Name: ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚からの単一細胞単離法とマイクロ流体システムを用いた遺伝子発現解析。細胞異質性を明らかにし、発生生物学における細胞分化の転写変化を解明する技術です。

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魚類資源について、Dr. C. Geoffrey Burnsに感謝します。著者らは、このプロジェクトを可能にするリソースを提供してくれたUNC Flow Cytometry Core Facility、UNC-CGIBD AACコア、および動物ケアのためのZAC施設に感謝しています。L.S.はNIH T32 grant HL069768-13(PI, Nobuyo Maeda)の支援を受けています。N.F.は、NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081の支援を受けています。本研究は、NIH P30DK034987助成金(UNC Advanced Analytics Coreへ)、American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010、Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13(Qian博士へ)、NIH R00 HL109079助成金(Liu博士へ)の支援を受けました。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本明細書に記載される方法は、単一の心臓遺伝子のサブセットの発現を評価するために、マイクロ流体アシスト単一細胞捕捉システムで使用するためのゼブラフィッシュ胚からの心臓前駆細胞の集団を濃縮するために細胞型特異的プロモーターの制御下で蛍光タンパク質の発現を使用して細胞。 FACSレーザ励起と発光の機能が選択されたフルオロフォア（複数可）と適合することを、この方法は、任意の蛍光レポーターラインのために使用することができます。多くのゼブラフィッシュのレポーターラインがすでに存在しており、新たなレポーターを保有するトランスジェニック魚はわずか3ヶ月で生成することができます。また、このワークフローは、単一細胞RNA配列決定のための全トランスクリプトームからcDNAを生成するように適合されてもよいです。これを行うには、ステップ5-7 RNA配列決定に適したライブラリーを作製するためのcDNAを調製するために最適化された化学反応で使用するためにわずかに修正する必要があります。しかし、人口の異質性を検証することをお勧めしますハイスループットシークエンシングアプリケーションを追求する前に、ここで説明した方法を使用して。 <p class="jove_...

細胞及び分子生物学の最新の研究は、母集団平均に基づいています。マイナー集団は生物学的プロセスおよび疾患の結果で主要な役割を再生することができますので、重要な生物学的事象は、これらの伝統的な集団ベースの分析によってマスクすることができます。関連する生物学的および臨床的洞察1,2につながる（たと）単一細胞レベルでの不均一な集団における遺伝子発現をすることができます理解します。胚発生の研究に懸念されるのは、細胞の大きな集団において、前駆細胞は、それが困難な、最終的に細胞の運命の決定3を開始し 、遺伝子発現の微妙な変化を検出すること、しばしば過小評価されています。