Name: ラットにおけるナイーブ砂糖と脂肪の摂取後の中脳辺縁系と中間皮質ドーパミン報酬サイトからのc-Fosの活性化の同時検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学ぶラットの脳報酬回路におけるc-Fos活性化の免疫組織化学的手法。砂糖と脂肪摂取後の中脳辺縁系ドーパミン経路の同時活性化パターンを解析し、動機づけの神経生物学的機構を解明する。

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このプロジェクトの彼らのハードワークのためのダイアナIcaza氏-Culaki、クリスタルサンプソンとTheologia Karagiorgisに感謝します。

これらの実験プロトコルは、すべての被験者と手順は、ナショナルケアのための健康ガイドの研究所や実験動物の使用に適合していることを証明制度動物実験委員会によって承認されています。 1.被験者<ol><li>購入および/または血統の雄Sprague-Dawleyラット（260〜300グラム）。 </li><li>金網ケージで個別ハウスラット。ラット飼料と水を自由に摂取させて12時12時間の明/暗サイクルでそれらを維持します。 </li><li>適切なサンプルサイズを割り当てます（例えば n≈6から8）ランダムにグループに。 </li></ol> 2.試験装置とインテーク手順<ol><li>ゴム栓で較正遠心管を使用して、45°の角度金属シッパーチューブを提示溶液（0.1 mlの±）正確な測定を提供します。キャリブレーションの可視性を可能にするために、ピンと張った金属バネによりホームケージに固定します。 </li><li> 〜（食糧配給を制限溶液を消費する意欲を高めるために、元の体重の85％までの重量を低減するために、ラットの15 / G /日）。注： - 5日体重減少は3間取る必要があります。 </li><li>ラットは（1分未満）短い待ち時間で、その後のテストソリューションをサンプリングする確率を最大化するために、1時間のセッションで4日間0.2％サッカリンの事前トレーニングソリューション（10ミリリットル）を提供します。 </li><li>数滴をこぼしことにより、遠心管を通る流れを確認してください。 </li><li>摂取量測定値を得るために、各セッションの前と後の管を秤量します。 </li><li> A）水、b）の小説風味（0.05％チェリーフレーバー）0.2％サッカリン、c）は8％のフルクトース、D）8：6ソリューション（10ミリリットル、1時間）のいずれかを受けたサブグループに5日目吸気テストを実行します％グルコース、E）0.3％キサンタンガム中に懸濁し、3.5％のコーン油、およびf）0.3％キサンタンガム。 </li><li>栄養溶液は等カロリーであることを確認します。このように、3.5％コーン油の濃度が8％糖液に等カロリーのです。 </li><li>目を確認してください短い待ち時間（1分未満）を有するラットの試料溶液に。この要件が満たされない場合、その後の研究から被写体を捨てます。 </li></ol> 3.組織標本<ol><li>各試験溶液への最初の曝露後にペントバルビタール90分の腹腔内注射によって各動物を麻酔。動物が適切に深い耳介刺激に揺れ直接角膜の圧力や頭以下の点滅、動物はもはや足のピンチに撤退などの反射神経に応答することを実証しないことにより、麻酔されていることを確認。 </li><li>以前69記載されているように経各動物を灌流。 <ol><li>ペントバルビタールナトリウム（65 mgの/ kg）を過剰投与によりラットを麻酔、胸郭を削除し、心臓69への自由なアクセスのための胸を露出させます。 </li><li>左の心臓弁の頂点に針を置き、大静脈を切りました。リン酸緩衝固定コ続いてリン酸緩衝液（PBS、~180 ml）を投与します4％パラホルムアルデヒド（~180 ml）をntaining。 </li><li>動物が実際に液体は、鼻、口、および生殖器領域などの他の空洞を残しているかどうかを調べることによって正確に灌流されていることを確認してください。注：パラホルムアルデヒドで適切な固定は、大きな筋肉の動きを伴うことになります。これが発生しない場合には、この反応が起こるまで、針を再調整します。 </li></ol></li><li>すぐに離れて頭蓋骨から毛や皮膚を切断して頭蓋骨から脳を削除してください。後方から前方に移動する脳から骨をクラックし、除去するために、骨鉗子を使用してください。骨鉗子、骨や髄膜軟膜の間にあることを確認して、小脳以下と背後の領域で最初に動作します。頭蓋骨の上部と側面が削除されると、ベースから脳を持ち上げるために、小さなへらを使用し、小さなハサミで脳神経を切り取ります。