Name: 脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離高脂肪由来幹細胞（ASCに） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶマウスの脂肪組織からSca1陽性間葉系幹細胞を免疫磁気ビーズを用いて効率的に分離・濃縮する方法。コラゲナーゼ消化と細胞選別により、再生医療研究に有用な脂肪由来幹細胞を取得できます。

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この作品は、カンナビノール（THC）はNIH DK095137によってサポートされています。私たちは、記載された方法の開発と高度化に貢献して現在および過去の研究室のメンバーに感謝します。

倫理声明：動物の使用およびケアに関するミシガン大学委員会（UCUCA）は、実験動物の管理と使用に関する指針（実験動物研究所、国家研究評議会）に従い、すべての方法およびプロトコルを承認しました。マウスは、ミシガン大学の飼育に維持され、食料と水を自由に与え、12時間の明/暗サイクルで維持されています。 1.準備<ol><li> DMEM、10％FBS、1×P / S / G、および1×抗生物質/抗真菌剤で初代培養培地を準備します。これは、消化の前に組織を維持するために使用されます。 37ºCの水浴中にストックし、アリコートを置きます。 </li><li> 5匹までの、単離される脂肪パッドの種類ごとにHBSS（+カルシウム、+ Mg）を中に溶解させミリリットルの5mg /でタイプIIIコラゲナーゼ溶液の5ミリリットルを準備します。 10ミリリットルを作る、単一の遺伝子型からSQとVISを分離する際に、例えば、野生型および変異体SQとVIS場合、20ミリリットルを作ります。 7.4およびSTEにpHを調整しますフィルタを波立たせます。 50ミリリットルチューブに小分けし。光を避けて脇に置きます。 </li><li>手術野を消毒するために70％エタノールを使用してください。拭うと青のパッドでカバーしています。青いパッドの上にいくつかのエタノールをスプレーしてください。 </li><li>発泡スチロールの板に吸収パッドを突き止めるし、はさみでトリミングするために22 G針を使用してください。青いパッドの上にボードを設定し、解剖を開始するまで、別の青色のパッドでカバーした後、エタノールでパッドをスプレーします。 </li><li>手術野に隣接するスタンドにエタノールと場所を持つ2つの50mlチューブを埋めます。エタノールにハサミやピンセットを置きます。 </li><li>手術器具をエタノールを洗い流すためにPBSプラス1×抗抗持つ別の50ミリリットルチューブを埋めます。 </li><li>フードでは、各組織型のラベル60ミリメートルの料理とは、37ºCに温めた培養培地で満たします。手術領域に隣接するプレートを置きます。 </li></ol>皮下（SQ）脂肪パッドの2の単離<ol><li>イソフルランおよび気胸の過剰投与によりマウスを安楽死させます。 </li><li>優しく70％エタノールでマウスをスプレーし、仰臥位横たわっていました。 22 G針で発泡ボードに足をピン。 </li><li>下腹部の皮膚の小さなカットを行います。鉗子でカットの上部を持ち、はさみを取り、腹膜から皮膚を分離します。 </li><li>皮膚が胸部に腹部から腹膜から分離された後、本体の側面に沿って皮膚の横カットを行うことで、離れて頭に向かって腹膜から肌を反映しています。 </li><li>体から離れ鼠径部脂肪を保持し、残りの皮膚を反映し、22 G針でボードに突き止めます。 </li><li>細かいハサミやピンセットに切り替えます。腹膜の近くに原点にピンセットで鼠径部脂肪パッドをつかみ、皮膚とのSQを汚染回避鼠径部に向かって進行し、皮膚や鼠径部脂肪の間離れてスニップ。 </li><li>ラベルされた60ミリメートル皿にばらばら鼠径部脂肪パッドを配置します。 </li></ol>内臓（VIS）脂肪パッドの3分離<ol><li> 2.5ステップと同様に、内臓脂肪パッドおよび腸を露出させる開放腹膜を切りました。 </li><li>胸部に向かって腸を離れて移動します。 </li><li>遠位端にVIS脂肪パッドをつかみ、ゆっくりと引き上げます。組織（雌マウスを使用している場合、または子宮）精巣上体を除外するように注意しながらVIS脂肪パッドを解剖。 </li><li>ラベルされた皿、残りVISパッドの繰り返しステップ3.3で配置します。 </li></ol>脂肪パッドの4コラゲナーゼ消化<ol><li>組織培養フードに60ミリメートルの皿を移動し、メディアを吸引します。 </li><li>湾曲したハサミで脂肪パッドをミンチ後、コラゲナーゼ溶液に追加します。エタノールおよびPBSで組織タイプの間にはさみとピンセットを洗浄してください。 </li><li>組織が消化されるまで、300 rpmで10〜20分間、37ºCで振ります。 SQのいくつかの作品がまだ表示されている場合は、許容可能です。これは、後の手順で対処します。 </li><li> collagを停止するためにコラゲナーゼ溶液を培地25 mlを加え消化された組織を分散させるために10ミリリットルの血清学的ピペットを用いenase処理、ピペットを上下に10回。 </li><li> 100μmの細胞ストレーナーを用いて株細胞。 300×gで10分間遠心分離します。 </li><li>慎重にペレットを乱さし、細胞を懸濁するペレットと静かにピペットに滅菌水5ミリリットルを追加していないメディアをオフにデカント。赤血球を溶解するために2分を待ちます。 </li><li>新しい100μmのセルストレーナーを介して、10％FBSおよび株細胞と培地25ミリリットルを追加します。 </li><li> 300×gで10分間遠心分離します。デカントメディアと培養培地の1ミリリットルでペレットを再懸濁し。 </li><li> 1トリパンブルー：1を用いて、血球計数器を用いて細胞を数えます。 </li><li> 6ウェルプレートに1ウェル内のプレート1×10 6個の細胞。 </li></ol> 5.磁気細胞分離<ol><li>細胞接着の約4~6時間後、HBSS（-Ca、-Mg）で細胞を2回洗浄します。 0.05％トリプシンを用いて接着細胞を解離します。 1mLの分離緩衝液中でトリプシン細胞懸濁液を希釈し、は回転300×gで5分間。 </li><li>上清を吸引。 500μlの緩衝液中で細胞を再懸濁し。 10μlのアリコートを削除し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。 </li><li> 300×gで5分間スピン細胞。 </li><li>完全に上清を吸引。 90μlの緩衝液中で細胞を再懸濁し。 10μlの抗のSca1-FITC一次抗体を追加します。よく混ぜ、暗所で4ºCで10分間インキュベートします。 </li><li> mlのバッファーと遠心セル300×gで5分間1で細胞を洗浄。完全に上清を取り除きます。 </li><li> 80μlの緩衝液中で細胞を再懸濁し。 20μlの抗FITCマイクロビーズを追加します。よく混ぜ、暗所で4ºCで15分間インキュベートします。 </li><li> mlのバッファーと遠心セル300×gで5分間1で細胞を洗浄。 </li><li>上清を除去し、500μlの緩衝液中にペレットを再懸濁。 </li><li>磁気ホルダーに列を配置し、500μlの緩衝液でカラムをすすぎます。 </li><li>カラムに細胞懸濁液を追加します。ピペッティングしながら気泡を避けてください。 </li><li>非標識のSca1を収集- &lt;/ SUP&gt;細胞および500μlの緩衝液でカラム3回洗浄します。リザーバが空である場合にのみ、新しいバッファを追加します。ピペッティングしながら気泡を避けてください。 </li><li>磁気ホルダーから列を削除し、15ミリリットルコニカルチューブに配置します。 </li><li>列にバッファリングし、カラムリザーバーを介して供給されるプランジャーを押してのSca1の+を溶出1ミリリットルを追加します。 </li><li> 300×gで5分間、細胞画分をスピンダウン。 1mLの培地中に再懸濁した細胞。 </li><li>標識し、非標識画分から10μlのアリコートを削除し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。 </li><li>プレート6ウェルプレートの1ウェル中の各細胞画分。 </li></ol>フローサイトメトリーでのSca1 高のACSの免疫磁気分離の6.検証<ol><li> HBSS（-Ca、-Mg）で2回細胞を洗浄し、0.05％トリプシンを用いて細胞を解離します。 </li><li> 5分間、300×gで遠心分離した細胞。 1ミリリットル培養培地中で細胞を再懸濁し、血球計数器を用いてカウントします。 </li><li>入手&gt; 10 6 </SUP&gt; 1ミリリットル培養培地中の細胞と5分間、300×gで遠心。 </li><li>さらに2回上清を除去し、ステップ6.3を繰り返します。 </li><li> 2％ヤギ血清+ RTで30分間、2％BSA及びブロック1mlで再懸濁細胞。 </li><li> 5分間、300×gで遠心分離した細胞。 </li><li>ブロッキング溶液を除去します。 </li><li> 4℃で2％ヤギ血清および2％BSA + PBSで100μlのPBS中で、：または抗のSca1アレクサフルオロ647（4000.25μgの、1）：ラットIgG2aのアレクサフルオロ647（4000.25μgの、1）を追加します。暗所で30分間。 </li><li>細胞に冷PBSの1ミリリットルを追加します。 4°Cで5分間遠心分離300×gで。 </li><li>さらに2回上清を除去し、ステップ6.9を繰り返します。 </li><li> 1mlのPBSで細胞を再懸濁し。フローサイトメトリー分析の準備のために100μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡します。 </li></ol>

