ラットにおけるナイーブ砂糖と脂肪の摂取後の中脳辺縁系と中間皮質ドーパミン報酬サイトからのc-Fosの活性化の同時検出

この実験プロトコルの全体的な目標は、VTAとその主要な中脳症DA投影ゾーンが、コーン油、グルコース、フルクトース、またはサッカリン溶液の新規摂取後に座標および同時のc-Fos活性化を示すかどうかを判断することです。この方法は、モチベーションなどの神経生物学分野の重要な質問に答え、口当たりの良い刺激に応答して複数の脳部位が協調的に活性化されるかどうかを特定するのに役立ちます。この技術の主な利点は、確立された行動アッセイ、細胞活性化技術、および統計分析を組み合わせることです。

装置をセットアップするには、ロバーストッパー付きの校正済み遠心分離管と45度の角度の金属製シッパーチューブを使用して、ラットに提示された溶液を正確に測定します。ピンと張った金属スプリングでホームケージに固定し、キャリブレーションが見えるようにします。トレーニングの3〜5日前に、ラットへの餌の配給を制限して、ラットの体重を元の体重の85%に減らし、溶液を消費するモチベーションを高めます。

その間、ラットが短い遅延で後続のテストソリューションをサンプリングする確率を最大化するために、1時間のセッションで、動物に0.2%サッカリンを含む10ミリリットルの事前トレーニング溶液を動物に4日間提供します。各セッションの前後にチューブの重量を量り、吸気測定値を取得します。次に、6つの解のうちの1つを受け取ったサブグループで5日目に摂取テストを実行します。

ラットが短い遅延で溶液をサンプリングすることを確認し、この要件が満たされない場合は被験者を研究から除外します。組織を準備するには、動物を犠牲にした後、頭蓋骨から脳をすばやく取り出します。ロンゲールを使用して、脳から骨を後方から前に向かって慎重に割って取り除きます。

小脳の下の領域で作業し、ロンジャーが骨と髄膜の間にいることを確認します。頭蓋骨の上部と側面を取り除いたら、小さなヘラを使って脳を基部から持ち上げ、小さなハサミで脳神経を切り取ります。次に、脳を4%パラホルムアルデヒド溶液に摂氏4度で一晩固定します。

翌日、脳が容器の底に落ち着くまで、脳を室温のショ糖溶液に入れます。その後、嗅球を取り外します。その後、小脳と橋を切除します。

次に、尾部をミクロトームのステージに固定した状態で脳を冠状に装着し、40mirometersの冠状切片を切断します。この手順では、切片を5ミリリットルの5%正常ヤギ血清と0.2%トリトンx-100のPBSで1時間処理します。.次に、処理した切片を一次抗体と4°Cで36時間インキュベートし、1ミリリットルのPBSを含むウェルでインキュ

36時間後、毎回10分間、5ミリリットルのPBSで切片を3回すすぎます。次に、1ミリリットルのPBSを含むウェルで、二次抗体と切片を室温で2時間インキュベートします。その後、切片を5ミリリットルのPBSで毎回10分間3回すすぎます。

次に、すすぎた切片を市販のアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ混合物で2時間インキュベートします。2時間後、切片を5ミリリットルのPBSで3回、毎回10分間すすぎます。その後、過酸化水素の存在下で切片をDABと5〜10分間反応させます。

その後、VTA切片をチロシンヒドロキシラーゼ抗体と5ミリリットルのPBS中でインキュベートし、摂氏4度で一晩インキュベートすることにより、VTA切片を二重標識します。翌日、切片を5ミリリットルのPBSで3回、毎回10分間すすぎます。その後、二次抗体と切片を5ミリリットルのPBSで室温で2時間インキュベートします。

2時間後、切片を5ミリリットルのPBSで3回、毎回10分間すすぎます。二次抗体ペルオキシダーゼ複合体を用いて抗体を可視化するには、DABと0.3%硫酸ニッケル溶液の組み合わせと5〜10分間反応させます。ソフトウェアアイコンをダブルクリックしてセルをカウントします。

メニューバーに移動し、[取得]、[ライブイメージ]の順にクリックします。その後、関心領域にピントを合わせ、画面をクリックして参照点を設定します。次に、グリッドツールバーに移動し、[グリッドの表示]と[グリッドラベルの使用]をクリックします。

あらかじめ決められたトレースで関心領域の輪郭を描きます。次に、関心のある各領域のすべてのセルをカウントし、左側のサイドバーで[プラス]を選択して、c-Fosセルのカウントを登録します。定義された暗赤色の円が観察された場合、c-Fosに陽性のセルを考えます。

各サイトについてこのプロセスを繰り返し、各関心領域の各セクションの 2 人の無知な評価者の評価者間の信頼性が常に 0.8 を超えることを確認します。その後、関心領域内のc-Fos陽性ニューロンを数えます。VTAのTH陽性細胞とTH陰性細胞にc-Fos免疫反応性が存在するかどうかを描写します。

この画像は、脂肪または糖の摂取が、扁桃体全体、基底外側、および中枢皮質内側扁桃体のサブエリアでc-Fosの活性化を異なる方法で増加させることを示しています。この画像では、コーン油、グルコース、フルクトースの摂取に曝露された動物で実際の扁桃体c-Fosの活性化が観察されました。VTAにおけるC-Fosの活性化は、コーン油と水にばく露された動物でも観察されました。

黒色の矢印は、代表的な二重標識のTH c-Fos陽性細胞を示し、灰色の矢印は代表的なc-Fosのみの細胞を示します。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば、3〜4週間で実行できます。この手順を試行する際には、正確な方法論、保管、およびカウントに従うことを忘れないでください。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。