脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離

本手順の目的は、マウスのさまざまな脂肪組織からSca1陽性の間葉系幹細胞を単離することです。この手法の主な利点は、免疫磁気ビーズを用いた細胞分取により、異なる脂肪貯蔵庫から由来する脂肪由来幹細胞を効率的に濃縮し、その後の実験に利用できることです。一般的に、この方法を初めて行う研究者は、分取に十分な細胞数を確保するために、コラゲナーゼによる組織消化の強度と時間を最適化させる必要があるため、習得に時間を要することがあります。

皮下脂肪パッドを単離するには、まずマウスを泡沫 dissecting board の上に仰臥位で置き、70% ethanol をスプレーします。四肢をボードに固定した後、下腹部の皮膚に小さな切開を加えます。次に、切開部位の上端をピンセットで掴み、ハサミを用いて腹部から胸部にかけて皮膚と腹膜を剥離します。

体の側面に沿って皮膚に側切線を入れ、皮膚を腹膜から頭側に向かって反転させます。次に、残りの皮膚を後ろに引き、鼠径脂肪を体から離した状態で保持し、22ゲージの針を用いて皮膚をボードに固定します。続いて、ピンセットで腹膜付近の鼠径脂肪パッドの付け根を掴み、精細剪刀を用いて皮膚と鼠径脂肪の間を鼠径部に向かって切り離します。この際、皮下脂肪パッドに皮膚が混入しないように注意してください。

次に、分離した鼠径脂肪組織を37 °Cに温めた培地が入ったSQラベル付き60 mmディッシュに移し、動物の反対側の鼠径脂肪組織も同様に採取します。内臓脂肪組織を分離するには、腹膜を切開して内臓脂肪組織と腸を露出させます。その後、腸を胸の方へ脇に寄せます。

遠位端の内臓脂肪パッドを掴み、脂肪組織をゆっくりと引き上げて、精巣上体組織を含まないように注意しながら剥離します。次に、脂肪パッドを37 °Cの培地が入ったVISラベル付きの60 mmディッシュに入れます。すべての脂肪パッドを回収後、ディッシュを組織培養フードに移し、培地を吸引除去します。

曲剪を用いて脂肪組織を細かく刻みます。次に、刻んだ脂肪片を、調製直後のコラゲナーゼを含む個別の50 milliliterチューブに加えます。続いて、組織が消化されるまで、チューブを300 RPM、37 degrees Celsiusで10〜20分間振盪します。

皮下脂肪組織の断片がまだ視認できる場合があります。コラゲナーゼ溶液に20 millilitersの培養液を加えて消化を停止させ、10 milliliterのセルローストレーナーを用いて組織スラリーを10回吸引・分注し、消化された組織を完全に解離させます。細胞を100 micronのセルストレーナーでろ過し、組織を遠心分離します。

その後、ペレットを乱さないように注意しながら培地を慎重にデカンテーションし、両方の細胞群を5 mLの滅菌水で緩やかに再懸濁させます。赤血球が溶血するまで2分間待ちます。その後、各チューブにFBSを添加した培地25 mLを加えて反応を停止させます。

両方の脂肪細胞集団を新しい100 micronのセルストレーナーでろ過し、再度遠心分離した後、ペレットを1〜3 mLの培地で再懸濁します。トリパンブルー排除法で細胞数をカウントした後、皮下脂肪組織細胞および内臓脂肪組織細胞をそれぞれ1×10⁶個ずつ、6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに播種します。細胞をトリプシン処理した後、トリプシンを1 mLの分離バッファーで希釈し、培養プレートを遠心分離します。

各チューブに500 µLの分離バッファーを加えて細胞を懸濁させ、再度遠心分離を行います。次に、各チューブに90 µLの分離バッファーを加えて細胞を再懸濁し、細胞懸濁液に10 µLのanti-Sca1 FITC一次抗体を加えて混合します。4 °Cの暗所にて10分間インキュベートした後、各チューブに1 mLの分離バッファーを用いて細胞を洗浄します。

遠心後、各細胞懸濁液を80 µLの分離バッファーで再懸濁します。次に、各ウェルに20 µLのAnti-FITC Microbeadsを加え、プレートを4 °Cで、遮光した状態で15分間静置します。インキュベーション終了後、細胞を1 mLの分離バッファーで洗浄し、各チューブにつき500 µLの新鮮なバッファーで細胞を再懸濁します。

次に、磁性ホルダーにカラムをセットし、500 µLの分離緩衝液でカラムを洗浄します。皮下脂肪パッドの組織培養から細胞をカラムへと移しますが、その際、気泡が入らないように注意してください。そして、ラベルされていないSca1陰性細胞を15 mLコニカルチューブに回収します。すべての細胞が通過した後、500 µLの分離緩衝液でカラムを3回洗浄してください。

次に、カラムをマグネットから新しい15 milliliterコニカルチューブに移し、1 milliliterの新鮮な分離緩衝液をカラムに通過させて、Sca1陽性細胞を溶出させます。最後に、Sca1陽性細胞分画と陰性細胞分画の両方を遠心分離し、ペレットを1 milliliterの培地で再懸濁します。その後、各分画の細胞数をカウントし、新しい6ウェル細胞培養プレートの個別のウェルに分画を播種します。

皮下脂肪から単離された血管間質細胞は、Sca1の発現レベルに関係なく、線維芽細胞様の伸展した細胞形態を示します。皮下鼠径部脂肪由来のSca1高発現細胞と同様に、内臓副精巣脂肪由来のSca1高発現細胞も伸展した線維芽細胞様の細胞形態を示します。一方、VIS Sca1低発現細胞は上皮様形態を示します。

Sca1-GFPマウスから単離したSca1 high細胞は、組織培養においてGFP陽性細胞として容易に識別できます。実際に、これらの細胞をフローサイトメトリーで解析すると、GFP陽性細胞の大部分が抗Sca1抗体によって検出されるSca1タンパク質を細胞表面に発現していることが確認されます。リアルタイムPCR解析と併せて、鼠径部および精管由来のSca1 high脂肪由来幹細胞における、コラーゲン分解性マトリックスメタロプロテアーゼの発現差を実証することが可能です。

さらに、ペリセルラー分解活性を評価するためにフルオレセイン標識I型コラーゲンゲルを用いた場合、内臓由来のSca1高発現脂肪由来幹細胞によって媒介されるコラーゲンリモデリング活性の著しい上昇が観察されます。この脂肪パッド細胞の分離法を習得すれば、適切に行うことで2時間以内に完了させることが可能です。本手順を実施する際は、効率的に脂肪パッドを分離できるよう、手術野を清潔かつ整理された状態に保つことが重要です。

本手順に続き、コラーゲン分解アッセイなどの他の手法を実施することで、脂肪由来幹細胞が介在する組織リモデリングに関するさらなる疑問を解消することができます。この技術の開発により、肥満およびマトリックス生物学分野の研究者が、マウスおよびヒトにおける脂肪組織のリモデリングと機能における脂肪由来幹細胞の役割を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、脂肪組織貯蔵庫から一次Sca1陽性細胞を採取し、濃縮する方法について十分に理解できるはずです。