<ol><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li>
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<li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis%3B+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで我々は分離と異なる脂肪パッドからマウスのASCの免疫細胞分離およびin vitro実験のためのそれらの使用を実証します。提示された方法は、ASCを9,14の技術的に複雑で高価なFACS媒介分離よりも有利で ​​あるのSca1陽性のASCの多数の迅速な隔離のために有効です。 FACSは異なり、免疫細胞の分離は、標的細胞集団を同定するための多数の抗原の使用を許可しません。表面抗原は、十分に特徴づけされている場合はそれにもかかわらず、免疫磁気分離の使用は中核施設なしまだ小さい機関で多くの生物学的研究者に容易にアクセスすることはできませんFACS機器15の使用に頼ることなく、分析される細胞の数が増加します。 成功した結果を確実にするために観察しなければならない手順のいくつかの重要な側面があります。 ADIPの調達オース由来幹細胞、マウスの脂肪組織デポの外科的分離を必要とします。したがって、組織の検索の速度と精度は、生存細胞の高い数を得るために不可欠です。また、きれいな手術用のフィールドや楽器のメンテナンスは、細胞や組織サン...

細胞抗原1（のSca1、またはLy6A / E）の幹第造血および間葉系幹細胞5,6によって発現される細胞表面マーカーとして同定されました。マウス脂肪デポから得られた脂肪組織の間質の血管画分（SVF）は、線維芽細胞、マクロファージ、血管内皮細胞、神経細胞、および脂肪細胞前駆細胞の7を含む細胞の異種集団です。脂肪細胞の前駆細胞、または脂肪由来幹細胞（ASCには）、コラーゲンが豊富な血管周囲の細胞外マトリックス（ECM）8内に存在する非脂質を含んだ細胞です。 CD34 +：のSca1 + 9とCD29 + -約SVFの50％は、系統陰性（林）として特徴付けられるのASC、から構成されています。 ; in vitroでの脂肪細胞分化が可能である脂肪細胞前駆細胞、 - CD24：これらの細胞のほとんどはのSca1 +ですしかし、細胞の一部のみ（SVFの0.08％）がのSca1を構成します<sアップ&gt; +：増殖性およびin vivoの条件9で脂肪細胞に分化を完全に行うことができますCD24 +細胞。 CD24からCD24 +細胞を区別することなくのSca1 + SVFを使用しての潜在的な警告にもかかわらず-免疫細胞分離を使用して、貯蔵脂肪からのSca1 +のASCを、細胞を単離一次脂肪細胞前駆細胞の細胞自律的な表現型を決定するための効率的かつ実用的なアプローチです。 肥満および糖尿病の分野では、組織線維症及び炎症が2型糖尿病3の発達および維持において重要な役割を果たしています。最近、徳永ら 。 （VIS、または内臓）鼠径部（または皮下、SQ）およびperigonadal C57BL6 / J脂肪デポから分離されたのSca1 high細胞は、in vitro 10 で異なる遺伝子署名およびECMリモデリングを示すことが示されました。 MMP14（MT1-MMP）、膜 - トンの原型メンバーYPEマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）ファミリーは、コラーゲン分解活性の1を介して、白色脂肪組織（WAT）の開発を仲介します。 以下のプロトコルを使用して単離され、濃縮された細胞を用いて行ってもよいの実験例は、三次元培養、分化研究、コラーゲン分解アッセイ、およびRNA配列10,11を含みます。分解アッセイは、テロペプチド11,12の保全を確実にするために、酸抽出コラーゲンで行われるべきです。次のプロトコルが異なる脂肪デポからの一次血管間質細胞を分離し、免疫磁気細胞分離を用いて、脂肪細胞の前駆細胞を豊かにする方法を紹介します。細胞選別の有効性は、フローサイトメトリーを用いてとのSca1プロモーター 13によって駆動されるのSca1 +細胞においてGFPを発現するのSca1-GFPマウスを用いによって評価されます。

