Name: TRUE遺伝子サイレンシング：潜在的ながん治療薬の七量体型スモールガイドRNAライブラリーのスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ七量体型sgRNAライブラリーのスクリーニング法で、血がん治療薬候補を同定する実験手順です。遺伝子編集を応用した創薬研究に有用です。

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この作品は、ターゲット主導のR＆D、科学技術振興機構、日本私立学校振興・共済・コーポレーションからの科学研究振興基金を通じて適応とのシームレスな技術移転プログラムでサポートされている、とJSPS科研費補助金番号24300342と15H04313ました。

ヘプタマー型の1建設sgRNAライブラリ<ol><li>本格的なライブラリを構築する場合を除き16,384（4〜7）7-ntの配列のサブセットを選択します。 注：シーケンスは、ランダムおよび/または特異的な細胞RNAを標的とするように設計することができます。後者の場合は、ヘアピン構造は、適切なコンピュータプログラムを用いて、標的RNAおよび/ ​​または視覚的tRNAのT-アームに似た見つけ、ヘアピン構造4,10のすぐ下流に7-ntの配列に相補的な配列を選択し、 17,18。 </li><li>選択ヘプタマーのそれぞれを合成完全に2&#39;-O -メチル化、5&#39;-及びDNA / RNA合成と3&#39;-リン酸化RNA。孔制御ガラス（CPG）支持体上のホスホラミダイト法を使用し、合成の最終サイクルの上の5 &#39;末端4,4&#39;-ジメトキシトリチル（DMT）保護基（5&#39;リン酸を添加することを）残します23。 注：カスタムSYnthetic RNAはまた、オリゴヌクレオチドの供給業者から入手することができます。 </li><li>最後の合成サイクルの完了後、テフロンライナースクリューキャップ付きガラスバイアルにカラムから合成されたオリゴヌクレオチドを​​用いてCPGを転送する29％の水酸化アンモニウムを1mlを加え、8時間55℃でそれをインキュベートCPGからオリゴヌクレオチドを​​切断し、塩基及びリン酸塩から保護基を除去します。 </li><li> 40℃で遠心蒸発器と0.1 Mのn-ヘキシルアセテートを0.2mlに再溶解するオリゴヌクレオチドで水酸化アンモニウムを蒸発させます。 </li><li> 10〜50％アセトニトリル/ 0.1 Mのn-ヘキシルアセテートを含む緩衝液でポリスチレン - ジビニルベンゼンのカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィーを介して合成オリゴヌクレオチドを​​精製します。 80℃で25分間、2.0ミリリットル/分でカラムを実行します。 </li><li> 20％酢酸溶液を作るために分画したサンプル（1-2 ml）のに濃酢酸の0.25〜0.5ミリリットルを追加し、incubaTE室温で1時間この溶液にDMT基を除去しました。 </li><li> 29％の水酸化アンモニウム1ml中に再溶解し、そして5 &#39;リン酸の側鎖を除去するために室温で15分間溶液をインキュベートし、40℃で遠心エバポレーターを用いてサンプルを乾燥させます。 </li><li> 40℃での遠心エバポレーターで約0.3ミリリットルに試料の体積（1ミリリットル）を低減。 </li><li>カットオフ1,000 4℃で一晩分子量の透析チューブを用いて蒸留水に対して全体の濃縮試料（500ml）に透析します。 </li><li>その後、ピペットで1.5 mlチューブに透析チューブから透析サンプルを移し、40℃で遠心エバポレーターで乾燥させ、そしてその体積のはず、注射用水グレードの水に再溶解より大きい100μMの溶液を作製するのに十分小さいこと。 </li><li>分光光度計を用いて260nmでRNAサンプルの光学密度を測定し、100にその濃度を調整します水のための注射等級の水を添加することによりμM。 -20°C使用前に以下のRNA溶液を保管してください。 </li></ol>細胞生存率のためのsgRNAライブラリの2.スクリーニング<ol><li>調製10 3細胞/ 99μL/ウェル（ 例えば、HL60及びRPMI-8226）を、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を補充したRPMI-1640培地中で96ウェルディッシュに。唯一のバックグラウンド減算のメディアを含むウェルを準備します。エッジ効果を排除するために、サンプルウェルの周囲の井戸を空にするために滅菌水を追加します。 </li><li>各ウェルに注射用水グレードの水に溶解しヘプタマー型sgRNA（100μM）の1μLを加えます。三連でアッセイ各sgRNA。 3日間、5％CO 2加湿インキュベーター中37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>各ウェルに、市販のWST-8溶液の適切な量を追加します。 1〜4時間、同じインキュベーター中、37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>吸光度Aを測定しますマイクロプレートリーダーで450nmでのTを 注：ほとんどの場合、吸光度と生細胞数の間の直線性は、吸光度の値が1.0を超えない限り維持されるように思われます。 </li></ol>フローサイトメトリーによる実効sgRNAs 3.評価<ol><li>調製10 3細胞/ 10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を補充したRPMI-1640培地中で96ウェルディッシュに99μL/ウェル（ 例えば、HL60）。 1 sgRNAをテストするために少なくとも10のウェルを準備します。エッジ効果を排除するために、サンプルウェルの周囲の井戸を空にするために滅菌水を追加します。 </li><li>各ウェルに注射用水グレードの水に溶解しヘプタマー型sgRNA（100μM）の1μLを加えます。 3日間、5％CO 2加湿インキュベーター中37℃でプレートをインキュベートします。 </li><li>ピペットで5 mlチューブに少なくとも10ウェルから同じsgRNAで処理した細胞を収集します。 30で遠心機で5分間チューブをスピン0 XG、およびメディアを廃棄します。 </li><li>チューブに1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を2 mlを加え、細胞を再懸濁します。 300×gで遠心機で5分間チューブをスピンし、PBSを捨てます。チューブに1×アネキシンV結合緩衝液の150μlのを追加し、細胞を再懸濁。 </li><li> 、フィコエリトリン2μlの（PE）抱合アネキシンVソリューションとチューブに7-アミノのD（7AAD）溶液1μlを加えよく混ぜる、そして暗所で室温で15分間チューブをインキュベートします。 24フローサイトメーターを使用してサンプルを分析します。 </li></ol>