同様に、単一の細胞型は、微小環境4に対応して異なる発現プロファイルを有することができます。たとえば、同じ器官または異なる器官内に常駐内皮細胞（ 例えば 、大動脈または腎臓）は、共通のmorpを共有するにもかかわらず、有意な異質性を示しますhologicalおよび機能的特徴5。また、同じ腫瘍を移植癌細胞は、単一細胞レベルでの6分子プロフィールまたは突然変異を変化させることができます。 モデル系では、単一細胞におけるトランスクリプトが正常に、新しい細胞集団を同定し、細胞分化の間に生じる中間状態を特徴づけ、そして7,8,9を刺激するために、差動細胞応答を明らかにしました。このような洞察は、従来の集団ベースの研究でマスクされていたであろう。ゼブラフィッシュの胚は、単一の細胞の不均一や開発中の細胞のアイデンティティの分子調節の質問を探索するための幹細胞、前駆細胞、および分化する細胞の途方もなく過小利用源です。彼らの非常にステレオタイプ、ex vivoでの開発や遺伝子操作の容易さは、それらのこのアプローチ10,11のための優れたモデル系にします。具体的には、単一のセル世代の解釈に大きな制限Eの発現データは、開発中の新規な中間体セル状態の信頼性の識別は、組織収集9の非常に慎重にタイミングを必要とすることです。これは、捕捉された細胞との間の不均一性は、年齢依存性細胞分化によって提示される遺伝子発現における単一の時点で組織内の不均一ではなく、不均一性を表していることを保証する必要があります。マウスと比較して、ゼブラフィッシュ胚発生を正確に胚12の多数にわたって同期させることができます。さらに、大規模なクラッチサイズで、ゼブラフィッシュの胚は、幹細胞および前駆細胞の豊富な供給源として使用することができます。 このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚からの細胞を単離し、市販の集積マイクロ流体回路のqRT-PCR遺伝子発現解析のために（IFC）チップとオートプレップシステムを用いて単一細胞を捕捉する方法を記載します。このプロトコルは、全体を含む任意の高スループット多重アッセイに急速に譲渡することができます細胞異質13のより包括的な分析を可能にするトランスクリプトーム配列決定。また、伝統的な遺伝子発現アッセイにいくつかの利点を提供しています。単一細胞単離プロトコールは、下流アプリケーションに含まれている妥協細胞の割合を減少さFACS、後に高い生存率をもたらします。 IFCを使用することにより、捕捉された細胞を直接捕捉率を評価し、形態学的細胞の健康を評価するために観察することができます。また、このプロトコルは、マイクロ流体細胞捕捉技術にのみラベルされたトランスジェニック魚のラインとのアクセスを必要とする、ゼブラフィッシュ研究コミュニティに広く適用可能です。 原理の証明として、心臓前駆細胞に由来する単一の細胞を単離し、IFCチップ上に捕捉し、次いで心臓分化マーカーの相対的存在量は、定量RT-PCRにより測定しました。単一細胞レベルでの遺伝子発現解析は、心臓前駆体が自分のdiffereと共存することを実証しますntiating子孫。心臓前駆体の単一細胞プロファイリングから得られた知見は、伝統的な集団ベースの解析でマスクされている可能性があり、脊椎動物の発生時に心臓前駆細胞間の遺伝子発現パターンの不均一性、に光を当てることがあります。

