用して、多様な再プログラムされた心臓サブタイプの生成と定量化のための段階的なプロトコルを説明しています。...

マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

ここでは、機能、契約、心筋細胞のような細胞を生成するために若いヒト間葉系幹細胞源の心臓微分の潜在性を効率的に活用する方法を提案するの in vitro...

体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1...

最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成

学ぶクロマチン免疫沈降法による心臓分化のエピジェネティック制御機構。胚性幹細胞や組織を用いて遺伝子転写調節を解析し、心臓発生における細胞運命決定の理解に役立つ。

胚性幹細胞や組織の心臓分化のエピジェネティック制御

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