<ol><li>Scherer, L., Rossi, J. J. Therapeutic potential of RNA-mediated control of gene expression: Options and designs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScherer%2C+L+%22RNA+and+the+Regulation+of+Gene+Expression%3A+A+hidden+layer+of+complexity%22">RNA and the Regulation of Gene Expression: A hidden layer of complexity</a>. Morris, K. V. , Caister Academic Press. 201-226 (2008).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease+to+four-base-recognizing+RNA+cutters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conversion of mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease to four-base-recognizing RNA cutters.</a> Nucleic Acids Res. 23, 3642-3647 (1995).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+cleavage+of+target+RNAs+from+HIV-1+with+5%E2%80%B2+half+tRNA+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Specific cleavage of target RNAs from HIV-1 with 5′ half tRNA by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> RNA. 2, 523-534 (1996).</li>
<li>Nashimoto, M., Geary, S., Tamura, M., Kasper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+heptamers+that+directs+RNA+cleavage+by+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA heptamers that directs RNA cleavage by mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 26, 2565-2571 (1998).</li>
<li>Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+RNA+substrates+for+mammalian+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Anomalous RNA substrates for mammalian tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> FEBS Lett. 472, 179-186 (2000).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+candidate+prostate+cancer+susceptibility+gene+encodes+tRNA+3%E2%80%B2+processing+endoribonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A candidate prostate cancer susceptibility gene encodes tRNA 3′ processing endoribonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 31, 2272-2278 (2003).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+half-domain+of+the+long+form+of+tRNase+Z+is+required+for+the+RNase+65+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The N-terminal half-domain of the long form of tRNase Z is required for the RNase 65 activity.</a> Nucleic Acids Res. 32, 4429-4438 (2004).</li>
<li>Takaku, H., Minagawa, A., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+four-base-recognizing+RNA+cutter+that+can+remove+the+single+3%E2%80%B2+terminal+nucleotides+from+RNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel four-base-recognizing RNA cutter that can remove the single 3′ terminal nucleotides from RNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. 32, e91(2004).</li>
<li>Shibata, H. S., Takaku, H., Takagi, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+loop+structure+is+dispensable+for+substrate+recognition+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The T loop structure is dispensable for substrate recognition by tRNase ZL.</a> J. Biol. Chem. 280, 22326-22334 (2005).</li>
<li>Tamura, M., Nashimoto, C., Miyake, N., Daikuhara, Y., Ochi, K., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+mRNA+cleavage+by+3%E2%80%B2+tRNase+under+the+direction+of+2%E2%80%B2-O-methyl+RNA+heptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intracellular mRNA cleavage by 3′ tRNase under the direction of 2′-O-methyl RNA heptamers.</a> Nucleic Acids Res. 31, 4354-4360 (2003).</li>
<li>Habu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+HIV-1+gene+expression+by+retroviral+vector-mediated+small-guide+RNAs+that+direct+specific+RNA+cleavage+by+tRNase+ZL%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of HIV-1 gene expression by retroviral vector-mediated small-guide RNAs that direct specific RNA cleavage by tRNase ZL.</a> Nucleic Acids Res. 33, 235-243 (2005).</li>