<table><tbody><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11254-20</td><td>胚から絨毛膜を除去するため</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ 2 ml</td><td>GeneMate</td><td>C-3261-1</td><td></td></tr><tr><td>40 um 細胞ストレーナー</td><td>バイオベーシック</td><td>SP104151</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培養皿</td><td>ファルコン</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>35 umセルス</td><td>トレーナーFalcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>P1000とヒント</td><td>Rainin</td><td>17005089</td><td></td></tr><tr><td>P20とヒント</td><td>Rainin</td><td>17005091</td><td></td></tr><tr><td>IFCチップメーカーのプロトコル</td><td>Fluidigm</td><td>100-6117</td><td>バージョン100-6117 E1をトッピングしたFACSチューブは、代表的な実験で使用されました</td></tr>ワイド<tr><td>ボアパスチュアガラスピペット</td>VWR14673-010 <td></td><td></td><td>胚の移植</td></tr><tr><td>成体野生型ゼブラフィッシュ</td><td>N/A</td><td></td><td>ABラインを使用しました</td></tr><tr><td>成体トランスジェニックゼブラフィッシュ</td><td>N/A</td><td></td><td>Tg(nkx2.5:ZsYellow)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents for cell dissociation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>double蒸留水</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>の即刻の海洋の海塩</td><td>即刻の海洋</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FisherScientific</td><td>S271-3</td>は<td>水で在庫を作り、de-yolking緩衝液のために使用</td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマAldrich</td><td>P5405</td>は<td>水で株を作り、de-yolking緩衝液</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>シグマのための使用Aldrich</td><td>S6014</td><td>水でストックを作り、脱卵バッファーに使用</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15</td><td>Gibco</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>FisherScientific</td><td>03-600-511</td><td>熱不活性化; FBSのどのブランドも罰金でなければなりません</td></tr><tr><td>細胞解離試薬 1 -TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605-010</td><td>室温で保存してください。</td></tr><tr><td>細胞解離試薬 2 - FACSmax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>Store -20; 氷上で解凍し、使用前に室温に戻してください</td></tr><tr><td>プロナーゼ (オプション)</td><td>シグマ</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>L/D 色素 - Sytox Blue</td><td>Life Technologies</td><td>S34857</td><td>フローサイトメトリーに適した任意の生/死染色が機能します</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>strong><コメント</td></tr><tr><td>Reagents for IFC plate use and qRT-PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gene-specific probes</td><td></td><td></td><td>プローブは実験によって異なります</td></tr><tr><td>TaqMan Probe ef1a</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03432748_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe gata4</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03443262_g1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe nk2-5</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03074126_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe myl7</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03105700_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe vmhc</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03431136_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Probe isl1</td><td>Life Technologies</td><td>Dr03425734_m1</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>IFC メーカーのプロトコール</td><td></td><td></td><td></td>に記載されている試薬</tr><tr><td>C1 試薬キット</td><td>Fluidigm</td><td>100-5319</td><td>IFC プレートに細胞をロードするための試薬</td></tr><tr><td>Ambion Single Cell-to-CTTM</td><td>Life Technologies</td><td>4458237</td><td>逆転写および前増幅ステップ用の試薬</td></tr><tr><td>PreAmp (5-10 um)のための</td><td></td>分子生物学の質の水コーニング46-000CM <td></td><td></td> C1 IFCのFluidigm 100-5757小さい細胞</tr><tr><td>のための名前</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong<></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>strong>Equipment<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1 AutoPrep Machine</td><td>Fluidigm</td><td>100-5477</td><td>IFCプレート用</td></tr><tr><td>血球計算盤&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z359629</td><td>細胞のカウントと細胞サイズの評価用</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td>絨毛膜からの胚の除去用</td></tr><tr><td>組織培養顕微鏡</td><td></td><td></td><td>シングルセル消化の評価用</td></tr><tr><td>FACSマシン</td><td></td><td></td><td>目的の細胞を単離するため</td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、脊椎動物の発達を研究するための強力なモデル生物です。ゼブラフィッシュの胚発生の多くの側面が形態学的レベルで説明されていますが、生物の発達に伴って起こる細胞変化の分子基盤についてはほとんど知られていません。近年のマイクロ流体工学とマルチプレックス技術の進歩により、単一細胞での遺伝子発現を特徴付けることが可能になりました。これにより、特定の細胞集団の個々の細胞間の不均一性を調査して、細胞サブタイプを特定および分類し、細胞分化中に発生する中間状態を特徴付け、刺激に対する細胞の異なる応答を探索できます。この研究では、ハイスループットマルチプレックスアッセイのために、ゼブラフィッシュの胚から生存可能な単一細胞を単離するプロトコルについて説明しています。この方法は、蛍光マーカーを持つ任意のゼブラフィッシュ胚細胞タイプに迅速に適用できます。この方法の拡張は、ハイスループットシーケンシング技術と組み合わせて使用 し、単一細胞のトランスクリプトームを完全に特徴付けるためにも使用できます。原理の証明として、心分化マーカーの相対存在量を、nkx2.5陽性の心前駆細胞に由来する単離された単一細胞で評価しました。このデータは、単一細胞レベルおよび単一時点での遺伝子発現の評価により、心前駆細胞が分化した子孫と共存するモデルを支持しています。ここで説明する方法とワークフローは、ゼブラフィッシュの研究コミュニティに広く適用でき、標識されたトランスジェニック魚種とマイクロ流体技術へのアクセスのみが必要です。

