Name: がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶヒト骨肉腫からのがん幹細胞分離法。スフィア形成アッセイを用いてサルコスフィアを培養し、免疫蛍光とRTPCRで幹細胞マーカーを確認します。この手法は固形腫瘍治療法の研究に活用できます。

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この研究は、ITT(Istituto Toscano Tumori)助成金提案2010の支援を受けました。

<ol><li>Reddick, R. L., Michelitch, H. J., Levine, A. M., Triche, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+sarcoma%3A+a+study+of+the+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Osteogenic sarcoma: a study of the ultrastructure.</a> Cancer. 45 (1), 64-71 (1980).</li>
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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言する。

CSCが腫瘍バルク中のこの特定の細胞サブセットの同定を可能にするいくつかのプロパティを持っています。そのようなATP結合カセットの多剤排出トランスポーターの過剰発現28細胞毒性化学療法剤に対する獲得耐性のようなこれらの特性に基づいて、32、33、またはそのような発現のためのALDH 32として解毒酵素の発現のアップレギュレーションのためにCSCを単離するためのこのようなCD133、CD44、CD34、CD90、および他の30、34、35、41、いくつかの異なる方法として、特定の表面マーカーの42-44が開発されてきました。これらの技術の一つは、非付着条件下で増殖するためのCSCの能力に基づいて球体形成アッセイです。 球体を形成するための組織幹細胞とのCSCの能力は、最初のレイノルズらによる神経幹細胞の同定の研究に記載された。37。その後、ギブスら38たちこれらの研究edは骨肉腫から、特に、固形腫瘍からのCSCを単離することを開始します。私たちは、ギブスらによって示されている球形成アッセイ法を使用することを決定した。従来のOSの生検から得られたOSA細胞株からのCSCを隔離します。我々は、このアッセイの結果を向上させ、他の癌細胞株のための再現性を容易にするための独自の方法を適合しました。球形成アッセイの確立を参照すると、我々は、40,000細胞/ウェルをプレーティングすることが確認され、アッセイの開始時に分離して細胞を維持するための良い方法です。このトリックは、球状コロニーが細胞凝集からではなく、非付着条件下で増殖し、球状のコロニーを形成するための単一のCSCの特定と排他的な能力に由来する可能性を回避するために非常に重要です。この能力は、このアッセイの特に重要な点です。 また、球形成の良好な速度を得るためにそれを認定します、元の方法に記載のように増殖因子のアリコートごとに3次元ではなく、毎日更新するのに十分です。本研究では、我々はまた、確立され、広範囲に非接着条件下で培養したときに形成される球状のコロニーを単離するための良い方法を説明しました。それらを損傷することなく、各ウェル内に形成されている可能な限り球のような多くを隔離しようとすることは非常に重要であるため、この手順は、このアッセイにおいて重要です。唯一の球ではなく、アッセイの期間中、懸濁液中に残っている可能性があり、単一の細胞を単離することも重要です。これらの重要な点を克服するために、我々は、CSCの単離のための良好な結果が得られ、上記のように、特定の分離法を開発しました。明らかに、そこに形成された全ての球を回収することができない可能性があるが、損失率は非常に低いです。実際に、我々はまた、（フォーム大きくなった後に球を単離するために40μmの孔を有するフィルターを使用する可能性を有していますEDは約100から200細胞）。 この分離は、球形成を停止しますが、単一細胞、メチルセルロース残基の一部、および最小の球をフィルタリングすることができます。プロトコールに記載されるように、この除去は、完全な濾過により行われます。 また、最小の球状コロニーの必然的な損失と40μmのメッシュを介して最大の球状コロニーの選択は1つが球状コロニーを形成する最大容量で、より大きな幹細胞性とのCSCを選択することができます。これらの修飾の全ては、アッセイを改善し、理解し、球体形成アッセイの元の方法の最も重要なステップを再現するためのCSCを研究する研究者を支援するために行きました。 CSCを単離するためのin vitro法に関する研究の中で、これは球形成アッセイを適応方法を示すことを目的としたこの研究からのCSCを単離するための良い方法かもしれませんOSAの細胞株。オリジナルの方法と詳細な分離技術への適応は、その有効性を改善します。短時間でのCSCのかなりの数を得ることができ、いくつかの実験のために使用されます。したがって、迅速にOS-のCSCを特徴付ける二幹様の表現型を研究するために、特に、幹様の表現型を確認し、することが可能です。したがって、この修正されたアッセイは、CSCをを単離し、それらの生物学を研究するための優れた手法である可能性があります。将来的には、この方法は、追加の適応でも希少な固形腫瘍の生検により得られた他の有限の癌細胞株からのCSCを単離するために使用されてもよいです。 OSなど希少な固形腫瘍からのCSCを単離する可能性は、この特定の癌に関する研究の改善を可能にするだけでなく、それらの単離のためのより良い方法を開発する異なるタイプの癌の研究にとの生物学の今後の研究にも及ぶだけでなく、この重要な細胞サブセット。したがって、我々として本研究で行っている、おそらくのために責任があるこの特定の細胞サブセットに対して向けの非常に特定の抗癌治療を、分子標的を発見し、開発の最終目標で、CSC生物学の研究を通じてCSC分離の方法を向上させることが重要です原発腫瘍の維持、再発の開発、およびいくつかの器官における転移の起源。 CSC生物学の研究でも、このようなネオアジュバント治療後の生存率は非常に貧しいままであるためにOS、などの癌の治療法に鋭いかもしれない治療法を見出すために重要です。