<li>Nakashima, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-silencing+by+the+tRNA+maturase+tRNase+ZL+under+the+direction+of+small+guide+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Gene-silencing by the tRNA maturase tRNase ZL under the direction of small guide RNA.</a> Gene Ther. 14, 78-85 (2007).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Takaku, H., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+vascular+endothelial+growth+factor+expression+by+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of vascular endothelial growth factor expression by TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 379, 924-927 (2009).</li>
<li>Sano, T., Takahashi, M., Nozaki, T., Takahashi, Y., Tamura, M., Nashimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+utility+of+heptamer-type+sgRNA+for+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Expanding the utility of heptamer-type sgRNA for TRUE gene silencing.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 416, 427-432 (2011).</li>
<li>Iizuka, S., Oridate, N., Nashimoto, M., Fukuda, S., Tamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+inhibition+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cells+by+sgRNA+targeting+the+cyclin+D1+mRNA+based+on+TRUE+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Growth inhibition of head and neck squamous cell carcinoma cells by sgRNA targeting the cyclin D1 mRNA based on TRUE gene silencing.</a> PLoS One. 9 (114121), (2014).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+specific+miRNAs+by+naked+14-nt+sgRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Elimination of specific miRNAs by naked 14-nt sgRNAs.</a> PLoS One. 7 (38496), (2012).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+naked+RNA+heptamer+targeting+the+human+Bcl-2+mRNA+induces+apoptosis+of+HL60+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A naked RNA heptamer targeting the human Bcl-2 mRNA induces apoptosis of HL60 leukemia cells.</a> Cancer Lett. 328, 362-368 (2013).</li>
<li>Watanabe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+apoptosis+of+leukemic+cells+by+TRUE+gene+silencing+using+small+guide+RNAs+targeting+the+WT1+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of apoptosis of leukemic cells by TRUE gene silencing using small guide RNAs targeting the WT1 mRNA.</a> Leukemia Res. 37, 580-585 (2013).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+by+human+cytosolic+tRNase+ZL+through+5%E2%80%B2-half-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression by human cytosolic tRNase ZL through 5′-half-tRNA.</a> PLoS One. 4, 5908(2009).</li>
<li>Elbarbary, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytosolic+tRNase+ZL+can+downregulate+gene+expression+through+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Human cytosolic tRNase ZL can downregulate gene expression through miRNA.</a> FEBS Lett. 583, 3241-3246 (2009).</li>
<li>Ninomiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+small+guide+RNAs+for+tRNase+ZL+from+human+plasma%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Potential small guide RNAs for tRNase ZL from human plasma, peripheral blood mononuclear cells, and cultured cell lines.</a> PLoS One. 10, 0118631(2015).</li>
<li>Takahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+a+heptamer-type+sgRNA+library+for+potential+therapeutic+agents+against+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">Screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic agents against hematological malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 808-815 (2014).</li>
<li>Solid-phase oligonucleotide synthesis. ATD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis">http://www.atdbio.com/content/17/Solid-phase-oligonucleotide-synthesis</a> (2015).</li>
<li>FACSCalibur Instructions For Use. BD Bio. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf">http://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCalibur_instructions.pdf</a> (2007).</li>
<li>Shivarov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRUE+gene+silencing+for+hematologic+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Res%22%5BJournal%5D)">TRUE gene silencing for hematologic malignancies.</a> Leukemia Res. 38, 729(2014).</li>
</ol>