<table><tbody><tr><td>3型コラゲナーゼ</td><td>Worthington 生化学的</td><td>LS004182</td><td>組織消化</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>高グルコース培養培地</td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌/グルタミン (100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>培地抗生物質</td></tr><tr><td>抗抗抗 (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>抗真菌</td></tr><tr><td>剤 FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x, pH 7.4)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン (0.05%)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer</td><td>BD Bioscience</td><td>352360</td><td>100-&mu;mセルス</td></tr><tr><td>トレーナー60mmプレート</td><td>BDファルコン</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td>大型</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>FST14091-11</td><td>細かい湾曲した先端</td><td></td></tr>大きな<tr><td>鉗子</td><td>FST11000-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細かい鉗子任意の</td><td>ベンダー25G</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/8インチ針</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>22G 1.5インチ針</td><td>BD</td><td>305159</td><td></td></tr><tr><td>15 mlコニカルチューブ</td><td>BDファルコン</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mlコニカルチューブ</td><td>BDファルコン</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>MACS分離カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Sca1 microbead kit (FITC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-529</td><td>FITC-anti-Sca1 1&ordm;Abおよび抗FITCマイクロビーズ2&ordm;Ab</td></tr><tr><td>AutoMACS ランニングバッファー</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>MACS マルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>ブルーチャックスパッド</td><td>フィッシャー</td><td>276-12424</td><td></td></tr><tr><td>吸収パッド</td><td>フィッシャー</td><td>19-165-621</td><td></td></tr><tr><td>発泡スチロールボード</td><td></td><td></td><td>50 mLチューブから使用</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG2a アレクサ フルーア 647</td><td>Invitrogen</td><td>R2a21</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG2a 抗マウス Sca1 アレクサ フルーア 647</td><td>Invitrogen</td><td>MSCA21</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG2a R-PE</td><td>インビトロジェン</td><td>R2a04</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG2a アンチマウス F4/80R-PE</td><td>Invitrogen</td><td>MF48004</td><td></td></tr><tr><td>丸底チューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (&ndash;Ca、&ndash;Mg)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca, +Mg)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>コラゲナーゼ溶液</td></tr><tr><td>I 型コラーゲン (2.7 mg/ml in 37mm 酢酸</td>) で<td>調製 12><</sup</td>><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>0.34 N NaOH</td><td>社内</td><td>で調製</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>Corning</td><td>2870-22</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 カルボン酸、スクシンイミジルエステル、混合異性体</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>0.89 M NaHCO3&nbsp;</サブ></td><td>Gibco</td><td>25080-094</td><td></td></tr></tbody></table>

