エンドウアブラムシ胚における免疫染色のための重要な条件の同定：組織透過性を増大し、バックグラウンド染色を減少

この免疫染色のプロトコルの全体的な目的は、アブラムシの胚におけるタンパク質発現を検出することです。アブラムシの胚組織の染色において長年の課題となっている、組織透過性の向上とバックグラウンド染色の低減を実現するための重要な条件を明らかにしています。本手法の主な利点は、標準的な免疫染色プロトコルでは通常記載されない、抗体の効果的な浸透とバックグラウンド染色の抑制のための特異的な条件を提供することにあります。

私たちは、ゲノミクスおよび環境研究の昆虫モデルとして用いられるエンドウヒゲナリの生殖細胞がどのように分化するかを研究していた際に、この測定法のアイデアを初めて得ました。エンドウヒゲナリ（A. pisum）の実験室系統は、もともと台湾中部で採取されたものであり、300世代以上にわたって寄主植物で飼育されてきました。

発芽させるために、宿主植物の種子を室温の水道水に3〜5日間浸します。水は1日1回、新しいものに交換してください。発芽した種子10粒を土を入れた小型ポットに植え、光周期16時間明期/8時間暗期、温度20 °Cの育成チャンバー内で栽培します。

成長開始から約10日後、植物の高さは通常8 cmを超えます。植物の入った各ポットを1 Lのガラスビーカーに入れ、絵筆を用いて成虫のアブラムシを植物に転写します。その後、アブラムシの脱走を防ぐため、ガーゼメッシュなどの通気性のあるカバーでビーカーを密封します。

アブラムシを、明期16時間、暗期8時間の光周期、20 °Cの育成室で飼育し、植物の各ポットに1日1回水を与えます。スポットプレートの1ウェルに、4 % パラホルムアルデヒドを約500 µL満たします。プレートを低倍率の実体顕微鏡下に置き、成虫のアブラムシをパラホルムアルデヒドに浸して解剖します。

一方のピンセットで頭部と腹部を保持し、腹部の背側クチクラを切開して卵巣を腹腔から引き出すことで、卵巣を摘出します。次に、3対の卵巣を1 mLのパラホルムアルデヒドを含む1.5 mLチューブに入れ、ミキサーで緩やかに振盪しながら室温で20分間固定します。ガラスドロッパーで固定緩衝液を除去し、その後、PBSTを用いて緩やかに振盪しながら10分間、3回卵巣を洗浄します。

卵巣を処理するために、まずProteinase Kとともに10分間緩やかに振盪しながらインキュベートし、胚組織の透過性を高めます。インキュベーション後、Proteinase K溶液を廃棄し、次に700 µLのグリシンで卵巣を5分間ずつ3回洗浄します。続いて、PBSTで卵巣を10分間ずつ2回洗浄します。

固定緩衝液を用い、室温で緩やかに振盪しながら15分間、卵巣を再度固定します。内因性ペルオキシダーゼ活性を抑制するため、0.2% PBSTに含まれるメタノールの濃度を、体積比1:3、1:1、3:1の順で段階的に変化させて卵巣を脱水させ、その後、100%メタノール中で室温、緩やかな振盪条件下で1時間さらにインキュベートします。次に、テキストプロトコルの指示に従い、卵酸を段階的に再水和させます。

1.5 mLチューブに入れた3対の卵巣に対し、サンプルブロッキングおよび抗体染色のための最小容量は200 µLです。卵巣を1x DIG-Bブロッキング溶液とともに、室温で4時間、または4 °Cで緩やかに振盪しながら一晩インキュベートします。インキュベート後、上清を捨て、適切な希釈倍率で一次抗体を含む新しい1x DIG-Bブロッキング溶液に置換します。

室温で4時間、または4℃で緩やかに振盪しながら一晩、卵巣を染色します。テキストプロトコルに従って卵巣を洗浄した後、上澄みを捨て、適切な希釈倍率で二次抗体を含む新鮮な1x DIG-Bブロッキング溶液に置換し、前述と同様に卵巣を染色します。免疫蛍光染色の場合は、二次抗体が光に敏感であるため、暗所で染色を行ってください。

アブラムシ胚の厚さは、発生段階によって異なります。そのため、初期、中期、および後期の胚に合わせて封入方法を変更します。プラスチック製ドロッパーを用いて、封入剤とともに卵巣をセルプレートに移し、実体顕微鏡の低倍率でサンプルを観察します。

昆虫ピンを用いて側卵管に関連するカルスを切り離し、分離した卵巣小管をスポイトで空のガラスウェルに移動させます。封入剤を用いて、最終容量を50から100 µLに調整します。その後、ガラススポイトで卵巣小管をスライドガラス上に移動させます。

昆虫ピンを用いて卵室を解剖します。発生段階がステージ6以降の胚については、卵室を分離することを推奨します。生殖巣（germaria）および最初の2つの卵室については、分離は任意です。

ガラスドロッパーを使用して、解剖した卵室を清潔なスライドガラスに移動させます。発生段階1から10の胚の場合、気泡が入らないように、解剖した生殖巣または卵室の上にカバーガラスをゆっくりと被せます。一方、発生段階11から18の胚の場合は、片側にカバーガラスのブリッジを設けて卵室をスライドに固定し、サンプルの上にさらに別のカバーガラスを被せます。

発生段階がステージ19以降の胚については、両面テープ付きのカバーグラスブリッジを用いて卵室をスライドガラスに固定し、サンプルの上にさらに別のカバーグラスを載せます。次に、サンプルが乾燥するのを防ぐため、上のカバーグラスの下の空間を封入剤で満たします。上のカバーグラスを軽く転がして、観察に適した向きに調整してください。

最後に、テキストプロトコルに記載されている通り、画像解析を行う前に、ブリッジカバーガラスを含むカバーガラスの周囲をマニキュアで封止します。ここに、成体雌から摘出された一対の卵巣を示します。卵巣小管は、1つの生殖室（germarium）、1〜2個のO-site、および5〜7個の胚で構成されており、これらはすべて卵室内に assembly line 形式で収容されています。

パラホルムアルデヒド固定後、1 µg/mL濃度のProteinase K溶液中で卵巣を10分間消化することを強く推奨します。染色の結果、Proteinase Kで消化した胚ではシグナル強度が著しく向上することが示されています。また、DIGベースのバッファーセットに含まれるブロッキング液で胚をインキュベートすると、正常ヤギ血清やウシ血清アルブミンを用いた場合よりもバックグラウンド染色の低減が認められます。

ペルオキシダーゼの内在的な活性によって、背景染色が高くなる場合があります。本研究により、アブラムシの胚をメタノールに浸漬させることで、過酸化水素で処理する場合よりもはるかに効率的にペルオキシダーゼ活性を抑制できることが明らかになりました。本研究で得られた重要な条件は、生殖細胞と体細胞の両方におけるシグナル検出に適用可能です。

この手法を習得すれば、適切に実施することで2日間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、信号強度の向上やバックグラウンド染色を抑える方法を含め、アブラムシの胚で免疫染色を成功させるための適切な手順を十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、胚の形状を良好に保つため、すべての胚を丁寧に扱うことが重要です。

パラホルムアルデヒドおよびDAPIの取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は常に手袋などの予防措置を講じることを忘れないでください。本手順に続いて、メッセンジャーRNAが胚細胞内でそのタンパク質産物と共に局在しているかなど、さらなる疑問を解決するために、in situ ハイブリダイゼーションなどの他の手法を実施することが可能です。この手法は、アブラムシにおける生殖細胞の特定方法や、異なる生殖段階における卵細胞の決定方法など、昆虫環境生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。