新潟薬科大学は、ヘプタマー型sgRNAのサブセットについて特許出願中です。

ほとんどの場合、注射用水グレードの水(濃度100μM)に溶解した完全に2'-O-メチル化、5'-および3'-リン酸化ヘプタマー型sgRNAは、癌細胞のアポトーシスを誘導する活性から判断すると、少なくとも1年間-20°C未満で安定しているようです。ただし、それらの安定性は、その配列、品質、純度によって異なります。場合によっては、質量分析から判断すると、sgRNA分子の一部の5'-または3'-リン酸は、保存中に自発的に除去されるように見えますが、これはそれらの活性に深刻な影響を与えない可能性があります。
ライブラリースクリーニングによってヒットsgRNAが得られた場合、その細胞標的RNAは、DNAマイクロアレイおよび/または次世代シーケンシングによるトランスクリプトーム解析によって見つけることができます。しかし、これまでに得られたデータは、ヘプタマー型sgRNAを介した標的RNAのダウンレギュレーションレベルは、トランスフェクション試薬10、12、14、17、18の有無に関係なく、通常中程度であることを示唆している。 
<p class=...

（TRナーゼZ Lの後に呼ばれる- uは 電子 fficacious遺伝子サイレンシングをtilizing）TRUE遺伝子サイレンシングは、RNA依存性遺伝子サイレンシング技術1の1です。この技術が開発さtRNase Z L（または3 &#39;tRNase）、tRNAの3&#39;処理エンドリボヌクレアーゼの特性に基づいている：それは認識することにより、人工の小さなガイドRNA（sgRNA）の指示の下で任意の予想サイトで任意の標的RNAを切断することができますプレ-tRNA状または標的RNAとsgRNA 2との間に形成されたマイクロプレ-tRNA様構造- 9。長さのnt通常7月31日であるsgRNAは、4つのグループ、5&#39;-ハーフのtRNA、七量体RNA、14-ntのリニアRNA、およびフックRNAに分類されます。 15 -私たちは生きている細胞10内に様々な人工的に設計されたsgRNAsを導入することにより、TRUE遺伝子サイレンシングの有効性を実証しています。我々はまた、sgRNAs細胞ウィスコンシンによって取り込まれることが示されています任意のトランスフェクション試薬thoutとそれらの標的RNAのレベルを下方制御および/ ​​またはヒト癌細胞16においてアポトーシスを誘導することができる- 18。 21 - TRUE遺伝子サイレンシングは、tRNase Z Lと自然sgRNAs 19を介した細胞内および細胞間の遺伝子制御ネットワークシステム上で動作しているように見えます。 我々は、血液癌22のための潜在的な治療ヘプタマー型sgRNAsを検索するために156量体型sgRNAsを含むsgRNAライブラリーを構築しました。我々は、ヒト骨髄腫および白血病細胞の生存率に対する影響のためにスクリーニングし、それらの20を効率的に癌細胞株の少なくとも一方においてアポトーシスを誘導することができることを見出しました。それらの図4は、マウス異種移植実験において腫瘍の成長率を低下させることが示されています。 ここでは、血液癌に対する潜在的な治療薬のためのヘプタマー型sgRNAライブラリーのスクリーニングのためのプロトコルを提示します。プロトコルがどのように備えて細胞生存率に対する各sgRNAの効果を評価する方法、sgRNAライブラリーを構築するための方法、およびさらに、フローサイトメトリーによって効果的なsgRNAsを評価します。これらは、このプロトコルに含まれていないが、マウス異種移植モデルにおけるsgRNAの細胞標的RNAと有効sgRNAsの評価のための分析は、従来の方法17,22に従って行うことができます。

