Name: エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶエンドウアブラムシAcyrthosiphon pisumの胚における免疫染色プロトコル。組織透過性を向上させ、バックグラウンド染色を減少させる重要な条件を同定し、タンパク質発現検出の精度を高める方法を解説します。

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モノクローナル4D9抗体を提供してくださったChau-Ti Ting氏(台湾のFly Core社)、共焦点顕微鏡法を提供してくださったNTU生命科学部のTechnology Commons社(TechComm)、原稿の校正をしてくださったHsiao-Ling Lu氏、撮影を手伝ってくれたChen-yo Chung氏に感謝します。CCは特に、戦略的な提案を提供し、原稿の批判的な編集を行ったCharles E. Cookに感謝します。この研究は、科学技術部(101-2313-B-002-059-MY3および104-2313-B-002-022-MY3(GWLおよびCC用)および国立台湾大学(NTU-CESRP 101R4602D3、GWL用103R4000)の支援を受けました。

アブラムシの1.文化注：単為生殖胎生エンドウアブラムシAの実験室株エンドウは、もともと台湾中部に回収し、300以上の世代のために長日の光周期の下で宿主植物（エンドウのエンドウのマメやソラマメソラマメ ）で飼育されています（一世代：〜10日）。 <ol><li>種子の発芽<ol><li>室温で3〜5日間水道水に宿主植物の種子を浸します。 1日1回、新鮮な水を補充します。 注：別の方法として、ストレート湿った土壌に宿主植物の種子を置くことだけでなく、発芽を誘導することができます。 </li><li>光周期16時間の明/ 20℃で8時間の暗闇の下で成長チャンバー内の土壌を持つ小さなポット（直径9cm×7センチ）で10発芽種子を栽培。 </li><li>成長が始まる約10日後に、その高さが8つ以上センチ、植物にアブラムシを移します。 </li></ol></li><li>アブラムシの譲渡<oL&gt; <li>絵筆を使用して植物に8大人のアブラムシ転送、1リットルのガラスビーカー内の植物のそれぞれの鍋を保持し、その後、逃げるのアブラムシを防ぐために、このようなガーゼメッシュなどの通気性のカバーでビーカーをシール。 </li><li> 20℃での光周期16時間明/ 8時間暗下で成長チャンバー内のアブラムシをインキュベートします。毎日一回植物の各植木鉢に水を。 </li><li>アブラムシの次の世代を得るために、手順を繰り返す1.1.3-1.2.2 10日の一次アブラムシ転送後。 </li></ol></li></ol> 2.解剖と卵巣の固定<ol><li>新たに固定緩衝液として1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中4％パラホルムアルデヒド（PFA）を調製。 </li><li> PFA（約500μL）と、スポットプレートの1つのウェルを記入し、低倍率での立体顕微鏡下でプレートを配置し、解剖用のPFA内の大人のアブラムシを沈めます。 </li><li>背の切開、鉗子の一組で頭と腹部を保持することによって卵巣を解剖腹部のクチクラ、および腹腔から離れて卵巣をドラッグします。 </li><li>室温で20分間PFAの1ミリリットルを含む1.5 mlチューブに卵巣の3組を修正しました。 </li><li>トランスファーピペット（ガラスまたは使い捨てのいずれか）で固定バッファをデカントした後、10分間毎に1×PBS（PBST）中で0.2％トリトンX-100で3回卵巣を洗います。マイルドミキサー/ローテーターに揺れ（回転角：60°（F60）/回転数：8 RPM）は、固定および洗浄の両方をお勧めします。 </li></ol> 3.プロテイナーゼK（PK​​）での処置は、胚組織の透過性を高めるために注：PK処理は、生殖帯域拡張以降（開発段階11）からの胚に適用されます。若い胚の場合、このステップはオプションです。 <ol><li>直列作業濃度を1μg/ mlから1×PBSでPKのストック溶液（10mg / ml）に希釈します。 </li><li>穏やかな振盪しながら10分間、PK（約500μL）を1μg/ mlの卵巣をインキュベートします。 </li><li>デカントPK solutiそしてその後、グリシン700μlの（2 mg / mlの）5分ごとに、3回と卵巣を洗いに。 </li><li> 10分ごとに二回、0.2％PBSTで卵巣を洗ってください。 </li><li>軽度に振盪しながら室温で15分間固定緩衝液で再び卵巣を修正しました。 </li><li>上清を捨て、10分間ずつ二回、0.2％PBSTで卵巣を洗います。 </li></ol>内因性ペルオキシダーゼ（POD）活性を抑制するための4メタノールインキュベーション注：メタノールのインキュベーションは、メタノールに敏感であるファロイジン染色または抗体エピトープを施した胚には適用されません。 <ol><li>直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を脱水（3：1：1：1、3：V / V 1）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。 </li><li>穏やかな振盪しながら室温で1時間、100％メタノールで卵巣を脱水。 注：染色の良好な結果がまだで、100％メタノール中に保存したアブラムシの組織から得ることができる-20＃176; C 1ヶ月。 </li><li>直列0.2％PBST中のメタノールの異なる割合で卵巣を再水和（1：1：3：1：1 v / v 3）穏やかに撹拌しながら10分間、メタノール溶液の各濃度で卵巣をインキュベートすることによって。 </li></ol> 5.抗体染色<ol><li> 1XのDIGベースのバッファセット（DIG-B）から10倍のブロッキング溶液を希釈します。 注：1×DIG-Bブロッキング溶液は、5％（v / v）の正常ヤギ血清（NGS）からなる標準的なブロッキング試薬に比べ染色のバックグラウンドを低減し、0.5％（v / v）のウシ血清アルブミンに対してより効果的である（BSA ）0.2％PBSTインチ</li><li>穏やかな振盪しながら4℃でRTまたはO / Nで2.5〜4時間、1X DIG-Bブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。 注：1.5ミリリットルチューブ内の卵巣の三対のために、200μlのサンプルブロッキングと抗体染色のための最小量です。 </li><li>上清を除去し、適切なdilutiで一次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換比に。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。 注：ここで説明する実験では、一次抗体の次の最適な希釈液を使用します（1）ApVas1抗体：1：発色性染色のための500を、免疫蛍光染色のために1時50分。 （2）抗αチューブリン抗体：1：500; （3）4D9モノクローナル抗体：1：25。 </li><li> 15分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。 </li><li> 1X DIG-Bは、穏やかな振盪しながら室温で1時間ブロッキング溶液で卵巣をインキュベートします。 </li><li>上清を除去し、適切な希釈率で二次抗体を含む新鮮な1X DIG-Bのブロッキング溶液と交換してください。穏やかな振盪しながら4℃で、RTまたはO / Nで4時間のために卵巣を染色。 <ol><li>二次抗体の以下の希釈比を使用する：（1）免疫蛍光染色の場合：1：アレクサフルオロ633ヤギ抗ウサギIgGまたはAlexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGについて500。 （2）発色性染色のために1：ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG 200。 注：ビオチン化二次抗体を染色シグナルが著しく増幅されるを通して基板ベース（発色）の検出にアビジン - ビオチン複合体（ABC）と対話するために適用されます。 </li><li>二次抗体は、光に敏感であるため、免疫蛍光染色のために、暗所で染色を行います。 </li></ol></li><li> 10分ごとに0.2％PBSTで4回、二次抗体を洗い流します。 </li></ol> 6.核とF-アクチン染色注：これは、免疫蛍光染色のために適用されます。 <ol><li>暗所で室温で2時間、DAPI（2 NG /μL）およびファロイジンTRITC（100 nM）を含む0.2％PBSTで染色卵巣。 </li><li> 10分ごとに0.2％PBSTで4回の卵巣を洗ってください。 </li><li>穏やかな振盪しながら4℃で封入O / Nで卵巣をインキュベートします。 </li></ol> 7.シグナル開発注：これは、発色性染色のために適用されます。 <ol><li> 100μlの準備試薬アビジン - ビオチン複合体（ABC）、0.2％PBSTの98μlの試薬A（アビジン）の1μLを加え穏やかにピペッティングを経由して十分に混合し、試薬Bを1μlを追加することにより、信号を向上させるための（西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートビオチン）、即座に混合し​​ました。穏やかな振盪しながら室温で30分間混合物をインキュベートします。 </li><li>穏やかな振盪しながら室温で30分間、試薬AとBの混合物に（関連付けを解除卵室を含む）の卵巣をインキュベートします。 </li><li> 10分ごとに0.2％のPBSTで4回試薬A及びBの混合物を洗い流します。 </li><li>プラスチックスポイトでスポットプレート上のウェルに、PBST中に沈め卵巣を転送します。 </li><li> 3,3&#39;-ジアミノベンジジン（DAB）の基質溶液を調製：1 DABタブレットを加え、1分間激しくボルテックスを経由してのddH 2 O 1ml中の尿素過酸化水素を含む別のものを溶解させます。 注：DAB、ペルオキシダーゼの沈殿させる基板は、免疫染色のために人気の色原体です。これは、BRを生成ペルオキシダーゼによって酸化された後の自分と不溶性の沈殿物。弱い信号は、基質溶液（最終濃度0.05〜0.08％）と塩化ニッケルを添加することによって高めることができます。 </li><li>ウェル内に残っているPBST溶液を除去し、信号の開発のためのDAB基質溶液100μlを補充します。 </li><li>低倍率での実体顕微鏡下で信号の強度を監視します。 </li><li>すぐに1×PBSで再充填が続くDAB溶液を除去することにより反応を停止します。二回洗浄を繰り返します。 </li><li> 1.5mlチューブに戻って卵巣を転送した後、15分間ずつ二回、1×PBSまたはPBSTで洗浄します。 </li><li>穏やかな振盪しながら4℃でグリセロールベースの​​封入剤（70％グリセロール）、O / Nで卵巣をインキュベートします。 </li></ol> 8.アブラムシ胚をマウントします注：アブラムシ胚の厚さは、開発の段階との間で変化します。マウントの戦略は、このように、中間（ステージ、早期（germariaやステージ0-10）を合わせて変更されています11-18）、および図2Bに示されてい後期胚（ステージ19〜20）、 - D。胚のステージングは、三浦らを追った。12 <ol><li>プラスチックスポイト付きセルトレイにメディアをマウントするとともに卵巣を移し、低倍率でステレオ顕微鏡でサンプルを観察します。 </li><li>虫ピンを使用して横方向の卵管に関連する腎杯をカットした後、スポイトでよく空のグラスに分離された卵巣管を転送します。マウンティング培地を用いて50〜100μlに最終容量をアップしてください。 </li><li>ガラススポイトでスライド上に卵巣管を転送して、虫ピンを使用して卵室を分析。 注：開発のステージ6よりも古い胚の場合、卵室の分離が提案されています。 germariaとステージ6歳未満の最初の二つの卵室のために、分離はオプションです。 </li><li>ガラススポイトを使ってきれいなスライドに解剖卵室を再配置します。 </li><li>カバースリップ（サイズを置く：22×22ゆっくりと泡を避けるために、解剖germariaまたは卵室mm以上）（発達の段階1-10で胚を含みます）。 <ol><li>片側カバーガラスの橋でスライド上の（開発段階11-18で胚を含む）マウント卵室と他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。 </li><li>マウント卵室両面カバーガラスの橋でスライドに（開発のステージ19よりも古い胚を含む）および他のカバーガラス（サイズ：18×18 mm）を置き、試料の上に。 </li></ol></li><li>サンプルの乾燥を避けるために取り付けたメディアとトップカバースリップの下のスペースを埋めます。 </li><li>軽度の観察のための正しい方向を得るために、カバースリップをスライドさせて胚をロールバックします。 </li><li>マニキュアと（ブリッジカバーガラスを含む）カバーガラスのエッジの周りにシール。 </li></ol> 9.イメージング解析<ol><li> compouでホールマウント胚の写真微分干渉コントラスト（DIC）画像NDカメラに接続され、DIC光学系および乾燥系対物レンズ（10X、20X、40X）を備えた顕微鏡。製造元の指示を使用して、カメラとパソコンの画像転送用のソフトウェアをインストールします。 </li><li>レーザー走査共焦点顕微鏡14と、蛍光標識された胚の投影を取得します。 、Z-スタッキングを撮影し、3Dがイメージングソフトウェアを投影するための製造元の指示に従ってください。 <ol><li>逆さまにスライドを回して、10倍の対物レンズとマウントされたサンプルを見つけ、細かい油を塗ったベースのペンでサンプル領域を一周。 注：これは、共焦点顕微鏡の対物レンズを介してそれを検索するときにサンプルが容易に識別することができます。 </li><li>反対側9.2.1で説明したようにラベル付けされたカバースリップ領域の上に油の滴を追加します。 </li></ol></li><li> 63×油浸対物レンズに変更し、その後40X油浸対物レンズで焦点面を検索します。手動で微細なフォーカス制御を移動して行いますWNは、最良の焦点面をキャプチャします。 注：germariaと初期胚の構造の詳細を観察するために、我々は40X目的または高倍率のものを使用することをお勧め。 </li><li>異なる励起チャンネルで胚をスキャンし、zスタック画像を得ます。 注：エンドウアブラムシの組織のために、1.5μm以下にまで、各光学部の厚さを薄くします。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

私たちは、エンドウヒゲナガアブラムシAの成功免疫染色するために重要最適な条件を特定した。 エンドウ 、ゲノムおよび発達研究3,15のための新たなモデル生物。組織透過性を増加させ、バックグラウンド染色を低減するための最適化された条件は、信号の強度および特異性を増強しました。それらは、細胞膜の孔を作成して、非特異的抗体結合をブロックするためのステップの他の動物モデルにおける免疫染色のための標準プロトコルとは異なります。 免疫染色のため、およびin situハイブリダイゼーション 、プロテイナーゼK（PK）消化は、組織浸透性16-19を増加させるための一般的な手法の一つです。 （1）PK消化が大幅ものの、胚芽帯域拡張（ステージ11〜14）（ 図3B &#39;&#39;、C &#39;&#39;）中の単為生殖胎生胚における免疫染色シグナルを強化：アブラムシ組織の抗体染色では、我々の結果は、ことを示しました弱い信号は、PK処理（ 図3B、C）<...