肉腫は胚の中胚葉1から主に由来するまれな悪性の結合組織腫瘍の異種群です。異なるタイプの骨肉腫および軟部組織肉腫を含みます。骨肉腫は、比較的まれ原発腫瘍のグループは、骨肉腫（OS）を含むいくつかのサブタイプ、で構成されています。 OS、骨の最も一般的な原発腫瘍の一つは、大規模な臨床、組織学的、および分子不均質2、3を示す間葉系悪性腫瘍である。残念ながら、OSは5、子供におよび若年成人4で主に発生し、60％を占めます小児期における骨肉腫の一般的な組織学的サブタイプは6、7。OSは通常影響を与える急速な骨の成長によって特徴付けられる骨格領域、（ 例えば 、長骨の骨幹）。 OS、従来のOSの組織学的に異なるサブタイプの中でも、また髄または中央OSと呼ばれる、悪性度の高いグレードとクォータ社を持っています80％8の再。この80％、60％、従来の骨芽細胞のOS、10％軟骨芽OS、および10％の線維芽OS 6、8-10から構成されています。他のOSのサブタイプは、未分化、毛細血管拡張、巨細胞が豊富で小細胞OSが含まれています。 OS管理で組み合わせ、手術と化学療法の進歩にもかかわらず、結果は転移11、12のない患者では65から70パーセントの長期生存率は、貧しいまま。遠い再発が頻繁に転移として、それほど頻繁に、肺転移として発生したり、遠くの骨や地元の再発13へ。転移は、多くの場合、従来の治療に抵抗性です。この抵抗は、10年の無病生存率は診断14、15に転移性疾患を有する患者では約30％である理由です。 正常組織と同様に、癌組織は、細胞型の異種コレクションから構成されています。腫瘍内の細胞は、発生の異なる段階に対応するように見えます。任意のn個以内ormal組織は、このように組織の恒常性のための前駆細胞および成熟細胞を提供し、selfrenewする能力を有する細胞の亜集団を常駐します。同様に、癌が増殖および腫瘍形成能の程度が異なると、発生の異なる段階における細胞の同様の不均一な集団で構成されています。これらの癌細胞のサブセットは、がん幹細胞（CSCを）と呼ばれる、このようにして腫瘍塊16を構成する種々の細胞系統を生成する、腫瘍の悪性度をselfrenewし維持する排他的な能力を有する細胞をselfsustainingのリザーバを構成しています。 1990年代には、急性骨髄性白血病の研究は、CSCの亜集団17、18の存在のための最初の説得力のある証拠を提供した。CSCがあるため、それによって癌研究の中で最も研究テーマの一つになって、固形腫瘍19の多数から単離されています。 CSCが実際に正常を作る遺伝子の変異により正常な幹細胞から生じる可能性があります20-23癌幹細胞。微小環境を持つ複数の転換の突然変異と相互作用ものCSCを代表するselfrenewal容量と不死を取得し、健康な前駆細胞および成熟細胞に寄与し得ます。この変換に関するいくつかの仮説があります。健康な前駆細胞、健康な成熟細胞、癌細胞は、selfrenewal関連遺伝子24-28を活性化することにより幹様表現型を得る、幹細胞に脱分化することができます。いくつかの最近の研究にもかかわらず、CSCをの起源はまだ発見されなければなりません。 CSCの特定の特性は、その容量は異なる薬剤との併用手術と化学療法で構成されたマルチ治療アプローチを、抵抗することです。最近の研究でのCSCはまた、細胞毒性化学療法剤に対する耐性を獲得することができることを示しています。この抵抗のための可能な説明は、ATP結合カセット（ABC）多剤輸送体（ すなわち、の過剰発現を含みますMDR1およびBCRP1）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ1（ALDH1）、および/または細胞周期動態30-33の変化として化学療法代謝酵素の過剰発現。これまでに記載されているすべてのこれらの概念の直接的な結果は、CSCの亜集団が完全に排除された場合にのみ、1つでもCSCが生き残った場合は局所再発や遠隔転移が発生する可能性がありながら、癌治療は、効率的であるということです。 それは多くの治療が最初に有効であると思われる理由として可能性のある説明が、患者後に再発していますので、人間の肉腫34、特にOS 35で、または任意の他の骨と軟部組織のがんでのCSCの発見は、大きな臨床的重要性を持っています。そのため、従来のOSに対する今後の戦いのための希望は、このサブの分子特性にOS-のCSCのおかげに向けた革新的な医薬品の開発に基づいて、新しいと特定の標的療法を見つけることです人口とCSC生物学の研究に。 1992年には、幹細胞のサブセットは、成人哺乳類の脳に存在したかどうかを調査したレイノルズらは、幹細胞様細胞36、37であることが疑われる細胞を分離する方法を開発した。この方法は、特定の能力に基づいています非付着条件下で増殖するとき、これらの細胞は球状のコロニーを形成します。同様の技術は、骨肉腫38中の幹細胞様細胞の亜集団を研究するために2005年にギブスらによって採用されました。従来のOSの異なるタイプの初代細胞培養物から、OSのCSCを単離し、特徴づけるために、我々は、OS細胞株は、この技術を適応することを決定しました。 ここでは、球体形成アッセイのこの適合方法を説​​明し、従来のOSのヒト生検に由来する有限の初代細胞株からOS-のCSCを単離することができる「sarcosphereアッセイ」と呼ばれます。我々はまた、すべての技術のuを記述しますこのアッセイにより単離された細胞株の幹様CSC表現型を検証するためのsed：多能性胚性幹細胞（ESC）を特徴づける遺伝子とのCSCのマーカーであるCD133遺伝子の発現の1）の評価を、 2）コロニー形成単位（CFU）アッセイ。 3）適切な分化条件下での骨芽細胞と脂肪細胞に分化するために、これらの細胞の能力を評価します。間葉系幹細胞（MSC）の表面マーカーの4）研究（ すなわち、CD44、CD105及びSTRO-1）の免疫蛍光染色により、フローサイトメトリー分析によって、 5）これらの細胞のALDH活性を評価します。

