Name: 大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 学ぶ大人の皮膚線維芽細胞からインスリン分泌細胞へのエピジェネティック変換法。多能性誘導やレトロウイルスベクターを用いず、安全かつ効率的に細胞を変換する技術を解説します。

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この作品は、Carraresi財団と欧州糖尿病財団（EFSD）によって賄われていました。 GPは、ミラノの大学のポスドクフェローシップによってサポートされています。著者は、COSTアクションFA1201 Epiconceptのメンバーである：エピジェネティクスとPericonception環境とコストのアクションBM1308共有は大型動物モデル（サラーム）に進みます。 TALBはCOSTアクションCM1406エピジェネティックなケミカルバイオロジー（EPICHEM）のメンバーです。

注：以下で説明するすべての手順は、無菌条件下で層流フードの下で実行する必要があります。その取り扱いを通して37℃に維持されているすべての培養手順は、サーモスタット制御ステージと細胞上で行われていることを確認します。 1.皮膚線維芽細胞の単離<ol><li>文化ディッシュ用塗布液を調製<ol><li>水（最終濃度0.1％）100mlにブタゼラチンを0.1gを溶解させます。オートクレーブで溶液を滅菌します。 </li><li> 35ミリメートルペトリ皿に無菌0.1％ブタゼラチンの1.5ミリリットルを追加します。室温でそれらを維持し、コートに2時間待ちます。 注：ヒト皮膚生検は、前腕の前面の無血管領域に局所麻酔下で切除することによって回収し、使用前に+4℃で2％抗生物質抗真菌溶液を補充したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に格納されています。 </li></ol></li><li>新しいPBSで洗浄生検は2％antibiを補っ耳の抗真菌ソリューション。 </li><li>場所の100ミリメートルペトリ皿の中の生検とは、滅菌メスで約2mm 3の断片に切断します。 </li><li>断片をメッキする直前に塗布液の過剰分を削除します。 </li><li>プレコート35ミリメートルペトリ皿に5-6皮膚の断片を配置します。 </li><li>線維芽細胞培養培地を調製：77％ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、高グルコース、20％ウシ胎児血清（FBS）、1％L-グルタミン溶液、2％抗生物質抗真菌溶液。 </li><li> 5％CO 2中で37℃で各フラグメント（断片あたり通常100μl）を、文化、それらの上に繊維芽細胞培地の液滴を追加します。 </li><li> 24時間後、5％CO 2中37℃で湿ったそれらを保つために断片上で線維芽細胞培養培地500μlを追加します。 </li><li>少なくとも一度は48時間ごとにピペットで培地を変更します。 </li><li>インキュベーションの6日後、慎重に組織片を除去し、それらを捨てます。 注：6日後、線維芽細胞sが組織片から成長し、細胞単層を形成するために開始することを開始します。 </li><li>培地を更新し、線維芽細胞培養培地2mlを追加し、5％CO 2インキュベーター中、37℃で細胞単層培養を続けます。 </li></ol> 2.線維芽細胞培養<ol><li> 37℃での培養線維芽細胞を5％CO 2中で80％コンフルエントになるまで</li><li>継代のために組織培養皿から吸引線維芽細胞培養培地。 4mlのPBSで細胞を3回洗浄し、1％抗生物質抗真菌ソリューションを補いました。 </li><li>トリプシン-EDTA溶液の薄い層（培地体積の10％）（0.8グラム/ Lのブタトリプシンとは0.2g / L EDTA）を添加し、細胞単層は、組織の下から分離し始めるまで37℃でインキュベート培養皿、細胞を解離します。 </li><li>トリプシンの作用を中和するために線維芽細胞培養培地の9部を、細胞懸濁液を希釈します。遠心分離は必要ありません。 </li><li>新しい培養皿でプレート細胞（と5％CO 2インキュベーター内で37℃でゼラチンアウト）と文化。成長率に応じて、4：2と1：1の間の通路比を保持します。 </li><li>細胞は約80％のコンフルエンス、通路それら（通常は週2回）に達したとき。 </li></ol>エピジェネティックな変換のための3線維芽めっき<ol><li>細胞培養皿に（1.1で説明したように準備し）0.26ミリリットル/ 0.1％のブタゼラチンのcm 2で追加します。コー​​トに2時間待ちます。 </li><li>線維芽細胞をプレーティングする前に塗布液の過剰10月30日分を削除してください。 </li><li>培養皿から線維芽細胞培養培地を除去します。 PBSで細胞を3回洗浄し、1％抗生物質抗真菌ソリューションを補いました。 </li><li>トリプシン-EDTA溶液の薄い層（培地体積の10％）（0.8グラム/ Lのブタトリプシンとは0.2g / L EDTA）を添加し、細胞単層は、組織の下から分離し始めるまで37℃でインキュベート培養皿、細胞を解離します。 </li><li> fibroblの9部で細胞懸濁液を希釈トリプシンの作用を中和するAST培地。 </li><li>室温で顕微鏡下で計数チャンバーを用いて細胞を数えます。 7.8×10 4個の線維芽細胞/ cm 2の細胞濃度を得るために、細胞を再懸濁するために線維芽細胞培養培地の必要量を計算します。これは、使用室の特定のタイプに依存します。 細胞/μlの=小グリッド×90（増倍率）×希釈あたりの細胞の平均数</li><li>室温で5分間150グラムで遠心し細胞懸濁液。上清を除去し、線維芽細胞培養培地の以前に計算された量で細胞を懸濁します。 </li><li> 0.1％ゼラチンプレコートディッシュ、5％CO 2インキュベーター中で37℃で24時間培養して上プレート細胞。 </li></ol>脱メチル化剤5-アザCRを使用して4.増加​​細胞の可塑性<ol><li> 0日目<ol><li> DMEM高グルコースメディ10ml中5-アザCRの2.44ミリグラムを溶解させることによって、5-アザ - CRストック溶液を調製しますええと。濾過により滅菌します。使用直前に5アザ-CRの株式を準備します。 </li><li>線維芽細胞培地（最終濃度1μM）1ml中、5-アザ - CRストック溶液1μlを希釈します。 </li><li> 、細胞プレーティング（小見出し3.8）24時間後の細胞の可塑性を高めるために、播種された線維芽細胞から培地を除去し、5％CO 2インキュベーター内で37℃で18時間、1μM5-アザCR原液と文化を追加します。 </li></ol></li><li> 1日目<ol><li> 表1に記載されているように、新鮮なヒト多能性（HP）培地を準備します。 </li><li> 1μM5-アザCRとのインキュベーション後、培地を除去し、5-アザCRが洗い流されることを保証するために、PBSで細胞を3回洗浄します。 </li><li> 5-アザCR 5％CO 2中で37℃で3時間（回復期間）は、HP培地で線維芽細胞を処理した培養します。 </li><li>回復期間の後、培地除去し、PBSで3回洗浄します。 </li><li> 5-アザCR処理の効率を監視するには、このステップfで確認または形態学的変化の存在は、（結果セクションで詳述します）。細胞は、線維芽細胞の典型的な細長い形態を失い、拡大核と、サイズが小さくなって、円形または楕円形の形状を取得します。 </li><li>膵臓分化に進みます。 </li></ol></li></ol> 5.膵臓分化プロトコル<ol><li>日1-6 <ol><li> 表2に記載されているように膵臓基礎培地を準備します。 </li><li>原液をアクチビン準備：滅菌水の166.6μlの組換えヒトタンパ​​ク質をアクチビン5μgのを溶解します。 </li><li>文化5は、アザ- CR 5％CO 2インキュベーター中、37℃で6日間（5.1.2を参照）1μL/ mlのアクチビン原液を補充し、0.26ミリリットル/ cmの膵臓基礎培地の2に線維芽細胞を処理しました。毎日培地に変更します。 </li></ol></li><li>日7-​​8 <ol><li>レチノインACIの50 mgのジメチルスルホキシド（DMSO）16.6 mlで添加することによって、レチノイン酸のストック溶液を調製D。 </li><li>膵臓基礎培地の0.26ミリリットル/ cm 2の中の培養細胞/ mlのアクチビン原液（5.1.2を参照）、37℃で2日間、1μL/ mlのレチノイン酸原液（5.2.1を参照）1μlの補足しました5％のCO 2。毎日培地に変更します。 </li></ol></li><li>日9-36 <ol><li>膵臓基礎培地0.26ミリリットル/ cm 2の中の培養細胞（v / v）のインスリン-トランスフェリン-セレン（ITS）、2％（v / v）のB27および0.1％（v / v）の組換えヒトFGFは、基本1％を補充しました5％CO 2インキュベーター中、37℃で（のbFGF）原液（ 表1参照）。最初の15日間、毎日培地を変更します。 </li><li>以降16日目からは、培養皿の底から切り離すことが集計セルを形成するので、顕微鏡下で、一日おきに培地を更新します。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+adult+pancreatic+exocrine+cells+to+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells.</a> Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).</li>
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<li>Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+azacytidine+step+allows+the+conversion+of+suspension+human+fibroblasts+into+neural+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells.</a> Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).</li>
<li>Plath, K., Lowry, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+reprogramming+to+the+induced+pluripotent+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state.</a> Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).</li>
<li>Taylor, S. M., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+phenotypes+induced+in+10T1%2F2+and+3T3+cells+treated+with+5-azacytidine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine.</a> Cell. 17 (4), 771-779 (1979).</li>
<li>Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+induced+by+5-azacytidine+does+not+affect+fragile+X+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression.</a> Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).</li>
<li>Do, J. T., Scholer, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+of+embryonic+stem+cells+reprogram+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells.</a> Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).</li>
<li>Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+pluripotency+determined+and+maintained%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How is pluripotency determined and maintained?</a> Development. 134 (4), 635-646 (2007).</li>
<li>Kahan, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+precursors+and+differentiated+islet+cell+types+from+murine+embryonic+stem+cells%3A+an+in+vitro+model+to+study+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation.</a> Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