アブラムシは、小さな（1-10 mm）のソフトボディと半翅目の昆虫です。彼らはピアス口器と師部の樹液を吸引することにより、植物を餌に。さらに、彼らは師部樹液の食事で不足している必須アミノ酸を合成するために、必須の細胞内共生細菌、 ブフネラの aphidicolaに依存しています。アブラムシは、春と夏の長日日長、彼らは越冬卵1,2の数が限られて横たわっている間、短日の光周期によってトリガ性的卵生再生時の単為生殖胎生再生を含んで複雑 ​​な生活史を持っています。春に秋まで単為生殖の多くのラウンドに続いて、すべての女性のアブラムシ（fundatrices）の第一世代を生成するために、これらの卵が孵化。毎年恒例のライフサイクルにおける無性生殖と有性段階の代替アブラムシの周期的単為生殖は、進化のノベルティ1,2と見なされてきました。単為生殖胎生アブラムシで、胚発生は、卵巣細管（ovarioles）の卵の室内で行われます。これとは対照的に、性的卵生の胚は受精卵で開発しています。別に生殖可塑性から、アブラムシは、世代間の翼polyphenismを表示することができます。過密信号と捕食者の脅威に対応して、翼のない無性女性はviviparously長距離移動のための翼の子孫を生成することができます。エンドウヒゲナガアブラムシのゲノム配列の公表Acyrthosiphonエンドウ -theの最初のゲノム配列基礎不完全変態の昆虫ができます生殖可塑性、翼polyphenism、分子のアブラムシで昆虫植物の相互作用、ウイルスベクタとの共生など、他の機能のさらなる調査基礎3。 ゲノム配列決定に加えて、遺伝子発現および機能を特徴づけるためのツールは、成熟したモデル生物として4エンドウアブラムシを促進するために必要とされます。我々は全体のマウントの堅牢なプロトコルを記載しています<em&gt;アブラムシ胚5-7でのmRNAの発現を検出するためのin situハイブリダイゼーション。二本鎖RNAの注入と給電ビアRNA干渉（RNAi）はアブラムシの幼虫及び成虫における遺伝子サイレンシングのために使用されてきたが、胚における遺伝子ノックダウンのための安定した条件がまだ8-10報告されていません。免疫染色、およびRNAiノックダウン後、エンドウアブラムシ胚11-13で行われた前のサンプル中のタンパク質の発現を検出することができる抗体に基づくアプローチ。しかし、組織透過性およびバックグラウンド染色の除去の増加は、エンドウアブラムシの無性胎生胚における免疫染色のための標準プロトコルを使用して、まだ不十分です。たとえば、私たちは、組織への抗体の浸透が（ステージ8-10）胚をgast​​rulatingに減少し、形態学的に識別可能な肢芽（ステージ13〜14）との胚は、抗体にほとんど透過性であることがわかりました。また、バッ​​クグラウンド染色は無性viviparoで可視化されました私たちエンドウアブラムシの胚は、生殖細胞系列マーカーヴァーサだけでなく、胚性セグメント12,13で表現エングレイルド/半円形の波形のタンパク質に対するそのに対する抗体を用いて染色しました。実際にはバックグラウンド染色は、まだ二次抗体のみで染色した胚ではっきりと見えました。 アブラムシ組織の完全性に損傷を与えることなく、透過性を高めるために、我々は慎重にプロテイナーゼKの濃度を滴定し、アブラムシの胚における組織消化のための最適条件を決定しました。エンドウアブラムシに非特異的な染色を避けるために、我々は、効率的に胚をブロックし、免疫染色の間、信号を増幅するために用いられる酵素の内因性のペルオキシダーゼ（POD）の活性を抑制し得る化合物について検索しました。伝統的に使用される通常のヤギ血清ではなく（NGS）、ジゴキシゲニン（DIG）ベースのバッファセットによって提供されるブロッキング試薬/ウシ血清アルブミン（BSA）は、有意にバックグラウンド染色を減少させました。また、メタノールはINHIことが見出されましたより効果的に過酸化水素（H 2 O 2）に比べ、内因性POD活性をビット。胚の免疫染色のためにこれらのアブラムシ、特定の条件に関する詳細は、以下のセクションで説明します。

<table><tbody><tr><td>30% ペルキシダーゼ水素 (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18304</td><td>胚の内因性ペルオキシダーゼの漂白用。</td></tr><tr><td>4フィート6-ジアミジノ-2-フェニル-インドール二塩酸塩 (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>二本鎖DNAの標識用。毒性。手袋を着用し、小さなアリコートに分配し、露出を最小限に抑えるためにフィーズ</td></tr>します <tr><td>4D9 抗エングレイル/インベクトマウスモノクローナル抗体</td><td>発生研究 ハイブリドーマバンク</td><td>AB_528224</td><td>胚の発達中のセグメントをラベリングするため。</td></tr><tr><td>ApVas1ウサギポリクローナル抗体</td><td>私たちの研究室</td><td>N/A</td><td>胚中のアブラムシ生殖細胞特異的Vas1タンパク質の標識用。この抗体は当研究室で作製しました。