<table><tbody><tr><td>Ca2+ および Mg2+</sup/sup > (DPBS)</td> <td>LONZA</td><td>BE17-513F</td><td>_</td></tr><tr><td>Dulbecco のリン酸塩緩衝生理食塩水 &nbsp; Ca2+ および Mg2+ (DPBS)</td> <td>LONZA</td><td>BE17-512F</td><td>_</td></tr><tr><td>Porcine Trypsin 1:250</td><td>BD Difco</td><td>215310</td><td>溶剤: DPBS。原液濃度:粉末</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物(EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td>溶剤:DPBS。ストック濃度:</td></tr><tr><td>Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td>由来の粉末コラゲナーゼ<td>溶媒:緩衝液、pH 7.4。原液濃度:粉末</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>BDHケミカルズ-VWR</td><td>10323</td><td>_</td></tr><tr><td>栄養混合物F-12ハム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6636</td><td>溶剤:超高純度dH2O.ストック濃度:粉末</td></tr><tr><td>2-リン酸化-L-アスコルビン酸三ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49752</td><td>溶剤:DPBS。ストック濃度:5 mg / mL</td></tr><tr><td>&β;-グリセロールリン酸二ナトリウム塩五水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50020</td><td>溶媒:DPBS。ストック濃度:1 M</td></tr><tr><td>インスリン。ヒト組換え</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077</td><td>溶媒:NaOH 0.1 M. ストック濃度:10 mM</td></tr><tr><td>3-イソブチル-1-メチルキサンチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>溶媒:DMSO。原液濃度:500 mM</td></tr><tr><td>インドメタシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>溶媒:DMSO.ストック濃度:200 mM</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td>溶媒:DMSO。ストック濃度:&nbsp;1 mM / 100 &micro;M. 生物学的活性を維持するために液体窒素で保存する</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清南アメリカ&nbsp;</td><td>ユーロクロン</td><td>ECS0180L</td><td>_</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (PEN-STREP) 10,000 U/mL</td><td>LONZA</td><td>DE17-602E</td><td>_</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274429</td><td>溶媒: 超高純度 dH2O. 原液濃度: 2%</td></tr><tr><td>プトレセイン二塩酸塩</td><td>Σ-Aldrich</td><td>P5780</td><td>溶媒: 超高純度 dH2O</td></tr><tr><td>アポ・トランスファーリン&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1147</td><td>溶剤:DPBS。ストック濃度:25 mg/mL</td></tr><tr><td>ヒト上皮成長因子(EFGF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5036</td><td>溶媒:DPBS pH 7.4。ストック濃度:10&マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子 - 塩基性ヒト</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td>溶媒: DPBS + 0.2% BSA.ストック濃度:25 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>セレン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>211176</td><td>溶媒: DPBS.原液濃度:30 mM</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8783</td><td>溶媒:ETOH.原液濃度:10 mM</td></tr><tr><td>トルイジンブルーO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>198161</td><td>溶媒:超高純度 dH2O. 原液濃度:粉末</td></tr><tr><td>油 レッドO</td><td>ICN バイオケミカル</td><td>155984</td><td>溶媒:2-プロパノール。原液濃度:粉末</td></tr><tr><td>ナフトール AS-MX リン酸二ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5000</td><td>溶剤:DMSO。原液濃度:パウダー</td></tr><tr><td>ファストブルーBBソルト</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>F3378</td>溶剤<td>:トリスHCL、pH9.0。ストック濃度:パウダー</td></tr><tr><td>ファストレッドバイオレットLBソル</td>ト<td>シグマアルドリッチ</td><td>F3381</td><td>溶剤:トリスHCL、pH9.1。原液濃度:粉末</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、フラクションV(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td>溶<td>媒:DPBS。ストック濃度:2%</td></tr><tr><td>アリザリンレッドS</td><td>ICNバイオケミカル</td><td>100375</td><td>溶媒:超高純度dH2O.ストック濃度:粉末</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>533998</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton-100X</td><td>MERCK</td><td>11869</td><td>溶媒:DPBS。在庫濃度:0.2%。危険 - ケミカルフードの下でのみ使用</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>MERCK</td><td>2315</td><td>溶剤:DPBS .ストック濃度:200 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>MERCK</td><td>109634</td><td>危険性 - ケミカルフード</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(マウスモノクローナル[SN6]からCD105(FITC)</td><td>アブカム</td><td>ab11415</td><td>液体。アプリケーション:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;フローサイトメトリー(Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(マウスモノクローナル&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[F10-44-2] から CD44 (PE/Cy7&reg;)</td><td>アブカム</td><td>ab46793</td><td>液体。アプリケーション:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;フローサイトメトリー(Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD45&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(マウスモノクローナル&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;[MEM-28] から CD45 (PerCP)へ)&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>ab65952</td><td>液体。アプリケーション:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;フローサイトメトリー(Flow Cyt)</td></tr><tr><td>Ab-CD105&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(ヒトCD105精製抗体)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>MHCD10500</td><td>溶媒:DPBS。ストック濃度:凍結乾燥されています。アプリケーション:免疫蛍光染色(IF)</td></tr><tr><td>Ab-CD44&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(抗CD44抗体)&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>EPR1013Y(ab51037)</td><td>溶剤:DPBS。