脂肪デポ固有のsca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ascに）

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

脂肪由来幹細胞(ASC)の単離は、脂肪組織生物学、脂肪形成、および細胞外マトリックス(ECM)リモデリングの分野で重要な方法です。In vivoでは、原線維性コラーゲンからなるECMに富む環境が、肥満の進行と退行の際に脂肪組織を構造的にサポートします。マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)によって媒介される生理学的ECMリモデリングは、脂肪組織のサイズと機能の調節に大きな役割を果たします1,2。生理的コラーゲン溶解性ECMリモデリングの喪失は、過剰なコラーゲン蓄積(組織線維症)、マクロファージ浸潤、そして最終的にはインスリン抵抗性を含む代謝恒常性の喪失につながる可能性があります3,4。遺伝子標的マウスモデルで脂肪組織の表現型の変化が観察された場合、in vitro研究のために脂肪デポから一次ASCを単離することは、ASCの機能調節における特定の遺伝子の役割を定義するための効果的なアプローチです。以下では、Sca1高ASCの免疫磁気分離を定義します。

別の脂肪パッドからのSca1 高のASCの濃縮。 SQ脂肪表示線維芽細胞などから単離された血管間質細胞は、関係なくのSca1の発現レベル（ 図1A）のセル形状を伸ばしました。一方、VIS（eWAT由来）のSca1 高いとのSca1 低細胞は、その細胞形状の明確な違いを示しています。 SQのように（IWAT由来）のSca1 high細胞、VIS（eWAT由来）のSca1 high細胞は、VISのSca1 低い細胞に対し、延伸し、線維芽細胞様細胞形状を表示する類上皮形状を示しています。 SCA1-GFPマウスから単離したSCA1 高い細胞は容易に組織培養（ 図1B）におけるGFP陽性細胞として同定されます。これらの細胞をフローサイトメト...

マウスの鼠径部(皮下)および性腺周囲(内臓)脂肪組織デポから間質血管画分(SVF)を分離し、それらの遺伝子発現とコラーゲン分解活性を評価するために必要な技術を紹介します。この方法には、免疫磁気細胞分離を用いたSca1高脂肪由来幹細胞(ASC)の濃縮が含まれます。

脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離<sup&gt;高</sup&gt;脂肪由来幹細胞（ASCに）