本原稿は、組織特異的な誘導プロトコールに続いて5-アザCR、過渡および短時間の曝露を介して、インスリン産生細胞へのヒト皮膚線維芽細胞の変換を可能にする方法を説明します。このアプローチは、転写因子またはマイクロRNAの強制発現や細胞がより不安定とミス14になりやすいなり安定した多能性状態の取得、なし、中胚葉から内胚葉関連細胞への切り替えを可能にします。 第1のステップでは、細胞の可塑性は、最終分化細胞に一過性、可逆的な寛容状態を誘導する合成エピジェネティックな修飾子のおかげで増加します。具体的には、5-アザCRは、皮膚線維芽細胞の全体的なメチル化の減少を引き起こすために使用されました。 5-アザCR直接メチルトランスフェラーゼ活性を阻害し、新たに合成されたDNAに新規メチル化を防ぐことが知られています。理由は、その効果の、この分子以前にサイレント遺伝子を再活性化するだけでなく、真核細胞15,16の分化状態を変更するために使用されています。これと一致して、ポスト5アザ- CRの皮膚線維芽細胞は、本実験に用いられる細胞内で可塑...

再生医療の基本的な目的は、修理または損傷置き換えるために使用することができる新しい機能細胞の生成は、組織を縮退します。別の細胞型からそれらを変換することによって、新しいものに容易に利用可能な成体細胞をリメイク、必要な細胞集団が豊富なまたはアクセスすることは困難ではない場合は特に、特に魅力的なアプローチです。しかし、成体細胞が著しく安定しています。彼らは成熟した端末専門に達すると、彼らは安定して1を保持し 、そのオプションの緩やかな制限を介して自分の分化状態を取得します。 体細胞（IPS）の多能性への再プログラミングを可能にするプロトコルの数が開発されている最後の年では、転写のセットは2,3因子の強制発現によって達成。あるいは、細胞の変換は、単一の4を導入し 、直接系列分化転換することによって得ることができます</supは&gt;または転写の組み合わせは、5-7因子 。この戦略は、脱分化状態を経て移行を伴うが、特定の転写因子8の高発現を必要としません。 我々は最近、シチジン類似体5-アザシチジン（5-アザCR）、よく特徴付けられたDNAメチル化酵素阻害剤の脱メチル化特性に成体細胞の短時間の暴露に基づいて、変換プロトコルを開発しました。脱メチル化工程は、直ちに必要な端末の表現型を得ることを可能にする特異的な分化プロトコール9-11が続きます。この方法は、異なる系統の細胞への成熟、分化した細胞に変換することができ、ウイルスベクターを使用すると、任意の外因性の転写因子のトランスフェクションの両方を避けるために実質的な利点を有しています。セルの不安定性への安定した多能性状態の取得、及び関連する感受性の増加も避けられます。 <p class=「jove_content &quot;&gt;ここに提示され、完全に機能するインスリン分泌細胞への成人ヒト皮膚線維芽細胞の変換を可能にする詳細なプロトコール。しかし、種々​​の分化経路に向けてセルをアドレス指定するとき技術は、異なる細胞型に適用され、肯定的な結果を生成したことは注目に値します。さらに、エピジェネティックな変換が成功したアプローチの広い有効性と堅牢性を示唆している（原稿は提出）は、ヒトおよびブタの種9-13ならびに犬で使用されています。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td>PBS; 細胞洗浄および溶液調製用</td></tr><tr><td>抗生物質 抗真菌剤溶液</td><td>ΣA5955</td><td>線維芽細胞、HPおよび膵臓培地の成分</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ペトリ皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>線維芽細胞単離用</td></tr><tr><td>豚ゼラチン</td><td>シグマ</td><td>G1890</td><td>皿コーティング用</td></tr><tr><td>ウォーター</td><td>シグマ</td><td>W3500</td><td>溶液調製用</td></tr><tr><td>35mmシャー</td>レ <td>Sarstedt</td><td>83.39</td><td>線維芽細胞単離</td></tr><tr><td>用 DMEM、高グルコース、ピルビン酸</td><td>ライフテクノロジー</td><td>41966052</td><td>線維芽細胞培養培地用</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>ライフサイエンステクノロジー</td><td>10500064</td><td>FBS;線維芽細胞およびHP培地の成分</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>シグマ</td><td>G7513</td><td>線維芽細胞、HPおよび膵臓培地の成分</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA溶液</td><td>シグマ</td><td>T3924</td><td>線維芽細胞解離用</td></tr><tr><td>KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS</td><td>Hycor Biomedical</td><td>87144</td><td>Cell counting</td></tr><tr><td>5-Azacytidine</td><td>Sigma</td><td>A2385</td><td>5-aza-CR, for increrase