ストック濃度:凍結乾燥されています。アプリケーション:免疫蛍光染色(IF)</td></tr><tr><td>Ab-Stro-1&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(マウス抗STRO-1)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>398401</td><td>溶媒:DPBS。ストック濃度:凍結乾燥されています。アプリケーション:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;フローサイトメトリー(Flow Cyt)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;免疫蛍光染色(IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(抗ウサギIgG(Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG(H + L))</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>溶媒:DPBS.ストック濃度:凍結乾燥されています。アプリケーション:免疫蛍光染色(IF)</td></tr><tr><td>FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L))</td><td>Invitrogen</td><td>61-6511</td><td>溶媒:DPBS。ストック濃度:凍結乾燥されています。アプリケーション:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;フローサイトメトリー(Flow Cyt)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;免疫蛍光染色(IF)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 635 Phalloidin&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A34054</td><td>溶媒:DPBS。ストック濃度:凍結乾燥されています。アプリケーション:免疫蛍光染色(IF)</td></tr><tr><td>AutoMACS&trade;ランニングバッファーMACS分離</td><td>バッファーMiltenyi</td><td>130,091,221</td><td>液体。4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>QIAzol&reg;溶解試薬</td><td>QIAGEN</td><td>79306</td><td>Danger - Chemical Hood</td></tr><tr><td>QUANTITECT&reg;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;逆転写キット</td><td>QIAGEN</td><td>205314</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>C2432</td><td>液体。危険 - 化学フードの下でのみ使用</td></tr><tr><td>層流フード</td><td>GELAIRE</td><td>BSB6A</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>ケミカルフード</td><td>ARREDI TECNICI&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ヴィラ</td><td>・モデロ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ダイナミックA</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>EPPENDORF</td><td>5415R</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡 LSM 5109 Meta&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>iCycler PCR サーマルサイクラー&nbsp;</td><td>バイオラド</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>サイフロー&reg;宇宙&nbsp;</td><td>(パルテック)</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 Axiovert 200M&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>冷凍コンテナ Nalgene</td><td></td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>オリジナルPipet-Aid</td><td>pbiBrand</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>SIGMA_</td><td>&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>VICTOR3&trade;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>パーキン・エルマー</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>コニカルチューブ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(15mLおよび50mL)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>352096(15mL用)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;352070(50mL用)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>24ウェル透明平底TC処理マルチウェル細胞培養プレート</td><td>BDファルコン</td><td>353047</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>6ウェルクリアフラットボトム超低アタッチメントマルチウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3471</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>セロロジカルピペット&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(5mLおよび10mL)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>357543(5mL用)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;357551(10mL分)</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>シリンジ(5mL)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>B|ブラウン</td><td>4617053V</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>シャーレ 100X20 mm&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>353003</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>R&ouml;hrenチューブ&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;(3.5 mL、55x12mm、PS)&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>ザルシュテット</td><td>55,484</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>ペトリ皿 60X15 mm&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>353004</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>クライオバイアル1.5mL&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>ナルゲン</td><td>5000-1020</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>細胞培養フラスコ 25 cm&sup2;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>353014</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>ナイロンネットフィルター、親水性</td><td>MERCK</td><td>NY4104700</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>Swinnexフィルター</td><td>ホルダーMERCK</td><td>SX0002500</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>ペリーピンセット&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>ランセット</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td><td>_&nbsp;</td></tr><tr><td>オンス</td><td>_</td><td>__</td><td></td></tr></tbody></table>

がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物

Establishment of Cancer Stem Cell Cultures from Human Conventional Osteosarcoma

骨肉腫（OS）に対する治療における現在の改善は、癌患者の生命を延長しているが、転移が発生した場合に5年の生存率は悪いまま。癌幹細胞（CSC）理論は、腫瘍を維持し、多剤化学療法に抵抗する能力を含む幹様特性を有する腫瘍内の腫瘍細胞のサブセットが存在することを保持します。したがって、OS生物学および病因論のより良い理解は、この特定のサブセットを根絶し、患者の間で罹患率および死亡率を減少させるために標的治療の開発を進めるために必要とされます。 、のCSCの単離のCSCの細胞培養を確立し、それらの生物学を研究すると、OSの生物学および病因の我々の理解を改善するための重要なステップです。 OSの生検からのヒト由来のOS-のCSCの確立がnonadhere下3次元幹細胞培養物を作成する能力を含むいくつかの方法を用いて可能になりましたNT条件。これらの条件下では、CSCを娘幹細胞によって形成された球状の浮遊コロニーを生成することができます。これらのコロニーは、「細胞球」と呼ばれます。ここでは、OSの生検から得られた従来のOSの初代細胞培養物からのCSCの培養物を確立するための方法を記載しています。我々は明らかにのCSCを分離し、特徴付けるために必要ないくつかの通路を説明します。

骨肉腫における癌幹細胞（CSCを）の存在は、最近、その病因に関連しています。本稿では、非接着性条件下で増殖するのCSCの能力を用いて、従来の骨肉腫（OS）の人間の生検から得られた初代細胞培養物からのCSCの単離を提示します。

The current improvements in therapy against osteosarcoma (OS) have prolonged the lives of cancer patients, but the survival rate of five years remains ...