原理の証明として、遺伝子発現は、心臓の開発中分化の動態を調査するために評価しました。ゼブラフィッシュでは、心臓前駆体は、彼らが線形心管を形成するために融合し、前方側板中胚葉に移動する細胞の中胚葉集団から生じます。融合の前に、心臓前駆体は、心臓前駆体16,17の最も初期の特異的なマーカーであると考えられる転写因子nkx2.5（NK2ホメオボックス5）、発現し始めます。ここでは、先に述べたBACトランスジェニック魚のTg（nkx2.5：ZsYellow）18、nkx2.5 を略記：ZsYは 18体節期、18時間後に受精（HPF）12で単一細胞における心臓分化マーカーを調べました。これはZsYellow信号が視覚的に検出した最も早い時点でした。以前にこのトランスジェニック系統のために説明したように、ZsYellowは、私たちのように、心臓前駆体を標識28 HPF 19における咽頭弓の内...

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚から単一細胞を分離する方法、目的の細胞を濃縮する方法、マイクロ流体ベースの単一細胞マルチプレックスシステムでゼブラフィッシュ細胞を捕捉する方法、および単一細胞からの遺伝子発現を評価する方法を説明しています。

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

本実験の全体的な目的は、ゼブラフィッシュ胚の初期段階から単一細胞を分離し、マイクロ流体ベースのシングルセル・マルチプレックスシステムで捕捉することで、個々の細胞の遺伝子発現を評価することです。この手法は、分化や運命決定の過程で細胞にどのような転写変化が起こるかなど、発生生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、従来の集団ベースの手法では隠されてしまう不均一性を明らかにするための、バイアスのないアプローチであることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、単一細胞の生存可能な調製物の作成が技術的に困難であるため苦労することがありますが、これは下流解析において不可欠な工程です。一度習熟すれば、手順を適切に行うことで、統合マイクロ流体チップ上での全胚サンプルの単一溶解細胞への処理を6時間で完了させることができます。この手順を実施する際は、マイクロ流体デバイスに単一細胞のみが捕捉されるようにすることに留意することが重要です。成体の野生型およびトランスジェニックゼブラフィッシュを交配させた後、施設および機関が承認した標準作業手順書に従い、15分間隔で胚を回収します。少なくとも2時間後、単一の時間点から100〜300個の受精胚を、新鮮な卵水を入れた新しいペトリ皿に移します。そして、精密ピンセットを用いて、各胚から卵膜を手動で除去します。次に、広口ガラスピペットを使用して、胚を最小限の量の卵水とともに2 mLマイクロ遠心チューブに移します。すべての胚を移し終えたら、水を1 mLの氷冷卵水に交換し、チューブを氷上に20分間浸します。安楽死させた後、広口ガラスピペットを使用して上清を除去します。そして、P-1000ピペットを用いて、胚に新しい卵水を2回加えます。2回目の洗浄後、卵水を1 milliliterの脱黄緩衝液に交換し、P-1000ピペットで胚を8～12回ピペッティングして、卵黄が溶解し胚の体のみが見える状態にします。遠心分離によって組織を回収します。次に、ピペットを用いて組織ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除き、1 milliliterの新鮮な卵水で細胞を再懸濁します。胚をさらに2回洗浄した後、ペレットを1 milliliterの室温のcell dissociation reagent-1に再懸濁します。その後、チューブを横向きに置き、室温で10分間インキュベートします。凝集を防ぐため、2〜3分おきに緩やかにピペッティングを行います。インキュベーション終了後、細胞を再度遠心分離し、ペレットを1 milliliterのcell dissociation reagent-2に再懸濁します。細胞を室温で水平に置き、さらに5〜15分間、2〜3分おきに緩やかにピペッティングしながらインキュベートします。5分ごとに、上清2 µLを18 µLのFACSバッファーで希釈し、細胞を細胞培養ディッシュに液滴として分注します。サンプルの上にカバーガラスを載せ、組織培養顕微鏡を用いて10倍および20倍の倍率で消化の進行状況を確認します。調製物が、主に単一細胞で構成され、そこに大小の細胞クラスターと、ほとんど無傷の胚体がわずかに混在している状態になったら、細胞を遠心分離し、ペレットを1 mLの冷 FACSバッファーに再懸濁します。次に、40 µmのセルストレーナーをFACSバッファーで濡らします。そして、ストレーナーを用いて細胞をろ過し、35 mmの細胞培養ディッシュに回収します。