&nbsp;</td></tr><tr><td>Austerlitz 昆虫ピン</td><td>ENTOMORAVIA</td><td>N/A</td><td>卵巣から各卵室を分離するため。サイズ000、ブラックエナメル&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>抗体の非特異的結合を阻害します。</td></tr><tr><td>カメラは、アブ</td><td>ラムシの胚の撮影のために</td>、<td>複合顕微鏡キヤノン</td><td>EOS 5D</td>に接続されています。</tr><tr><td>比色8細胞トレイ</td><td>Kartell Labware</td><td>357</td><td>アブラムシ胚の染色シグナルを発達させます。直径95 x 57 mm、セル深さ2 mm。</td></tr><tr><td>DIC光学系複合顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>DMR</td><td>スライドに取り付けられたアブラムシの胚の撮影用。</td></tr><tr><td>DIGウォッシュ&ブロックバッファーセット</td><td>Sigma-Aldrich(ロシュ社)</td><td>11585762001</td><td>抗体の非特異的結合をブロックします。10x Blocking 溶液を 1x に希釈してブロッキング試薬として使用しました。</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>Ideal-tek</td><td>N/A</td><td>アブラムシの卵巣の解剖用。メーカー部品番号5:5 SA.&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラススポイト</td><td>N/</td><td>A N/A</td> アブ<td>ラムシの卵巣をスプロットプレートからチューブに移すため 全長150mm、先端長5 3/4インチ。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>アブラムシの胚の清澄化とマウント用。</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>バイオショップ</td><td>N/A</td><td>プロテイナーゼK(PK)の酵素活性を阻害します。</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG標識Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11017</td><td>マウスからの一次抗体の検出用。</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG標識Alexa Fluor 633</td><td>Invitrogen</td><td>A21072</td><td>ウサギ由来の一次抗体の検出用。</td></tr><tr><td>Intelli mixer</td><td>ELMI実験装置</td><td>RM-2M</td><td>試薬と卵巣の反応を改善します。</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>ズSP5</td><td>florecent tagでスライドに取り付けられたアブラムシの胚の撮影用。</td></tr><tr><td>メタノール&nbsp;</td><td>Burdick and Jackson</td><td>AH2304</td><td>胚の内因性ペルオキシダーゼの漂白用。</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>10143560</td><td>胚のマウント用。SUPERFROSTの地面の端、ca。76 x 26 mm。</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>マリエンフェルド</td><td>0101030</td><td>スライドに胚をマウントするため。サイズ 18 x 18 mm 厚さ No.1 (0.13 から 0.16 mm)</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー メガネ</td><td>マリエンフェルド</td><td>0101050</td><td>スライド上に胚をマウントします。サイズ 22 x 22 mm. 厚さ No. 1 (0.13 to 0.16 mm)</td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗αチューブリン抗体 (DM1A)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32293</td><td>細胞のα-チューブリンの分布を標識します。</td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>スライドのカバースリップを密封するため。