cell線維芽細胞の可塑性</td></tr><tr><td>ハムのF-10栄養素ミックス</td><td>ライフテクノロジー</td><td>31550031</td><td>HPミディア</td></tr><tr><td>ムDMEM、低グルコース、ピルビン酸</td><td>ライフテクノロジー</td><td>31885023</td><td>HPミディア</td></tr>ム<tr><td>ノックアウト 血清補充</td><td>ライフテクノロジー</td><td>10828028 HP</td><td>ミディア</td></tr>ム<tr><td>の成分 MEM非必須アミノ酸溶液</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11140035</td><td>HPおよび膵臓基礎培地の成分</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Σ</td><td>M7522</td><td>HPおよび膵臓基礎培地の成分</td></tr><tr><td>グアノシン</td><td>Sigma</td><td>G6264</td><td>HP培地のヌクレオシドミックスストック</td></tr><tr><td>アデノシン</td><td>Sigma</td><td>A4036</td><td>HP培地のヌクレオシドミックスストック HP培地のストック成分</td></tr><tr><td>シチジン</td><td>シグマ</td><td>C4654</td><td>HP培地のヌクレオシドミックスストック成分</td></tr><tr><td>ウリジン</td><td>シグマ</td><td>U3003</td><td>HPミディアムのヌクレオシドミックスストック成分</td></tr><tr><td>チミジン</td><td>シグマ</td><td>T1895</td><td>HPミディアムのヌクレオシドミックスストック成分</td></tr><tr><td>Millex-GS 0,22 & micro;m</td><td>ミリポア</td><td>SLGS033SB</td><td>溶液の滅菌用</td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) 組換えヒトタンパク質</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td>bFGF;HPおよび膵臓基礎培地ウ</td></tr><tr><td>シ血清アルブミン</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td>BSAの成分。膵臓基礎培地の成分</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ライフテクノロジー</td><td>11320074</td><td>膵臓基礎培地用</td></tr><tr><td>B-27サプリメント マイナスビタミンA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>12587010</td><td>膵臓培地の成分</td></tr><tr><td>N-2 サプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td><td>17502048</td><td>膵臓基礎培地の成分</td></tr><tr><td>アクチビンA 組換えヒトタンパク質</td><td>ライフテクノロジー</td><td>PHG9014</td><td>膵培地</td></tr>用 <tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>膵臓培地</td></tr>用 <tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>ΣD2650</td><td>DMSO; レチノイン酸ストック調製用</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium</td><td>Life Technologies</td><td>41400045</td><td>ITS; 膵剤 最終培地</td></tr><tr><td>用 抗ビメンチン抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab8069</td><td>免疫細胞化学分析用。作業希釈 1:100</td></tr><tr><td>4&prime;,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩</td><td>Sigma</td><td>32670</td><td>DAPI.免疫細胞化学分析用。作業希釈率&nbsp;1 &マイクロ;g/ml</td></tr><tr><td>5-メチルシチジン</td><td>Eurogentec</td><td>MMS-900P-B</td><td>免疫細胞化学分析用。使用希釈率 1:500</td></tr><tr><td>抗Cペプチド抗体&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab14181</td><td>免疫細胞化学分析用。使用希釈液 1:100</td></tr><tr><td>Anti-PDX1 anti-PDX1 antibody&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab47267</td><td>免疫細胞化学分析用。作業希釈率 1:500</td></tr><tr><td>Mercodia Insulin ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1113-10</td><td>インスリン放出検出用</td></tr></tbody></table>