<table><tbody><tr><td>カスタムヘプタマー</td><td>RNA 日本バイオサービス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オリゴセップ HCカートリッジ</td><td>トランスゲノム</td><td>99-3860</td><td></td></tr><tr><td>注射用水 大</td><td>塚製薬&nbsp;</td><td>7131400A2129</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 中</td><td>和光</td><td>189-02025</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン混合液</td><td>ナカライ テスク</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>グライナー バイオワン</td><td>655 180</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンティングキット-8</td><td>同人堂</td><td>343-07623</td><td>WST-8solution</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー、Sunrise Thermo RC-R</td><td>TEKAN</td><td>510-82851</td><td></td></tr><tr><td>FACS 丸底チューブ</td><td>BD Falcon</td><td>60819-820</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P7059-1L</td><td></td></tr><tr><td>PE アネキシン V 結合緩衝液</td><td>BD Biosciences</td><td>51-66121E</td><td></td></tr><tr><td>PE アネキシン V</td><td>BD Biosciences</td><td>51-65875X</td><td></td></tr><tr><td>7AAD</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A9400-1MG</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター、FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>342973</td><td></td></tr></tbody></table>

true遺伝子サイレンシング：潜在的ながん治療薬の七量体型スモールガイドrnaライブラリーのスクリーニング

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE遺伝子サイレンシングは、（TRナーゼZ Lの後に呼ばれる- uは 電子 fficacious遺伝子サイレンシングtilizing）tRNAの3 &#39;処理エンドリボヌクレアーゼ、tRNase Z Lを導くために人工的な小さなガイドRNA（sgRNA）を利用する技術をサイレンシングRNA指向性遺伝子の一つであるが標的RNAを認識する。 sgRNAsは任意のトランスフェクション試薬なしで細胞によって取り込まれることができ、それらの標的RNAのレベルを下方制御および/またはヒトの癌細胞​​においてアポトーシスを誘導することができます。我々は、ヒト骨髄腫および白血病細胞の生存率に対する効果について156ヘプタマー型sgRNAsを含むsgRNAライブラリーをスクリーニングし、そしてそれらの20を効率的に癌細胞株の少なくとも一方においてアポトーシスを誘導することができることを見出しました。ここでは、血液癌に対する潜在的な治療薬のためのヘプタマー型sgRNAライブラリーのスクリーニングのためのプロトコルを提示します。プロトコルは、細胞生存率に対する各sgRNAの効果を評価する方法、sgRNAライブラリーを構築する方法を含み、そしてどのよう府へrtherは、フローサイトメトリーによる効果的なsgRNAsを評価します。約2,000ヒットは16,384ヘプタマーで構成されるフルスケールのsgRNAライブラリーをスクリーニングすることによって得られることが期待されます。

6ヘプタマー型sgRNAs 5&#39;-AUCUUCA-3 &#39;（H1885）、5&#39;-ACACACA-3&#39;（H3277）、5&#39;-GGGGGCG-3 &#39;（H10927）、5&#39;-GGGGCCC-3&#39;（H10944）、 5&#39;-GCCCCCG-3 &#39;（H12287）、および5&#39;-CACCAGC-3&#39;（H13260）は、化学的に5&#39;-および3&#39;-リン酸を含む2&#39;-OメチルRNAとして合成しました。 これらsgRNAsは、ヒト白血病細胞株HL60およびヒト骨髄腫細胞株、RPMI-8226の生存率に及ぼす影響について調べました。細胞生存率アッセイの代表的な結果が。 図1に4 sgRNAs H1885、H3277、H10927を示しており、H13260は非常に有効であったと、それぞれ&gt; 80％および...