</td></tr><tr><td>正常なヤギ血清(NGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>抗体の非特異的結合を阻害します。</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>VWR</td><td>MK262159</td>アブ<td>ラムシの卵巣の固定用。</td></tr><tr><td>ファロイジン-TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>胚上のF-アクチンの分布を標識するため。</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td>アブラムシ卵巣の等張液として。</td></tr><tr><td>プラスチックスポイト</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>アブラムシの卵巣をチューブから細胞トレイに移すため。サイズ 3 ml.&nbsp;</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>メルク</td><td>124678</td><td>細胞膜に孔を作製(パンチング)し、抗体へのアクセスを促進するため&nbsp;</td></tr><tr><td>Pyrexスポットプレート</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>顕微鏡下でのアブラムシ卵巣の解剖および色反応用。直径22 mmの各キャビティと&nbsp;奥行き7mm。</td></tr><tr><td>SIGMAFAST 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)錠剤&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4168</td><td>基板信号の現像用。DABペルオキシダーゼ基質錠剤セットとも呼ばれます。</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>EZ4</td><td>アブラムシの卵巣の解剖と観察用。</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>細胞膜に毛穴を開ける(パンチング)用&nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>ベクターラボ</td><td>PK-6101</td><td>シグナルの強化に。ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG二次抗体、AおよびB試薬を含みます。</td></tr><tr><td>VECTASHIELD封入用剤</td><td>ベクター研究所</td><td>H1000</td><td>アブラムシの胚の清澄化と埋込用。</td></tr></tbody></table>

エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

配列決定されたゲノムと豊富な表現型可塑性とエンドウAcyrthosiphonエンドウアブラムシは、ゲノムおよび発達の研究のための新たなモデルとなっています。他のアブラムシ、Aのよう 。 エンドウ胚は卵巣管に組立ライン方式で卵の室内で開発単為生殖胎生再現、を経て急速に伝播します。これまで我々は、アブラムシの胚におけるmRNA発現の検出を可能にするin situハイブリダイゼーションホールマウントの堅牢なプラットフォームを確立しています。タンパク質の発現を分析するために、しかし、満足な結果を生じなかった無性胎生アブラムシのovariolesを免疫染色するためのプロトコルを確立しました。ここでは、組織透過性を増加させ、確立されたアプローチを適用する際に問題があったどちらもバックグラウンド染色を、減少させるための最適化された条件をレポートします。最適化が含まれます：必須のFを発見されたプロテイナーゼK（1 / mlの、10分）、の（1）のインキュベーション中・後期アブラムシ胚または抗体の浸透; （2）ジゴキシゲニン（DIG）により供給されるブロッキング試薬と正常ヤギ血清/ウシ血清アルブミンの交換は、バッファセットと、内因性ペルオキシダーゼを漂白するためにメタノールではなく、過酸化水素（H 2 O 2）、（3）アプリケーションをベース。これはかなりアブラムシ組織におけるバックグラウンド染色を減少させました。免疫染色のために最適化されたこれらの重要な条件は、A。 エンドウ及び他のアブラムシの胚における遺伝子産物の効果的な検出を可能にします。

本研究では、無性エンドウアブラムシ（ 図1A）の胚のホールマウントの免疫染色を行いました。これらの女性は、単為生殖とviviparously子孫を生産します。これらの女性の胚は、卵巣細管（ovarioles）（ 図1Bおよび図2A）の卵の室内で開発しています。顕微鏡検査の前に、解剖ovariolesは染色標的です。しかし、卵室の分離は、顕微鏡（ - D 図2B）の下で胚を観察するために必要とされます。 組織透過性の増加プロテイナーゼK（PK）の治療は、組織浸透性を高めるため、いくつかのモデル生物-ような線虫 （線虫）として、 キイロショウジ...