骨を削除しようとしたときに、脳に損傷を与えないように注意してください。 </li><li> 4℃で一晩4％パラホルムアルデヒド溶液中で脳を修正しました。彼らは容器の底に沈降するまで、室温で30％スクロース/ 70％PBS溶液中で脳を置きます。 </li><li>脳をブロック<ol><li>嗅球に対して横方向に尾を切断、脳の吻側部分を削除してください。 </li><li>小脳や橋のレベルで横方向に切断し、脳の尾の部分を削除してください。 </li></ol></li><li> + - （ブレグマに2.20ミリメートル吻側2.86）、NACのコアとシェルと背側線条体（スライディングミクロトームのステージに固定された尾部を冠状脳をマウントし、のmPFCを通じて冠状切片（40μm）をカット1.76 - ブレグマに1.60ミリメートル吻側）、AMY（-2.12 - ブレグマ-2.92ミリメートルの尾）、およびVTA（-5.20 - ブレグマ-5.60ミリメートルの尾）。指導のためのラット脳アトラス70を使用してください。 </li><li>最終的な免疫組織化学的分析71のためにPBSで満たされた24ウェルプレートの個々のウェルに自由に浮遊セクションを収集します。 24私たちをシールするためにパラフィルムを使用して、LLプレートをPBSは、容器内に蒸発し、脳を乾燥しないことを確認します。 4℃で脳組織を保管してください。 </li></ol> （71から適応）4のc-fosの手順<ol><li> 5％正常ヤギ血清の5ミリリットルと0.2％トリトンX-100をPBS中で1時間で各セクションを扱います。 </li><li> 1mlのPBSを含むウェルで36時間4℃で：一次抗体で処理した切片（5,000ウサギ抗c-FOS、1）インキュベート。 </li><li>リンスのセクションでは、10分間、PBS（5ml）で3倍。 </li><li>二次抗体とインキュベートする（ビオチン化ヤギ抗ウサギ; 1：200）を室温で2時間、1mlのPBSを含むウェルに。 </li><li> 10分ごとに、PBS中の各セクションの3倍（5ミリリットル）をすすぎます。 </li><li> 5mlのPBSでAvadin DH（100μL）およびビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼH（100μlの）で構成キットに付属市販のアビジン - 西洋ワサビペルオキシダーゼ混合物中で2時間すすぎセクションをインキュベートします。 </li><li>再すすぎのセクションでは、PBで3倍10分間、S（5ml）中。 </li><li> DAB溶液5mlを含有するウェル中の組織の反応性に応じて、10分- 5用0.0015％のH 2 O 2の存在下で、0.05％ジアミノベンジジン（DAB）を用いて切片を反応させます。 </li><li>ダブルラベルVTAセクション。 4℃で一晩、PBS（5ml）溶液：チロシンヒドロキシラーゼ（TH）抗体（2,000ウサギ抗ラットTH、1）でそれらをインキュベートします。 </li><li>リンス切片は10分間ごとに、PBS（5ml）に3倍。 </li><li>二次抗体とインキュベートする（ビオチン化ヤギ抗ウサギ; 1：200）、PBS（5ml）中に室温で2時間。 </li><li>リンス切片は10分間ごとに、PBS（5ml）に3倍。 </li><li>二次抗体 - ペルオキシダーゼ複合体を用いて、抗体を可視化します。 DAB /のNiCl溶液5mlを含有するウェル中の組織の反応に応じて、10分 - 5ため、0.05％DABおよび0.3％硫酸ニッケル溶液の組み合わせと反応します。 </li><li> DAB溶液は、それから色が乳白色薄緑色であることを確認してください0.3％の硫酸ニッケルとの反応。解決策があまりにも緑である場合、反応は暗すぎるとなります。 </li><li>ゼラチン被覆スライド上のすべてのセクションをマウントします。トルエン系溶液（TBS）の数滴でスリップをカバーし、それらを一晩乾燥してみましょう、と。 </li><li>実験条件は、観察者に知られていないようにコードがスライドします。 </li></ol> c-fosの免疫反応性カウントの5決意<ol><li>縁前方ののmPFC、infralimbicのmPFC、NACコア、NACシェル、側底AMY核、中央皮質内側AMY、背側線条体、およびVTA：これらの関心領域（ROI）内のFos陽性ニューロンをカウントするために公平な観察者のペアを割り当てます。 c-Fosの免疫反応性は、TH +とVTAにおけるTH-細胞に存在したかどうか。 図1は、顕微鏡からNACのスクリーンキャプチャした画像を提供して区切ります。