腸管虚血 - 再灌流傷害のマウスモデル

この手順の全体的な目標は、上腸間膜動脈の末梢および末端側副枝を一時的に閉塞することにより、マウスジスタリリウム領域で再現性のある腸虚血再灌流誘発傷害を行うことです。この方法は、膝蓋骨の損傷や再生のメカニズムの理解など、消化器病学や免疫学の分野における基本的な方法を理解するのに役立ちます。この手法の利点は、ラボの訓練を受けた個人なら誰でも実行できることです。

もう一つの利点は、この手順自体がマウスの死亡率を引き起こさないことです。テキストプロトコルで指定されているように手術部位を準備します。次に、手術用ハサミを使用して、3〜5ミッドラインセンチメートル開腹術を行います。

次に、生理食塩水で湿らせた滅菌済みの非接着性パッドで手術領域を覆います。盲腸と腸骨を分離し、生理食塩水で湿らせた綿棒を使用して上腸間膜動脈を露出させます。次に、クリップの適用を容易にするために、ストレス鉗子を使用して腸を穏やかに持ち上げ、虹彩はさみを見つけて、上腸間膜動脈の両側の中間体を目的のクリップ位置に切断します。

腸を持ち上げた状態で、もう一方の手でクリップアプライヤーをそっと握り、高品質の70G-Force微小血管クリップの顎を開きます。次に、クリップを血管に置き、顎を静かに解放して血管を閉塞します。上腸間膜動脈の一次枝の閉塞により、盲腸に隣接する虚血性腸骨の5〜7センチメートルの領域が作成されるまで、同じ方法でさらに1〜2個の微小血管クリップを配置します。

次に、腸全体に2つの40Gフォース微小血管クリップを配置して、側副血流を遮断し、虚血性腸領域をマークします。すべてのクリップが所定の位置に配置されたら、摂氏37度の生理食塩水で湿らせた滅菌済みの繊細なワイプを手術部位に塗布し、綿密なモニタリングで虚血を60分間維持します。虚血の処置が正しく行われていれば、約30分でその領域がワインレッドに変わり、クリップ位置から遠位の血管が拡大し、閉塞が成功したことを示します。

虚血の終わりに、虚血領域の端に10マイクロリットルのギルヘマトキシリンを印を付けて、虚血性および隣接する健康な組織の採取を容易にします。虚血の終わりに、クリップ領域に生理食塩水を数滴加え、クリップアプライヤーで微小血管クリップを静かに取り外します。次に、生理食塩水で湿らせた綿の先端を使用して、腸を腹腔内にそっと押し戻します。

非粘着性パッドを取り外し、9ミリメートルのステンレス製のスチール創傷クリップを使用して腹壁と皮膚を閉じます。動物を加熱された清潔なケージに所望の再灌流期間保持し、マウスを30分ごとにチェックして安定性を確認します。再灌流の終わりに、マウスを安楽死させ、腹腔を開き、虚血性および隣接する健康な正常組織を採取します。

次に、生理食塩水を充填した強制針を装備した30ミリリットルの注射器を使用して腸内容物を洗い流し、その後腸を縦方向に切断します。遺伝子発現解析に腸のサンプルが必要な場合は、縦に5〜2ミリメートルの1ポイントのフラグメントを予約してください。組織学的分析では、一対の鉗子を使用して腸をスイスロールに巻き、生検フォームパッドの間のインテンシブピースをカセットに入れます。

最後に、カセットを10%緩衝ホルマリンに入れて、虚血性で健康な腸組織を固定します。ここでは、コントロールから調製されたスイスロールを含む代表的な組織カセット、および1時間の虚血および1時間の再灌流後の腸骨の虚血領域が示されている。対照組織と虚血組織の色の違いに注意してください。

また、処理および染色中のコントロール腸および虚血再灌流腸の位置決めを容易にするために、脾臓の一部も含まれていました。これらの画像では、コントロールの代表的なヘマトキシリンとエオシンの染色、および虚血の1時間後、または虚血の1時間後に2時間の再灌流後の腸骨の虚血領域が示されています。出血性VILI、クリップスの部分的または完全なアブレーションを伴う上皮の脱核、および免疫細胞の浸潤を特徴とする、虚血の1時間後に観察された上皮の深刻な損傷に注意してください。

2時間の再灌流後、VILIの損傷と炎症は持続しますが、組織出血はありません。虚血性腸管および対照腸における虚血再灌流の1時間後および2時間後の炎症性小腎発現の分析は、TNFα、IL one β、IL six sideacineのアップレギュレーション、ならびに対照健組織と比較して、両方の虚血再灌流条件下でのCxcl 2 chemokine mRNA発現の増加を示しています。このテクニックを習得すると、3時間半で完了して適切に実行できます。

このビデオを見た後、あなたは再現性のある腸虚血再灌流傷害を実行する方法についてよく理解しているはずです。