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

本手順の目的は、マウスのさまざまな脂肪組織からSca1陽性の間葉系幹細胞を単離することです。この手法の主な利点は、免疫磁気ビーズを用いた細胞分取により、異なる脂肪貯蔵庫から由来する脂肪由来幹細胞を効率的に濃縮し、その後の実験に利用できることです。一般的に、この方法を初めて行う研究者は、分取に十分な細胞数を確保するために、コラゲナーゼによる組織消化の強度と時間を最適化させる必要があるため、習得に時間を要することがあります。皮下脂肪パッドを単離するには、まずマウスを泡沫 dissecting board の上に仰臥位で置き、70% ethanol をスプレーします。四肢をボードに固定した後、下腹部の皮膚に小さな切開を加えます。次に、切開部位の上端をピンセットで掴み、ハサミを用いて腹部から胸部にかけて皮膚と腹膜を剥離します。体の側面に沿って皮膚に側切線を入れ、皮膚を腹膜から頭側に向かって反転させます。次に、残りの皮膚を後ろに引き、鼠径脂肪を体から離した状態で保持し、22ゲージの針を用いて皮膚をボードに固定します。続いて、ピンセットで腹膜付近の鼠径脂肪パッドの付け根を掴み、精細剪刀を用いて皮膚と鼠径脂肪の間を鼠径部に向かって切り離します。この際、皮下脂肪パッドに皮膚が混入しないように注意してください。次に、分離した鼠径脂肪組織を37 °Cに温めた培地が入ったSQラベル付き60 mmディッシュに移し、動物の反対側の鼠径脂肪組織も同様に採取します。内臓脂肪組織を分離するには、腹膜を切開して内臓脂肪組織と腸を露出させます。その後、腸を胸の方へ脇に寄せます。遠位端の内臓脂肪パッドを掴み、脂肪組織をゆっくりと引き上げて、精巣上体組織を含まないように注意しながら剥離します。次に、脂肪パッドを37 °Cの培地が入ったVISラベル付きの60 mmディッシュに入れます。すべての脂肪パッドを回収後、ディッシュを組織培養フードに移し、培地を吸引除去します。曲剪を用いて脂肪組織を細かく刻みます。次に、刻んだ脂肪片を、調製直後のコラゲナーゼを含む個別の50 milliliterチューブに加えます。続いて、組織が消化されるまで、チューブを300 RPM、37 degrees Celsiusで10〜20分間振盪します。皮下脂肪組織の断片がまだ視認できる場合があります。コラゲナーゼ溶液に20 millilitersの培養液を加えて消化を停止させ、10 milliliterのセルローストレーナーを用いて組織スラリーを10回吸引・分注し、消化された組織を完全に解離させます。細胞を100 micronのセルストレーナーでろ過し、組織を遠心分離します。その後、ペレットを乱さないように注意しながら培地を慎重にデカンテーションし、両方の細胞群を5 mLの滅菌水で緩やかに再懸濁させます。赤血球が溶血するまで2分間待ちます。その後、各チューブにFBSを添加した培地25 mLを加えて反応を停止させます。両方の脂肪細胞集団を新しい100 micronのセルストレーナーでろ過し、再度遠心分離した後、ペレットを1〜3 mLの培地で再懸濁します。トリパンブルー排除法で細胞数をカウントした後、皮下脂肪組織細胞および内臓脂肪組織細胞をそれぞれ1×10⁶個ずつ、6ウェル細胞培養プレートの各ウェルに播種します。細胞をトリプシン処理した後、トリプシンを1 mLの分離バッファーで希釈し、培養プレートを遠心分離します。各チューブに500 µLの分離バッファーを加えて細胞を懸濁させ、再度遠心分離を行います。次に、各チューブに90 µLの分離バッファーを加えて細胞を再懸濁し、細胞懸濁液に10 µLのanti-Sca1 FITC一次抗体を加えて混合します。4 °Cの暗所にて10分間インキュベートした後、各チューブに1 mLの分離バッファーを用いて細胞を洗浄します。遠心後、各細胞懸濁液を80 µLの分離バッファーで再懸濁します。次に、各ウェルに20 µLのAnti-FITC Microbeadsを加え、プレートを4 °Cで、遮光した状態で15分間静置します。インキュベーション終了後、細胞を1 mLの分離バッファーで洗浄し、各チューブにつき500 µLの新鮮なバッファーで細胞を再懸濁します。次に、磁性ホルダーにカラムをセットし、500 µLの分離緩衝液でカラムを洗浄します。皮下脂肪パッドの組織培養から細胞をカラムへと移しますが、その際、気泡が入らないように注意してください。そして、ラベルされていないSca1陰性細胞を15 mLコニカルチューブに回収します。すべての細胞が通過した後、500 µLの分離緩衝液でカラムを3回洗浄してください。次に、カラムをマグネットから新しい15 milliliterコニカルチューブに移し、1 milliliterの新鮮な分離緩衝液をカラムに通過させて、Sca1陽性細胞を溶出させます。最後に、Sca1陽性細胞分画と陰性細胞分画の両方を遠心分離し、ペレットを1 milliliterの培地で再懸濁します。その後、各分画の細胞数をカウントし、新しい6ウェル細胞培養プレートの個別のウェルに分画を播種します。皮下脂肪から単離された血管間質細胞は、Sca1の発現レベルに関係なく、線維芽細胞様の伸展した細胞形態を示します。皮下鼠径部脂肪由来のSca1高発現細胞と同様に、内臓副精巣脂肪由来のSca1高発現細胞も伸展した線維芽細胞様の細胞形態を示します。一方、VIS Sca1低発現細胞は上皮様形態を示します。Sca1-GFPマウスから単離したSca1 high細胞は、組織培養においてGFP陽性細胞として容易に識別できます。実際に、これらの細胞をフローサイトメトリーで解析すると、GFP陽性細胞の大部分が抗Sca1抗体によって検出されるSca1タンパク質を細胞表面に発現していることが確認されます。リアルタイムPCR解析と併せて、鼠径部および精管由来のSca1 high脂肪由来幹細胞における、コラーゲン分解性マトリックスメタロプロテアーゼの発現差を実証することが可能です。さらに、ペリセルラー分解活性を評価するためにフルオレセイン標識I型コラーゲンゲルを用いた場合、内臓由来のSca1高発現脂肪由来幹細胞によって媒介されるコラーゲンリモデリング活性の著しい上昇が観察されます。この脂肪パッド細胞の分離法を習得すれば、適切に行うことで2時間以内に完了させることが可能です。本手順を実施する際は、効率的に脂肪パッドを分離できるよう、手術野を清潔かつ整理された状態に保つことが重要です。本手順に続き、コラーゲン分解アッセイなどの他の手法を実施することで、脂肪由来幹細胞が介在する組織リモデリングに関するさらなる疑問を解消することができます。この技術の開発により、肥満およびマトリックス生物学分野の研究者が、マウスおよびヒトにおける脂肪組織のリモデリングと機能における脂肪由来幹細胞の役割を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、脂肪組織貯蔵庫から一次Sca1陽性細胞を採取し、濃縮する方法について十分に理解できるはずです。