大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換

Epigenetic Conversion as a Safe and Simple Method to Obtain Insulin-secreting Cells from Adult Skin Fibroblasts

再生医療は、変性または損傷した組織を修復するために、患者に届けられる新しい完全に機能する細胞を必要とします。そのような細胞が容易に利用できない場合、それらは、多くの中で、リプログラミングおよび分化転換を含む異なるアプローチを用いて得ることができ、異なる技術に特有の利点および制限を有する。ここでは、成体成熟線維芽細胞をインスリン分泌細胞に変換するための新しい戦略(エピジェネティックな変換細胞(EpiCC)として任意に指定されています)について説明します。この方法は、細胞の運命と分化のエピジェネティックな制御を制御するメカニズムの理解が深まっていることに基づいて開発されました。特に、最初のステップでは、エピジェネティックな修飾因子、すなわち5-アザ-シチジンを使用して、成体細胞を「非常に寛容な」状態に追い込みます。次に、このエピジェネティックな可塑性の短く可逆的な窓を利用して、細胞を別の系統に再アドレス化します。このアプローチは「エピジェネティックな細胞変換」と呼ばれています。これは、効率的で制御された安定した細胞系間スイッチを得るためのシンプルで堅牢な方法です。このプロトコルは遺伝子トランスフェクションの使用を伴わず、ウイルスベクターを含まず、安定した多能性状態を伴わないため、トランスレーショナルメディシンのアプリケーションとして非常に有望です。

皮膚生検からの初代培養の確立 皮膚生検を小片に切断し、ゼラチンプレコート皿に入れました。 6日後、線維芽細胞は組織断片から成長し始め、細胞単層（ 図1A）を形成しました。細胞は、典型的な細長い形状を示したと、期待どおりに、線維芽細胞特異的マーカーであるビメンチン（Vimの、 図1B）のために均一な免疫陽性を示しました。 5-アザ-CRに18時間曝露後の形態学的変化および皮膚線維芽細胞のメチル化パターン インスリン分泌細胞への線維芽細胞の正常なエピジェネティックな変換を得るために、我々は、5-アザCR、脱メチル化剤を使用して、可塑性を増加させました。ヒト線維芽細胞は、7.8×10 4線維芽細胞/ cm 2の濃度で0.1％ゼラチンを予めコートディッシュ上にプレーティングしました。ワット、細胞を播種した後二十四時間ERE 18...