アブラムシの胚に対する全量免疫染色のプロトコルが提示され、バックグラウンド染色の減少と組織透過性の増加のための重要な条件が対処されます。これらの条件は、アブラムシの胚組織におけるタンパク質発現を効果的に検出するために特別に開発されました。

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

この免疫染色のプロトコルの全体的な目的は、アブラムシの胚におけるタンパク質発現を検出することです。アブラムシの胚組織の染色において長年の課題となっている、組織透過性の向上とバックグラウンド染色の低減を実現するための重要な条件を明らかにしています。本手法の主な利点は、標準的な免疫染色プロトコルでは通常記載されない、抗体の効果的な浸透とバックグラウンド染色の抑制のための特異的な条件を提供することにあります。私たちは、ゲノミクスおよび環境研究の昆虫モデルとして用いられるエンドウヒゲナリの生殖細胞がどのように分化するかを研究していた際に、この測定法のアイデアを初めて得ました。エンドウヒゲナリ（A. pisum）の実験室系統は、もともと台湾中部で採取されたものであり、300世代以上にわたって寄主植物で飼育されてきました。発芽させるために、宿主植物の種子を室温の水道水に3〜5日間浸します。水は1日1回、新しいものに交換してください。発芽した種子10粒を土を入れた小型ポットに植え、光周期16時間明期/8時間暗期、温度20 °Cの育成チャンバー内で栽培します。成長開始から約10日後、植物の高さは通常8 cmを超えます。植物の入った各ポットを1 Lのガラスビーカーに入れ、絵筆を用いて成虫のアブラムシを植物に転写します。その後、アブラムシの脱走を防ぐため、ガーゼメッシュなどの通気性のあるカバーでビーカーを密封します。アブラムシを、明期16時間、暗期8時間の光周期、20 °Cの育成室で飼育し、植物の各ポットに1日1回水を与えます。スポットプレートの1ウェルに、4 % パラホルムアルデヒドを約500 µL満たします。プレートを低倍率の実体顕微鏡下に置き、成虫のアブラムシをパラホルムアルデヒドに浸して解剖します。一方のピンセットで頭部と腹部を保持し、腹部の背側クチクラを切開して卵巣を腹腔から引き出すことで、卵巣を摘出します。次に、3対の卵巣を1 mLのパラホルムアルデヒドを含む1.5 mLチューブに入れ、ミキサーで緩やかに振盪しながら室温で20分間固定します。ガラスドロッパーで固定緩衝液を除去し、その後、PBSTを用いて緩やかに振盪しながら10分間、3回卵巣を洗浄します。卵巣を処理するために、まずProteinase Kとともに10分間緩やかに振盪しながらインキュベートし、胚組織の透過性を高めます。インキュベーション後、Proteinase K溶液を廃棄し、次に700 µLのグリシンで卵巣を5分間ずつ3回洗浄します。続いて、PBSTで卵巣を10分間ずつ2回洗浄します。固定緩衝液を用い、室温で緩やかに振盪しながら15分間、卵巣を再度固定します。内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制するため、0.2% PBSTに含まれるメタノールの濃度を、体積比1:3、1:1、3:1の順で段階的に変化させて卵巣を脱水させ、その後、100%メタノール中で室温、緩やかな振盪条件下で1時間さらにインキュベートします。次に、テキストプロトコルの指示に従い、卵酸を段階的に再水和させます。1.5 mLチューブに入れた3対の卵巣に対し、サンプルブロッキングおよび抗体染色のための最小容量は200 µLです。卵巣を1x DIG-Bブロッキング溶液とともに、室温で4時間、または4 °Cで緩やかに振盪しながら一晩インキュベートします。インキュベート後、上清を捨て、適切な希釈倍率で一次抗体を含む新しい1x DIG-Bブロッキング溶液に置換します。室温で4時間、または4℃で緩やかに振盪しながら一晩、卵巣を染色します。テキストプロトコルに従って卵巣を洗浄した後、上澄みを捨て、適切な希釈倍率で二次抗体を含む新鮮な1x DIG-Bブロッキング溶液に置換し、前述と同様に卵巣を染色します。免疫蛍光染色の場合は、二次抗体が光に敏感であるため、暗所で染色を行ってください。アブラムシ胚の厚さは、発生段階によって異なります。