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53897/53897fig1.jpg" /> <stroNG&gt;のc-fosのカウントが行われていることにより、グリッドによって概説関心領域の表示図側坐核（NAC）の1.代表セクション。NACシェルはNACのコアに内側と腹側に発見されました。 NACのコアは、前交連取り囲む（前方コムを。）。側脳室（横ベント。）の腹側範囲が表示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53897/53897fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="2"><li>試験条件のすべてにすべての動物に共通するサイトごとに少なくとも3つの代表的なスライスを分析します。 </li><li>アウトライン（ 図1）をトレースすることで、各ROIのための領域全体を分析するためのソフトウェアおよび光学顕微鏡を使用してください。 <ol><li>指定されたサイトでは、アプリケーションを開き、買収ドロップダウンメニューをクリックし、「ライブ映像」をクリックします。焦点にROIを持参し、基準点を確立するために、画面をクリックします。そして、TRガイドとしてグリッドを使用して、選択された脳領域をエース。トレースが完了した後、細胞を（ - 5.3.1.3 5.3.1.1ステップ）数えます。 <ol><li>ソフトウェアのアイコンをダブルクリックします。 「取得」し、「ライブ映像」をクリックして、メニューバーに移動します。焦点にROIを持参し、基準点を確立するために、画面をクリックします。 </li><li>グリッドツールバーに移動し、「表示グリッド &quot;と&quot;使用グリッドラベル」をクリックします。所定のトレースとROIの概要を説明します。 </li><li> c-fosの細胞の数を維持するために左側のサイドバーにある「+」を選択し、各ROIエリア内のすべてのセルを数えます。カウントを登録するために単独で各セルをクリックします。定義された暗赤色の円は（ 図1）が観察されたときのc-fosのための陽性細胞を考えてみましょう。 </li></ol></li><li>サイトごとにこの手順を繰り返します。 </li><li>レコードは、実験ノートにし、将来の分析のためにコンピュータ上でカウントされます。トレースとカウントを保存するには、「セーブデータファイル」「ファイル」をクリックして、メニューバーに移動します。 </li></オール&gt; </li><li>各ROI内の各セクションのための2つの無知な評価者の（カウントの相関関係を使用して）評価者間信頼性が常に0.8を超えていることを確認してください。 </li></ol> 6.統計<ol><li> 1日目、2、3、4 69のサッカリン摂取量を比較した分散の反復測定1ウェイ分析（ANOVA）を使用して、最初の4日間にわたり、ベースラインサッカリンの摂取量を評価します。 </li><li>ランダム化されたブロック2ウェイANOVA 69を使用して、6つのグループのテスト摂取量（5日目）とサッカリン摂取量（4日目）を比較。 </li><li>個々の有意な効果69を決定するために、テューキー比較した（p &lt;0.05）を使用します。 </li><li>評価者間信頼性を決定し、一般的な観察者のカウントを使用しています。 </li><li>各サイト69のための3つの代表スライスの平均のc-fosのカウント。 <ol><li> 6ソリューション（3.5％コーン油、8％グルコース、8％のフルクトース、0.2％風味のサッカリン、XAの摂取により誘導されるのc-fosの活性化の1方向ANOVAを実行しますperilimbicのmPFC 69用nthanガム制御および水）。 </li><li> infralimbicのmPFCのための6つのグループの繰り返し平行分析、NACコア、NACシェル、基底外側AMY、中央皮質内側AMY、VTAと背側線条体。個々の有意な効果69を明らかにするためにテューキー比較した（p &lt;0.05）を使用します。 </li></ol></li><li>その懸濁剤の水の摂取量と摂取の両方でコーン油の摂取量を比較し、キサンタンガム。非栄養甘味料、サッカリンの水の摂取量と摂取量の両方と果糖とブドウ糖摂取量を比較してください。 </li><li>各サイト内の溶液の摂取量およびc-fosの活性化との間に有意な関係はボンフェローニrの相関（P &lt;0.05）を用いて観察したかどうかを確立します。 <ol><li>体系的に3.5％コーン油グループの各動物についてperilimbicとinfralimbic前前頭皮質におけるc-fosの数を比較します。 </li><li> 6サイトの各ペアの系統的に平行分析を繰り返して（VTA、背側線条体、infralim3.5％のコーン油のためのBICのmPFC、perilimbicのmPFC、NACコア、NACシェル、基底外側AMY、中央皮質内側AMY）。 </li><li>他の5つの実験吸気条件（8％グルコース、8％のフルクトース、0.2％風味のサッカリン、キサンタンガム制御および水）のために、これらの6サイトの体系平行分析を繰り返します。 </li></ol></li><li>溶液条件内の同じ動物をボンフェローニrの相関（P &lt;0.05）を使用して、ソリューション全体でのc-fosの活性化の間、各ソリューション内の重要な関係を決定することによって、すべてのサイトで評価されたという事実を利用します。 </li></ol>

著者には、競合する金融利害関係を持っていません。

研究の目的は、DAの報酬関連のニューロンのソース（VTA）と前脳投影ターゲット（NAC、AMY、のmPFC）は同時に携帯のc-fosの技術を用いて、ラットの脂肪と砂糖の新規摂取後に活性化されたかどうかを判断することでした。本研究は、これまで69発表された研究のプロトコルの詳細な説明です。これは、VTAは、縁前方のとinfralimbicのmPFC、NACのコアとシェルと基底外側および中央皮質内側AMYだけでなく、背側線条体への主要な投影ゾーンは、分散脳のネットワーク24として作用すると仮定されました-27、および、フルクトース（8％）やコーン油サッカリンに対する相対（3.5％）ソリューション（0.2％）、グルコースの新規摂取（8％）以下の水および他の制御ソリューションをコーディネートし、同時FLIを表示します。コー​​ン油、ブドウ糖と果糖ではなく、サッカリン摂取量は、VTA、縁前方のとinfralimbic mPでの重要かつ差動FLIの活性化をもたらしましたFC、NAC、基底外側および中央皮質内側AMY、および背側線条体のコアとシェル。 C-fosの技術に加えて、糖、脂肪...

脳ドーパミン（DA）が提案されたヘドニック1,2、努力関連の3と行動の習慣ベース4,5のメカニズムを通じて、口当たりのよい糖の摂取に中央応答に関与しています。これらの効果に関与する主要なDA経路は、腹側被蓋野（VTA）に由来し、側坐核（NAC）コアとシェル、基底外側および中央皮質内側扁桃体（AMY）、および縁前方のとinfralimbic内側へプロジェクト前頭前皮質（のmPFC）（レビュー6,7を参照）。 VTAは、ショ糖摂取8,9に関与している、とDA放出はNAC 10-15、AMY 16,17とのmPFC 18-20で砂糖の摂取後に観察されます。脂肪の摂取量はまた、DA NACは21を解放刺激し、背側線条体（尾状核被殻）への別のDA-豊富な投影ゾーンはまた、DA媒介送り22,23と関連していました。ケリー24-27は 、これらの複数のプロジェクトと提案しこのDA媒介システムのイオンゾーンは広範かつ緊密な相互接続28-34を介して統合された、インタラクティブな分散型の脳のネットワークを形成しました。 糖35-37および脂肪38-40の摂取量を減らすためにDA D1およびD2受容体アンタゴニストの能力に加えて、DAシグナリングはまた、コンディショニングフレーバーの嗜好（CFP）を生成する糖および脂肪の能力を媒介に関与しています41- 46。 NAC、AMYかのmPFC 47-49にDA D1受容体拮抗薬のマイクロインジェクションは、胃内グルコースによって誘発されたCFPの取得をなくします。 mPFCにDA D1またはD2受容体拮抗薬のいずれかの微量注入は、フルクトース-CFP 50の買収を排除するのに対し、フルクトース-CFPの取得及び発現が示差NACとAMY 51,52にDA拮抗薬によってブロックされています。 C-fosの技術53,54は、神経activatioを調査するために採用されていますnは、口当たりの良い摂取と神経の活性化によって誘導されます。用語「C-fosの活性化」とは、原稿全体で使用され、かつ作動ニューロンの脱分極中のc-Fosタンパク質の増加した転写により定義されます。ショ糖の摂取量は、NAC 55-57で、コア中央AMY核、VTAだけでなく、シェルでFOS様免疫反応性（FLI）を増加したが、ありません。偽摂食ラットにおけるショ糖摂取量は有意AMYとNACにFLIを増加ではなく、VTA 58、胃内スクロースまたはグルコース注入が大幅にNACとAMY 59,60の中央部と基底外側核においてFLIを増加させました。スケジュールされた飼料のアクセスにショ糖の繰り返し添加はNACシェルとコア61と同様のmPFCにFLIを増加させました。