本論文の全体的な目的は、ヒト骨肉腫由来の限定細胞株からがん幹細胞を単離することです。本研究の主な利点は、腫瘍学分野の研究者に対し、がん幹細胞をin vitroで単離する方法を明確に提示することにあります。これらの細胞は、骨肉腫およびその他の固形腫瘍に対する治療法の研究に活用することが可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、肉腫コロニーの単離方法を習得するまで苦労することがあります。単離ステップは実際に行い、また理解することが困難であるため、視覚的なデモンストレーションが極めて重要となります。私たちは、スフィア形成アッセイについて読んだ際に、この手法を初めて考案しました。Gypsum氏らの共同研究者によって記述されています。手順のデモンストレーションは、博士課程学生のGaia Palmini博士と、私の研究室の技術者であるRoberto Zonefrati博士が行います。まず、必要なすべての培地を準備します。消化バッファーおよび本手順に必要なその他の溶液を用意します。次に、確定診断済みの針生検または外科的生検から骨肉腫を分離し、得られた細胞を付属のテキスト記事に記載の方法で継代培養することで、骨肉腫有限細胞株を樹立します。骨肉腫細胞の培養が確立され、プレートがほぼコンフルエントになったら、培地を吸引して除去し、トリプシン処理を行って細胞をプレートから剥離させます。細胞を新しいチューブに移し、細胞懸濁液を穏やかにピペッティングして、細胞の凝集を分散させます。次に、細胞懸濁液を10 µL採取し、血球計数器のチャンバーに転送します。血球計数器を位相差顕微鏡下に置き、懸濁液中の細胞濃度を算出します。その後、メチルセルロースを含むsarcosphere成長培地 35 mLに280,000個の細胞を加え、ピペットを用いて溶液を穏やかに混合し、凝集塊を分散させます。細胞混合液 5 mL を、超低接着 6ウェルプレートの各ウェルに分注します。播種後、倒立顕微鏡を用いて、細胞の状態および適切に単離されているかを確認します。細胞を 37 °C、5% CO₂ インキュベーター内で培養します。3日ごとに、各ウェルにbeta FGFおよびEGFの新鮮なアルコール溶液を添加し、成長因子の濃度を更新します。7日、14日、20日、21日、および28日目に顕微鏡で細胞を観察し、サルコスフィアアッセイの進行状況を確認してください。ウェルの中央に大きな黒いサルコスフィアが集まっているのが観察されたら、培養を停止し、分散プロセスを開始します。サルコスフィアを単離する際は、滅菌済みの1,000 µLピペットを用いて、サルコスフィアを含む培地を滅菌メンブレンフィルターホルダー付きのシリンジに回収します。サルコスフィアを含む培地を完全に除去した後、ウェルに5 mLの増殖培地を加え、確実に洗浄して残っているスフィアをすべて回収します。次に、顕微鏡を使用して、すべてのsarcosphereが回収されたかを確認します。回収しきれていない場合は、球体の回収が完了するまで、再度ウェルを洗浄してください。続いて、球体を損傷させないよう、メンブレンフィルターホルダーを用いて懸濁液を重力ろ過し、sarcosphereがフィルターを通過していないことを確認します。この工程において、滅菌済みのガラスパストゥールピペットを用いて、気泡をそっと取り除きます。すべてのsarcosphereのろ過が完了したら、シリンジに10 mLの増殖培地を直接加え、圧力をかけずにろ過させることでろ過ユニットを洗浄し、単一細胞を確実に除去してください。sarcosphereの懸濁液をろ過した後、液体のフィルターを廃棄し、フィルターネットに絡まったsarcosphereの回収に細心の注意を払う必要があります。