大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換

この手順の全体的な目標は、多能性を誘導したり、レトロバイタルベクターを使用したりすることなく、線維芽細胞をインスリン分泌細胞に変換することです。この方法は、再生医療分野、特に糖尿病の細胞治療における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、変換細胞に安定した多能性状態を誘導することなく、またレトロウイルスベクターを使用せずに、表現型のスイッチを取得できることです。

その手順を実演するのは、私たちの研究室のポスドクであるGeorgia Pennarossaです。この手順を開始するには、1.5ミリリットルの滅菌0.1%ブタゼラチンを35ミリメートルのシャーレに加え、室温で2時間コーティングします。次に、2%抗生物質抗真菌薬溶液を添加したPBSでヒトの皮膚生検を洗浄します。

その後、生検を100ミリメートルのシャーレに入れ、滅菌メスで約2立方ミリメートルの断片に切断します。次に、事前にコーティングされた35ミリメートルのシャーレに5〜6個の皮膚の破片を入れます。各フラグメントに線維芽細胞培地の液滴を追加し、5%二酸化炭素中で摂氏37度で培養します。

インキュベーション後6日後、組織片を慎重に廃棄します。線維芽細胞は組織片から成長し始め、細胞単層を形成し始めるはずです。この手順では、線維芽細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で80%コンフルエンスまで培養します。

次に、細胞を新しい培養皿にプレートします。5%の二酸化炭素で摂氏37度で培養し、成長率に応じて通過率を1対2から1対4に保ちます。次に、0.1%ブタゼラチンを細胞培養皿に加え、2時間コーティングします。

線維芽細胞をめっきする10〜30分前に、余分なコーティング液を取り除きます。次に、培養皿から線維芽細胞培養培地を取り出します。1%抗生物質抗真菌溶液を添加したPBSで細胞を3回洗浄します。

次に、トリプシン-EDTA溶液の薄層を追加します。細胞単層が組織培養皿の底部から剥離し始め、細胞が解離するまで、摂氏37度でインキュベートします。その後、トリプシン作用を中和するために、細胞懸濁液を9部の線維芽細胞培養培地で希釈します。

次に、室温で顕微鏡下の計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。細胞を再懸濁し、1平方センチメートルあたり10〜4番目の線維芽細胞の7.8倍の細胞濃度を得るために必要な線維芽細胞培養培地の量を計算します。続いて、細胞懸濁液を室温で5分間150gで遠心分離します。

次に、上清を除去し、計算された量の線維芽細胞培養培地で細胞を再懸濁します。その後、0.1%ゼラチンプレコート皿に細胞をプレートし、5%二酸化炭素中で摂氏37度で24時間培養します。0日目、使用直前に、2.44ミリグラムの5-aza-CRを10ミリリットルのDMEM高グルコース培地に溶解して、5-aza-CRストック溶液を調製します。

ろ過して滅菌します。次に、1マイクロリットルの5-aza-CR原液を1ミリリットルの線維芽細胞培養液に希釈します。細胞の可塑性を高めるために、細胞プレーティングの24時間後に、播種した線維芽細胞から培地を取り除きます。

1マイクロモルの5-aza-CRストック溶液を加え、5%二酸化炭素中で摂氏37度で18時間培養します。初日は、新しいHPミディアムを準備します。1マイクロモルの5-aza-CRでインキュベートした後、培地を取り出し、HP培地で細胞を3回洗浄して、5-aza-CRが洗い流されるようにします。

次に、5-aza-CRで処理した線維芽細胞をHP培地で5%二酸化炭素中37°Cで3時間インキュアします。5-aza-CR治療の効率をモニターするには、形態学的変化がないか確認します。細胞は、線維芽細胞の典型的な細長い形態を失い、核が拡大した小さな円形または楕円形を獲得するはずです。

1日目から6日目に、膵臓の基礎培地とアクチビンAのストック溶液を準備します。次に、5-aza-CRで処理した線維芽細胞を、アクチビンAストック溶液を添加した膵臓基礎培地で、5%二酸化炭素中37°Cで6日間培養し、培地を毎日交換します。7日目から8日目に、50ミリグラムのレチノイン酸に16.6ミリリットルのDMSOを加えて、レチノイン酸原液を調製します。

アクチビンA原液とレチノイン酸原液を添加した膵臓基礎培地で、5%二酸化炭素中37°Cの2日間培養し、培地を毎日交換します。9日目から36日目に、ITS、B27、およびBFGSストック溶液を補充した細胞と膵臓基礎培地を培養し、最初の15日間は毎日培地を交換し、16日目以降は隔日で培地をリフレッシュします。細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素で培養します。

この図は、内分泌膵臓分化中に起こる形態学的変化を示しています。誘導の7日後、ヒト細胞は徐々にクラスターに組織化されます。レチノイン酸の添加に応答して、それらは網状パターンで再配置され、識別可能な凝集体に集まります。

これらの形成は時間とともに進行し、細胞を動員し、拡大した3Dコロニーを凝集します。最後に、コロニーは球状の構造になり、分離する傾向があり、培養液中を自由に流れ、in vitroでの典型的な膵島を彷彿とさせます。膵臓導入の36日後、ヒトエピジェネティックに変換された細胞の全体的なDNAメチル化レベルは、未治療の線維芽細胞で観察されたものに戻りました。

PDX1とCPEPとの共局在は、変換期間の終わりに観察されますが、これらの内分泌膵臓マーカーは未治療の線維芽細胞には完全に存在しません。このグラフは、20ミリモルのD-グルコースと20ミリモルのL-グルコースへの曝露に応答したエピジェネティックな変換細胞からのインスリン放出量を示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば38日で完了します。

その開発後、この研究は、再生医療の分野の研究者がヒトにおける糖尿病の細胞療法を探求する道を開きました。このビデオを見れば、多能性を誘導したり、レトロウイルスベクターを使用したりすることなく、線維芽細胞をインスリン分泌細胞に変換する方法についてよく理解できるはずです。