再度遠心分離を行った後、ペレットを100 µLのFACSバッファーで再懸濁し、トリパンブルー排除法により生存細胞数を計測します。次に、サンプルを5 × 10⁶ cells/mLまで希釈します。また、未染色コントロール用に細胞の10〜20%を分取しておきます。残りの細胞を蛍光生存/死細胞判別染料で染色します。次に、35 µmのセルストレーナー付きFACSチューブに20 µLのFACSバッファーを加えて湿らせ、ストレーナーに細胞を加え、重力によって回収します。図示したゲーティング戦略を用いて、蛍光マーカーを発現している単一の生存細胞をソートします。二重標識細胞を用いて、ゲーティングの検証を行います。氷上のマイクロ遠心チューブ内の冷 FACS バッファー 5 µL に、目的の細胞集団から 2,000 〜 4,000 個の細胞をソートします。次に、ソートした細胞 1 µL を、FACS ソートバッファー 100 µL と 1:1,000 に希釈した live/dead 染色液を入れた新しい FACS チューブに移します。そして、ソート後の生存率を評価するため、ソートゲートを用いて細胞サンプルの解析を行います。次に、9 µLのFACSバッファーで希釈した細胞懸濁液1 µLを血球計数器にロードし、細胞濃度と平均粒子径を測定します。続いて、サンプルの平均細胞径に適したサイズの統合マイクロ流体回路（IFCチップ）を選択し、製造元の指示に従って流路のプライミングを行います。製造元の指示に従って細胞をプレートにロードし、そのプレートを対応する流体制御装置にセットしてください。次に、IFCチップ用の適切なセルローディングスクリプトを実行し、キャプチャレーンに細胞を導入します。細胞がキャプチャサイトに固定されていることを確認するため、プレートアダプターを備えた顕微鏡にプレートを設置し、10倍の倍率で各キャプチャサイトの明視野像および蛍光像を取得します。その後、細胞を回収し、QRT-PCRを用いて標的遺伝子の発現に関する下流評価を行います。18体節期において、蛍光顕微鏡を用いて胚のZsYellow発現を確認することができます。ソーティング後、さまざまな直径の細胞が得られます。IFCプレートを使用することで、目的の直径を持つ細胞を捕捉することが可能です。例えば、本実験において、細胞の直径は5〜10 µmでした。予想通り、受精後18時間の胚から分取および捕捉された細胞は、ZsYellow蛍光マーカーを発現していました。ここでは、IFCプレート上の細胞捕捉部位から得られた40個の単一細胞を用いて、目的の特定遺伝子の相対的な遺伝子発現を評価するためにqRT-PCRを用いました。ハウスキーピング遺伝子のサイクルしきい値（Ct値）の範囲が、サンプル間の遺伝子発現を比較するには広すぎ、また多くのCt値が30を超えていたため、これらの値をヒートマップとして可視化しました。サンプル間で比較した結果、本実験では遺伝子発現に著しい不均一性が観察されました。これにより、遺伝子発現パターンに基づいて細胞をタイプ1からタイプ5に分類しました。習熟すれば、手順を適切に行うことで、統合マイクロ流体チップを用いて胚サンプル全体を単一の溶解細胞に処理する工程は6時間で完了させることができます。この操作を行う際は、マイクロ流体チップ上で単一細胞のみが捕捉される点に留意することが重要です。本手順に続いて、ハイスループット単一細胞シーケンシングなどの他の手法を実施することで、単一細胞のトランスクリプトームを完全に特性解析することが可能です。本技術の開発により、発生生物学分野の研究者が初期発生胚における細胞の不均一性を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュ胚から単一細胞を分離し、マイクロ流体ベースのシングルセル・マルチプレックス・システムで単一細胞をキャプチャし、個々の細胞の遺伝子発現を評価する方法について十分に理解できるはずです。

isolation-and-characterization-of-single-cells-from-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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トランスフェクション ライブセル...

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シングルセルRNAシーケンシングのためのゼブラフィッシュ幼生からの腸管分離

学ぶゼブラフィッシュ胚からの単一細胞単離法とマイクロ流体システムを用いた遺伝子発現解析。細胞異質性を明らかにし、発生生物学における細胞分化の転写変化を解明する技術です。

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

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