ここでフィルターユニットを分解し、シリンジから取り外します。そして、それを100 mmのシャーレに入れます。滅菌済みのピンセットを用いて、メンブレンフィルターホルダーからネットフィルターを取り出します。フィルターを新しい60 mmのペトリ皿に移します。次に、ネットフィルターを静かに振って洗浄します。その際、成長培地を5 mL加え、メンブレンの絡まりからサルコスフィアを遊離させます。次に、メンブレンをウェルに入れ、顕微鏡観察によってメンブレンに絡まっているスフィアがもうないことを確認します。再度メンブレンを洗浄し、もし依然としてスフィアが絡まっている場合は、再び顕微鏡でメンブレンを確認します。メンブレンにスフィアが残っていないことを確認後、成長培地でインキュベートし、サルコスフィアを単層に成長させます。sarcospheresから得られた骨肉腫がん幹細胞の増殖を、直径60 mmのペトリ皿内で、細胞が約90%コンフルエンスに達するまでモニタリングします。本記事に記載されている多くの定常的なプロトコルに加えて、分化能の評価、ALDH活性、フローサイトメトリー、免疫蛍光染色、およびRT-PCR解析の手法が、付属のテキストプロトコルに詳細に記載されています。骨肉腫サンプルは、針生検または手術による切除によって採取します。適切に処理した場合、100 mmのペトリ皿において初代培養細胞がコンフルエントに達するまで約1か月かかります。細胞を増殖させた後、サルコスフィアアッセイを開始するために、細胞を6ウェル超低接着プレートに播種します。このプレートは細胞を懸濁状態で維持し、基質への付着を防ぎます。7日後には、単一細胞に囲まれたいくつかの小さな球状コロニーが観察されます。そして28日後には、いくつかの大きなサルコスフェアが観察されます。球状のコロニーが単離された後、単一のサルコスフィアを通常のアドヒアランスプレートに播種することで、がん幹細胞様細胞を拡大培養することが可能です。免疫蛍光染色の結果、拡大培養された細胞はCD44およびCD105に陽性、Stro-1に中等度の陽性を示し、間葉系幹細胞様表現型であることが示されました。また、RT-PCRにおいても、3つの胚性幹細胞マーカー遺伝子の発現が確認され、胚性幹細胞表現型であることが陽性に示されました。Nanog、Oct 3/4、およびSox2です。そして、骨肉腫がん幹細胞のマーカーであるCD133遺伝子です。本ビデオで示した詳細な単離技術は、スフェア形成アッセイの最も重要なステップをどのように理解し再現するかを提示することで、他の研究者ががん幹細胞を研究するための道を開くことになります。これらの改良されたアッセイは、がん幹細胞を単離し、その生物学的特性を研究するための優れた手法です。この手法は、さらなる適応を加えることで、固形癌の生検から得られた他の限定的ながん細胞株からがん幹細胞を単離するためにも利用可能です。結論として、数種類の腫瘍からがん幹細胞を単離することで、その生物学的特性の研究が可能となります。最終的な目標は、分子標的を特定し、特定の細胞サブセットを標的とした非常に特異的な抗がん療法を開発することです。

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ヒト骨肉腫組織を用いた患者由来異種移植マウスモデルの樹立

学ぶヒト骨肉腫からのがん幹細胞分離法。スフィア形成アッセイを用いてサルコスフィアを培養し、免疫蛍光とRTPCRで幹細胞マーカーを確認します。この手法は固形腫瘍治療法の研究に活用できます。

がんの確立は、ヒト従来の骨肉腫からの幹細胞培養物

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