ここでは、成体の皮膚線維芽細胞をインスリン分泌細胞に変換する新しい方法が紹介されています。この技術はエピジェネティックな変換に基づいており、レトロウイルスベクターの使用や安定した多能性状態の獲得を伴いません。したがって、トランスレーショナルメディシンの応用に非常に有望です。

Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such ...

本手順の全体的な目的は、多能性を誘導したりレトロウイルスベクターを使用したりすることなく、線維芽細胞をインスリン分泌細胞に変換することです。この手法は、再生医療分野、特に糖尿病の細胞治療における重要な疑問への回答に寄与します。本技術の主な利点は、変換細胞において安定した多能性状態を誘導することなく、またレトロウイルスベクターを使用せずに、表現型の転換を実現できる点にあります。本手順の実演は、当研究室のポストドクターであるGeorgia Pennarossaが行います。まず、35 mmペトリ皿に滅菌済みの0.1% porcine gelatinを1.5 mL加え、室温で2時間コーティングします。次に、2% antibiotic antimycotic solutionを添加したPBSでヒト皮膚生検検体を洗浄します。その後、生検組織を100 mmのペトリ皿に移し、滅菌メスを用いて約2 mm³の断片に細切します。次に、5〜6個の皮膚断片をあらかじめコーティングした35 mmのペトリ皿に入れます。各断片の上に線維芽細胞培地を1滴滴下し、37 °C、5% CO2条件下で培養します。6日間のインキュベーション後、組織片を慎重に取り除きます。線維芽細胞が組織片から増殖し始め、細胞単層を形成し始めます。この手順では、線維芽細胞を37 °C、5% CO2条件下で、コンフルエンスが80%になるまで培養します。その後、細胞を新しい培養皿に播種します。37 °C、5% CO2条件下で培養し、増殖速度に応じて継代比を1:2から1:4の間に維持します。次に、細胞培養皿に0.1% 豚ゼラチンを加え、2時間コーティングします。線維芽細胞を播種する10〜30分前に、余分なコーティング溶液を除去します。次に、培養皿から線維芽細胞の培養液を除去します。1%抗生物質・抗真菌剤溶液を添加したPBSで、細胞を3回洗浄します。次に、Trypsin-EDTA溶液を薄く加えます。細胞単層が組織培養皿の底から剥離し始め、細胞が分散するまで37°Cでインキュベートします。その後、トリプシンの活性を中和するため、細胞懸濁液に9倍量の線維芽細胞培養液を加えて希釈します。次に、室温で顕微鏡を用いて細胞計数器で細胞数を計測します。細胞を再懸濁し、1 cm²あたり7.8 × 10⁴個の線維芽細胞という細胞濃度にするために必要な線維芽細胞培養液の量を算出します。その後、細胞懸濁液を室温で150 gで5分間遠心分離します。次に、上清を除去し、計算した量の線維芽細胞培地で細胞を再懸濁します。その後、0.1% ゼラチンでプレコートしたディッシュに細胞を播種し、37 °C、5% 二酸化炭素条件下で24時間培養します。0日目に、使用直前に、2.44 mg の 5-aza-CR を 10 mL の DMEM high glucose 培地に溶解させて 5-aza-CR ストック溶液を調製します。ろ過滅菌します。次に、5-aza-CRストック溶液1 µLを線維芽細胞培養基1 mLで希釈します。細胞の可塑性を高めるため、細胞播種から24時間後に、播種した線維芽細胞から培養基を除去します。1 $\mu$Mの5-aza-CRストック溶液を添加し、37 °C、5% $\text{CO}_2$条件下で18時間培養します。1日目に、新鮮なHP培地を調製しておきます。1 $\mu$Mの5-aza-CRによるインキュベーション後、培地を除去し、HP培地で細胞を3回洗浄して、5-aza-CRを完全に洗い流します。次に、5-aza-CR処理した線維芽細胞をHP培地中で37°C、5% carbon dioxideの条件下で3時間インキュベートします。5-aza-CR処理の効率をモニタリングするため、形態変化を確認してください。細胞は線維芽細胞特有の伸長した形態を失い、核が肥大したより小さな円形または楕円形の形状になります。1日から6日目にかけて、膵臓基礎培地およびActivin Aストック溶液を調製します。次に、Activin Aストック溶液を添加した膵臓基礎培地を用いて、5-aza-CR処理済みの線維芽細胞を37°C、5% carbon dioxideの条件下で6日間培養し、培地を毎日交換します。7日から8日目にかけて、50 mgのレチノイン酸に16.6 mLのDMSOを加えて、レチノイン酸ストック溶液を調製します。