immunomagnetic-separation-fat-depot-specific-sca1high-adipose-derived

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオは、マウスの大動脈周囲弓脂肪組織から蛍光標識された神経堤由来脂肪由来幹細胞(ADSC)を単離および培養する技術を示しています。単離後、NCADSCsを検出し、蛍光活性化細胞ソーティング法を用いて選別した後、プレート上で培養することで細胞増殖を促進します。...

マウス腹膜脂肪組織からの脂肪由来幹細胞の単離

2001年には、UCLAの研究者は、成体幹細胞の集団の単離を説明した脂肪組織から、脂肪由来幹細胞またはASCをと呼ばれる。この記事では、コラゲナーゼを使用して手動、酵素消化プロトコルを使用して脂肪吸引物からASCの分離の概要を説明します。...

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

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強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

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ヒト脂肪由来間葉系幹細胞の単離・増殖のための酵素フリー法

このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気ビーズ分離により、マウス腹腔内白色脂肪組織(WAT)デポから脂肪形成および線維炎症性間質細胞亜集団を単離するための技術的アプローチを説明しています。...

マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離

蛍光活性化細胞選別を用いて、マウス上体脂肪パッドから生存性の高い脂肪前駆細胞を単離する簡単な方法を提示する。...

マウス上端体脂肪組織からの脂肪前駆細胞の調製

本プロトコルは、文献と比較して時間的増加を伴う途方もない細胞収量をもたらすADSC単離のための改良された方法論を記載する。この研究はまた、長期凍結保存後に比較的多数の生細胞を得るための簡単な方法を提供します。...

脂肪組織から間葉系幹細胞を得る技術および長期凍結保存における間質血管画分のキャラクタリゼーション

細胞療法の準備/操作ステップで導入された異種(化学的または動物由来)製品は、宿主患者における免疫反応性および病原性伝播のリスクの増加と関連しています。ここでは、ヒト脂肪由来幹細胞の単離および in vitro...

ヒト異種異系フリーのヒト治療法によるヒト脂肪由来幹細胞の単離と培養

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。...

スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定

このプロトコルは、ヒト脂肪由来間葉系幹細胞(ADSC)の培養や上清の収集から、超遠心分離を使用した細胞外小胞(EV)の抽出まで、すべての手順を説明しています。...

ヒト脂肪由来間葉系幹細胞からの細胞外小胞の精製とキャラクタリゼーション

ここでは、処理時間&gt;90%短縮、高い細胞生存率、広範な適合性を特徴とする、脂肪由来幹細胞および脂肪細胞を効率的に単離する標準的な方法を提示します。...

豚脂肪組織から脂肪由来幹細胞および脂肪細胞の効率的な単離

学ぶマウスの脂肪組織からSca1陽性間葉系幹細胞を免疫磁気ビーズを用いて効率的に分離・濃縮する方法。コラゲナーゼ消化と細胞選別により、再生医療研究に有用な脂肪由来幹細胞を取得できます。

脂肪デポ固有のSca1の免疫磁気分離

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