そのため、初期、中期、および後期の胚に合わせて封入方法を変更します。プラスチック製ドロッパーを用いて、封入剤とともに卵巣をセルプレートに移し、実体顕微鏡の低倍率でサンプルを観察します。昆虫ピンを用いて側卵管に関連するカルスを切り離し、分離した卵巣小管をスポイトで空のガラスウェルに移動させます。封入剤を用いて、最終容量を50から100 µLに調整します。その後、ガラススポイトで卵巣小管をスライドガラス上に移動させます。昆虫ピンを用いて卵室を解剖します。発生段階がステージ6以降の胚については、卵室を分離することを推奨します。生殖巣（germaria）および最初の2つの卵室については、分離は任意です。ガラスドロッパーを使用して、解剖した卵室を清潔なスライドガラスに移動させます。発生段階1から10の胚の場合、気泡が入らないように、解剖した生殖巣または卵室の上にカバーガラスをゆっくりと被せます。一方、発生段階11から18の胚の場合は、片側にカバーガラスのブリッジを設けて卵室をスライドに固定し、サンプルの上にさらに別のカバーガラスを被せます。発生段階がステージ19以降の胚については、両面テープ付きのカバーグラスブリッジを用いて卵室をスライドガラスに固定し、サンプルの上にさらに別のカバーグラスを載せます。次に、サンプルが乾燥するのを防ぐため、上のカバーグラスの下の空間を封入剤で満たします。上のカバーグラスを軽く転がして、観察に適した向きに調整してください。最後に、テキストプロトコルに記載されている通り、画像解析を行う前に、ブリッジカバーガラスを含むカバーガラスの周囲をマニキュアで封止します。ここに、成体雌から摘出された一対の卵巣を示します。卵巣小管は、1つの生殖室（germarium）、1〜2個のO-site、および5〜7個の胚で構成されており、これらはすべて卵室内に assembly line 形式で収容されています。パラホルムアルデヒド固定後、1 µg/mL濃度のProteinase K溶液中で卵巣を10分間消化することを強く推奨します。染色の結果、Proteinase Kで消化した胚ではシグナル強度が著しく向上することが示されています。また、DIGベースのバッファーセットに含まれるブロッキング液で胚をインキュベートすると、正常ヤギ血清やウシ血清アルブミンを用いた場合よりもバックグラウンド染色の低減が認められます。ペルオキシダーゼの内在的な活性によって、背景染色が高くなる場合があります。本研究により、アブラムシの胚をメタノールに浸漬させることで、過酸化水素で処理する場合よりもはるかに効率的にペルオキシダーゼ活性を抑制できることが明らかになりました。本研究で得られた重要な条件は、生殖細胞と体細胞の両方におけるシグナル検出に適用可能です。この手法を習得すれば、適切に実施することで2日間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、信号強度の向上やバックグラウンド染色を抑える方法を含め、アブラムシの胚で免疫染色を成功させるための適切な手順を十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、胚の形状を良好に保つため、すべての胚を丁寧に扱うことが重要です。パラホルムアルデヒドおよびDAPIの取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は常に手袋などの予防措置を講じることを忘れないでください。本手順に続いて、メッセンジャーRNAが胚細胞内でそのタンパク質産物と共に局在しているかなど、さらなる疑問を解決するために、in situ ハイブリダイゼーションなどの他の手法を実施することが可能です。この手法は、アブラムシにおける生殖細胞の特定方法や、異なる生殖段階における卵細胞の決定方法など、昆虫環境生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

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エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

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