ここでは、血液癌に対する潜在的な治療薬のためのヘプタマー型sgRNAライブラリーのスクリーニングのためのプロトコルを提示します。

TRUE遺伝子サイレンシング：潜在的ながん治療薬の七量体型スモールガイドRNAライブラリーのスクリーニング

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

このスクリーニングの全体的な目的は、血液がんに対する潜在的な治療薬を見つけることです。まず、ヘプタマー配列のサブセットを選択することからこの手順を開始します。配列はランダムに設定するか、特定の細胞内RNAを標的とするように設計してください。特定の細胞内RNAを標的とする場合は、適切なコンピュータプログラムを使用して、標的RNA内でTアームに類似したヘアピン構造を探索します。ヘアピンの直下流にある相補的な7ヌクレオチド配列を選択してください。制御細孔ガラス（CPG）担体上でホスホラミダイト法を用い、DNA-RNAシンセサイザーを使用して、選択した各ヘプタマーを、完全に2'-O-メチル化され、5'および3'末端がリン酸化されたRNAとして合成します。合成の最終サイクルでは、5'末端のDMT保護基を残したままにします。最終サイクルが完了した後、オリゴヌクレオチドが合成されたCPGをカラムからテフロンライナー付きスクリューキャップ付きガラスバイアルに移します。29%水酸化アンモニウムを1mL加え、チューブを55

true-gene-silencing-screening-heptamer-type-small-guide-rna-library

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここでは、細胞分裂に関与する遺伝子のハイスループットスクリーニングに人間esiRNAライブラリを使用してください。我々は、セットアップとesiRNA画面だけでなく、どのように結果を分析し、検証するために実施する方法を示します。...

哺乳動物細胞におけるRNAiスクリーニングのためのミッションesiRNA

ここでは、細胞の生存を促進する遺伝子標的を同定するために人間のLentiPlexプールされたライブラリと伝統的なシーケンシングメソッドを使用します。我々はセットアップとdeconvolute...

ミッションLentiPlexは、哺乳動物細胞ではshRNAライブラリースクリーニングをプールされた

RNA干渉（RNAi）は遺伝子ノックアウトよりも多くの利点を有し、広範に遺伝子機能研究のツールと​​して使用されています。...

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

ここでは、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを、3'...

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア...

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA...

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界

CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。...

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

転写因子の新しい調節因子を同定するために、我々は、二重ルシメラーゼベースの転写レポーターアッセイを用いて、配列レンチウイルスまたはレトロウイルスRNAiライブラリをスクリーニングするアプローチを開発した。このアプローチは、1回の実験で数百人の候補者をスクリーニングするための迅速かつ比較的安価な方法を提供します。...

アレイ化されたライブラリの中スループットスクリーニングとデュアルルシファーゼベースレポーターを用いた転写因子レギュレータの同定

レンチウイルスshRNAのプールを用いたハイスループットRNA干渉(RNAi)スクリーニングは、悪性腫瘍における治療上重要な合成致死的標的を検出するためのツールとなり得る。我々は、急性骨髄性白血病(AML)におけるエピジェネティックなエフェクターを調査するために、プールされたshRNAスクリーニングアプローチを提供する。...

薬物耐性表現型を調節する因子を同定するためのプールされたshRNAライブラリースクリーニング

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。...

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

学ぶ七量体型sgRNAライブラリーのスクリーニング法で、血がん治療薬候補を同定する実験手順です。遺伝子編集を応用した創薬研究に有用です。

TRUE遺伝子サイレンシング：潜在的ながん治療薬の七量体型スモールガイドRNAライブラリーのスクリーニング

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