脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離^高脂肪由来幹細胞（ASCに）

この手順の全体的な目標は、さまざまなマウス脂肪パッドからSca1陽性間葉系幹細胞を単離することです。この技術の主な利点は、免疫磁気ビーズベースの細胞選別を使用することにより、異なる脂肪貯蔵庫からの脂肪由来幹細胞を効果的に濃縮し、その後の実験に効果的に関与させることができることです。一般に、この方法に不慣れな研究者は、コラゲナーゼを介した組織消化の強度と持続時間を最適化して、ソーティングに十分な数の細胞を調達する必要があるため、苦労するでしょう。

皮下脂肪パッドを分離するには、マウスをフォーム解剖ボードの仰臥位に置き、動物に70%エタノールを噴霧することから始めます。足をボードに固定した後、下腹部の皮膚に小さな切開を行います。次に、鉗子で切り口の上部をつかみ、はさみを使用して皮膚と腹膜を腹部から胸部まで分離します。

体の側面に沿って皮膚に横方向の切り込みを入れると、腹膜から頭に向かって皮膚が反射します。次に、鼠径部の脂肪を体から離して残りの皮膚を引き戻し、22ゲージの針を使用して皮膚をボードに固定します。次に、鉗子を使って腹膜近くの起点にある鼠径部脂肪パッドをつかみ、細いハサミで皮膚と鼠径部脂肪の間を切り取り、鼠径部に向かって進行し、皮下脂肪パッドが皮膚で汚染されないようにします。

次に、分離した鼠径部脂肪パッドを摂氏37度の培養液を含むSQラベルの60ミリメートル皿に入れ、同様に動物の反対側から鼠径部脂肪パッドを採取します。内臓脂肪パッドを分離するには、腹膜を切開して内臓脂肪パッドと腸を露出させます。次に、腸を脇に動かし、胸部に向かって動かします。

遠位端の内臓脂肪パッドをつかみ、脂肪組織を優しく引き上げて、精巣上体組織を除外するように注意しながら解剖します。次に、摂氏37度の培地を含むVISラベルの60ミリメートル皿に脂肪パッドを置きます。すべての脂肪パッドが収集されたら、皿を組織培養フードに移し、培地を吸引します。

湾曲したハサミを使用して、パッドをミンチにします。次に、調製したばかりのコラゲナーゼが入った個々の50ミリリットルチューブに脂肪片を加えます。次に、組織が消化されるまで、チューブを300RPMおよび摂氏37度で10〜20分間振とうします。

皮下脂肪パッド組織の一部の部分がまだ見える場合があります。コラゲナーゼ溶液に20ミリリットルの培地を加えて消化を停止し、10ミリリットルの血清ピペットを使用して組織スラリーを吸引して分注し、消化された組織を完全に解離させます。100ミクロンのセルストレーナーで細胞をろ過し、組織を遠心分離します。

次に、ペレットを乱さないように注意しながら、培地を慎重にデカントし、両方の細胞群を5ミリリットルの滅菌水に穏やかに再懸濁します。赤血球が溶解されるまで2分待ちます。次に、FBSを添加した25ミリリットルの培地で各チューブ内の反応を停止します。

新しい100ミクロンの細胞ストレーナーで両方の脂肪細胞集団をろ過し、それらを再びスピンダウンしてから、ペレットを1〜3ミリリットルの培地に再懸濁します。トリパンブルー排除法により計数した後、6ウェル培養プレートの個々のウェルに1回10〜6番目の皮下脂肪パッド細胞と内臓細胞を別々にプレートする。細胞をトリプシンした後、トリプシンを1ミリリットルの分離バッファーで希釈し、培養プレートを遠心分離します。

分離バッファーのチューブあたり500マイクロリットルに細胞を懸濁し、細胞を再度遠心分離します。次に、分離バッファーのチューブあたり90マイクロリットルで細胞を再懸濁し、10マイクロリットルの抗Sca1 FITC一次抗体を細胞懸濁液に混合します。暗所で摂氏4度で10分間インキュベートした後、チューブあたり1ミリリットルの分離緩衝液で細胞を洗浄します。

紡糸後、細胞は細胞懸濁液あたり80マイクロリットルの分離バッファーに再懸濁されます。次に、20マイクロリットルのAnti-FITCマイクロビーズを各ウェルに混合し、プレートを摂氏4度に置き、15分間光から保護します。インキュベーションの終了時に、細胞を1ミリリットルの分離緩衝液で洗浄し、チューブあたり500マイクロリットルの新鮮な緩衝液に細胞を再懸濁します。

次に、マグネティックホルダーにカラムを置き、500マイクロリットルのセパラトンバッファーでカラムをすすぎます。皮下脂肪パッド組織培養物から細胞をカラムに移し、気泡を避けながら、標識されていないSca1陰性細胞を15ミリリットルの円錐管に回収します。すべての細胞が通過したら、500 μLの分離バッファーでカラムを3回洗浄します。

次に、磁石からカラムを新しい15ミリリットルの円錐管に移し、1ミリリットルの新鮮な分離バッファーをカラムに注入して、Sca1陽性細胞を溶出します。最後に、Sca1陽性細胞画分と陰性細胞画分の両方をスピンダウンし、ペレットを1ミリリットルの培地に再懸濁します。次に、各フラクションの細胞数をカウントし、新しい6ウェル細胞培養プレートの個々のウェルにフラクションをプレートします。

皮下脂肪から単離された血管間質細胞は、Sca1の発現レベルに関係なく、線維芽細胞様の伸張した細胞形状を示します。皮下鼠径部脂肪由来のSca1高細胞と同様に、内臓精巣上体脂肪由来のSca1高細胞は、線維芽細胞様の伸張した細胞形状を示します。一方、VIS Sca1低細胞は類上皮形状を示します。

単離されたSca1-GFPマウスから単離されたSca1高分子細胞は、組織培養においてGFP陽性細胞として容易に同定されます。実際、これらの細胞をフローサイトメトリーで評価すると、GFP陽性細胞のほとんどが、抗Sca1抗体によって検出されるように、細胞表面にSca1タンパク質を発現していることが確認されています。リアルタイムPCR解析と組み合わせることで、鼠径部と精巣上体脂肪由来のSca1高脂肪由来幹細胞との間のコラーゲン分解マトリックスメタロプロテイナーゼの差次的発現を実証することができます。

さらに、フルオレセイン標識I型コラーゲンゲルを使用して細胞周囲分解活性を評価すると、内臓Sca1高脂肪由来幹細胞によって媒介されるコラーゲンリモデリング活性の著しい増加が観察されます。一度マスターすると、適切に行えば、脂肪パッド細胞の分離は2時間で完了することができます。この手順を試みる際には、効率的な脂肪パッドの分離を確保するために、清潔で整理された手術野を維持することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、コラーゲン分解アッセイなどの他の方法を実行して、脂肪由来の幹細胞媒介性組織リモデリングに関する追加の質問に答えることができます。その開発後、この技術は、肥満およびマトリックス生物学の分野の研究者が、マウスとヒトの脂肪組織のリモデリングと機能における脂肪由来幹細胞の役割を探求する道を開きました。このビデオを見れば、脂肪組織デポから初代Sca1陽性細胞を調達し、濃縮する方法を十分に理解できるはずです。