ブタ皮下脂肪組織から分離し、脂肪由来幹細胞の分化

本手順の総合的な目的は、ブタの皮下白色脂肪組織から脂肪由来幹細胞を単離し、間葉系脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞へ分化する能力を評価することです。この手法は、肥満研究における重要な問いへの回答に寄与します。また、脂肪組織の発達に関与する分子メカニズムを解明するための有用なツールとなります。

この手法の主な利点は、大量のストローマ血管分画細胞を回収できるため、脂肪細胞の分化と生物学に関する詳細な解析が可能になることです。ブタ脂肪由来幹細胞は複数の細胞系譜への分化転換能（マルチポテンシー）を示すため、本手法は幹細胞治療の研究に寄与します。まず、子ブタを清潔な手術台の上に腹臥位で寝かせてください。

首から尾までの正中線に沿ってすべての被毛を剃り、7.5%ポビドンヨードで背側の皮膚を3回洗浄します。3回目の洗浄後、ヨードを皮膚表面に約10分間放置します。その後、皮膚に70%エタノールをスプレーします。

次に、エタノールを浸したガーゼパッドを使用して、消毒剤の色が見えなくなるまで皮膚を一方向に向かって拭き取ります。続いて、頸部から脚部にかけて切開を加えます。その後、ピンセットで脂肪と皮膚を持ち上げ、メスを用いて皮下脂肪組織である豚背部脂肪層および隣接する皮膚層を筋肉から分離します。

皮膚および脂肪組織を、無血清の37°C DMEMが入った滅菌済みの200 mLビーカーに直ちに浸し、ビーカーの外側を70%エタノールでスプレーします。次に、ビーカーを層流式細胞培養フード内に置き、ビーカーの横に40 × 30 cmの滅菌済み3層アルミホイルカバーを配置します。組織を皮膚側を下にしてホイル上に移します。

ピンセットとハサミを使用して、脂肪組織から残りの筋肉組織を取り除きます。脂肪を7 by 7-centimeterの正方形に切り分け、37-degrees Celsiusの無血清DMEMが入った新しい滅菌済みの200-milliliterビーカーに脂肪片を移します。次に、炭素鋼製スライサーブレードを備えたカスタムスライスホルダーをカバーフォイルの上に置き、脂肪層を下に向けて脂肪片を1つスライサーの上に載せます。

脂肪組織を、皮膚を切断しないように注意しながら、皮膚の直上から厚さ約1 mmの薄切にします。次に、ハサミを用いて脂肪組織の断片をできるだけ細かく刻み、コラゲナーゼを添加しろ過済みの消化培地が入った250 mLのエルレンマイヤーフラスコに加えます。このフラスコを、オービタルシェーカーを用いて37 °C、45 RPMで90分間、緩やかに回転させながらインキュベートします。

消化液が組織の大きな塊のないスラリー状になったら、10% FBSを含むDMEM F-12培地を同量加えて消化を停止させます。ブタ脂肪由来幹細胞を回収するため、消化した脂肪組織懸濁液を1層のシフォン布でろ過し、滅菌済みの250 mLセロロジカルボトルに回収します。その際、ピンセットでシフォン布の中央を押し下げ、消化物の通過を誘導し促進させます。ピンセットでシフォン布を絞り、中身を完全に通過させた後、培地を4本の50 mLコニカル遠心チューブに分注します。

遠心分離によりストローマ血管分画（SVF）細胞を回収します。次に、成熟脂肪細胞を含む上層の脂肪層の大部分を除去するため、ペレットを乱さないように上清をデカントします。その後、ピペッティングと穏やかな振盪により、ペレットを10 millilitersのDMEMに再懸濁します。

再度細胞を遠心分離し、ペレットを10 millilitersのACK溶血バッファーで再懸濁します。室温で7分間置いた後、各チューブに10 millilitersのDMEMを加えて赤血球の溶血を停止させ、チューブを軽く振って混ぜ合わせます。その後、再度細胞を遠心分離します。

細胞を10 mLのDMEMでさらに2回洗浄し、その後、上清を100 µmストレイナーを用いて1本の50 mLコニカルチューブに回収します。細胞懸濁液をピペッティングで数回穏やかに混ぜて細胞を均一に分散させ、トリパンブルー排除法により細胞数をカウントします。最後に、ブタ脂肪由来幹細胞を6 × 10⁴ cells/cm²の密度で、適切なサイズの培養容器に細胞培養培地とともに播種します。

そして、単層形成を促進するために、細胞を37°C、5% CO2条件下でインキュベートします。ストローマ血管分画由来のブタ脂肪由来幹細胞の形態はマウスやヒトの脂肪由来幹細胞に似ており、播種後24時間で拡大した線維芽細胞様形態が観察されます。ブタ脂肪由来幹細胞は72時間以内にコンフルエントとなり、この時点で脂肪細胞またはその他の間葉系分化が可能な状態になります。

これらの細胞は化学的誘導後に強力な脂肪分化能を示し、分化後9日で成熟脂肪細胞が観察され、豚脂肪由来幹細胞の90%以上が脂肪分化を示しました。CD 29、CD 44、CD 90、およびMHC 1を含む間葉系幹細胞の表面マーカーは、豚脂肪由来幹細胞で高く発現している一方、CD 4a、CD 31、CD 45、およびMHC IIはほとんど検出されませんでした。これにより、これらの豚脂肪由来幹細胞は、内皮幹細胞や造血幹細胞の顕著な混入がなく、間葉系細胞の特性を示すことが証明されました。さらに、分化した豚脂肪由来幹細胞は、特定の組織染色染色の使用により、脂肪細胞、骨細胞、または軟骨細胞として同定でき、これらのストローマ血管分画由来細胞が間葉系前駆細胞に典型的な多能性を保持していることが示されました。

本手順を実施する際は、細胞培養における適切な無菌操作を徹底し、細胞の生存率を最大にするためにすべての工程を可能な限り迅速に行うことが重要です。習熟すれば、適切に操作を行うことで、6時間以内に2～3頭の豚から細胞を回収することが可能です。

この標準的な手法は、糖尿病分野の肥満研究者が、脂肪細胞分化を制御する転写因子などの分子スイッチを探索するための道を開きました。このビデオを視聴することで、ブタ脂肪由来幹細胞の単離方法と、これらの細胞が脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞へと分化する多能性を評価する方法について十分に理解できるはずです。