Activin Aストック溶液およびレチノイン酸ストック溶液を添加した膵臓 basal Mediumを用いて、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で細胞を2日間培養し、培地を毎日交換する。9日目から36日目にかけては、ITS、B27、およびBFGSストック溶液を添加した膵臓 Basal Mediumで細胞を培養し、最初の15日間は毎日培地を交換し、16日目以降は1日おきに培地を更新する。細胞は37 °C、5% carbon dioxideの条件下で培養する。この図は、内分泌膵分化中に起こる形態学的変化を示しています。誘導から7日後、ヒト細胞は徐々にクラスターを形成します。レチノイン酸の添加に反応して、細胞は網状パターンに再編成され、識別可能な凝集体として集まります。これらの形成物は時間の経過とともに進行し、細胞を取り込みながら拡大した3Dコロニーを凝集させます。最終的に、コロニーは球状構造となり、培養液中で遊離して自由に浮遊する傾向を示しますが、これはin vitroにおける典型的な膵島に似ています。膵臓への誘導から36日後、ヒトエピジェネティック変換細胞の全ゲノムDNAメチル化レベルは、未処理の線維芽細胞で観察されたレベルまで戻りました。未処理の線維芽細胞ではこれらの内分泌膵マーカーが完全に欠如しているのに対し、転換期間の終了時にはPDX1とCPEPの共局在が観察されます。このグラフは、20 millimolar D-glucoseおよび20 millimolar L-glucoseへの曝露に応答した、エピジェネティック転換細胞からのインスリン放出量を示しています。この手法に習熟し、適切に実施すれば、38日間で完了させることができます。本研究の開発後、再生医療分野の研究者がヒトにおける糖尿病の細胞治療を探索するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、多能性を誘導せず、またレトロウイルスベクターも使用せずに、線維芽細胞をインスリン分泌細胞に変換する方法について十分に理解していただけるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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エピソームおよびHDAC阻害剤を用いて血液からの効率的なiPS細胞の生成

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

直接神経細胞リプログラミングと、開始の体細胞の年齢を維持するニューロンが生成されます。ここでは、大人の人間のドナーから得られる皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞を生成する単一ベクトル...

ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

ここで初期化因子をエンコード変更された Mrna を用いた誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞をプログラムし直すための臨床的に関連性の高い、高効率、フィーダー フリー法について述べるし、成熟したマイクロ Rna 367/302 を模倣しています。リプログラミング効率を評価する手法クローン iPSC のコロニーを拡大し、トラ 1 60...

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。...

エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

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線維芽細胞からニューロン前駆細胞への直接変換とアストロサイトへの分化を用いた神経疾患のインビトロモデリング

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マウス線維芽細胞のメラノサイトへの直接リプログラミング

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。...

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

学ぶ大人の皮膚線維芽細胞からインスリン分泌細胞へのエピジェネティック変換法。多能性誘導やレトロウイルスベクターを用いず、安全かつ効率的に細胞を変換する技術を解説します。

大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換

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