スクロース濃度のダウンシフトパラダイムが最大のFLIの増加は基底外側AMYとNACで発生したことを明らかにではなく、VTA 62。以下のコンディショニング、砂糖関連の自然REWAの絶滅目の行動は基底外側AMYとNAC 63にFLIを増加させました。また、トーンにペアリング砂糖の可用性は、その後側底AMY 64にFLIレベルを増加させるトーンをもたらしました。高脂肪の摂取量も、NACとのmPFCサイト65-67でFLIを増加させました。 以前に引用された研究のほとんどは、報酬に関連した分散型の脳のネットワーク24-27の識別に関する情報を提供していない単一のサイトにおけるc-fosの活性化に砂糖と脂肪の効果を調べました。また、研究の多くはまた、潜在的により調べることができたNAC（コアとシェル）、AMY（基底外側および中央皮質内側）とのmPFC（縁前方のとinfralimbic）のサブ領域の相対的な寄与を描写しませんでしたc-Fosのマッピング68に優れた空間、単一セルの解像度の利点。当研究室で69最近使用されたのc-fosの活性化と同時にVTA DA経路における測定の変化とそのプロジェクションゾーン（NAC、AMYとのmPFC）ラットにおける脂肪と糖の新規摂取後。本研究では、AMY、同時に6異なる溶液（コーン油、ブドウ糖、果糖、サッカリン、水及び脂肪乳剤コントロール）への急性曝露は差動でNACのサブエリアにFLIを活性化するかどうかを分析するための手続きと方法論的な手順を説明しますmPFCだけでなく、背側線条体。関連サイトでの変化と相関1の特定の部位の変化は、それによって、分散脳のネットワーク24-27のためのサポートを提供するか否かの各サイトと決意でFLIに重大な影響の確認を許可された差異のこの同時検出。試験されたこれらの手順は、VTA、縁前方のとinfralimbicのmPFC、NACのコアとシェル、および基底外側および中央皮質内側AMY）だけでなく、背側線条体whetherコーディネート表示していましたし、経口、無条件摂取後同時FLIの活性化グルコース（8％）、フルクトース（8％）、コーン油（3.5％）およびサッカリン（0.2％）溶液。

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawleyラットチャー</td><td>ルズリバーラボラトリーズ</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>ワイヤーメッシュケージ</td><td>ラボ製品、シーフォード、DE30</td><td>ケージラック</td><td></td></tr><tr><td>ラットChow</td><td>PMIニュートリションインターナショナル</td><td>5001</td><td></td></tr><tr><td>張り詰めた金属スプリング</td><td>ラボ製品、シーフォード、デラウェア</td><td>州N / A</td><td></td></tr><tr><td>ラット体重計</td><td>フィッシャーサイエンティフィックカンパニー</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 遠心分離チューブ</td><td>ラボ製品、シーフォード、DE</td><td>10-0501</td><td></td></tr><tr><td>ラバーストッパー</td><td>ラボ製品、シーフォード、デラウェア</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>メタルシッパー</td><td>ラボ製品、シーフォード、デラウェア</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>サッカリン</td><td>シグマケミカル株式会社</td><td>82385-42-0</td><td></td></tr><tr><td>クールエイド、チェリー</td><td>クールエイド</td><td>コマーシャル</td><td></td></tr><tr><td>クールエイド、グレープ</td><td>クールエイド</td><td>コマーシャル</td><td></td></tr><tr><td>フルクトース</td><td>シグマケミカル株式会社</td><td>F0127</td><td></td></tr>グル<tr><td>コース</td><td>シグマケミカル株式会社</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>コーンオイル</td><td>マッツォーラ</td><td>コマーシャルキ</td><td></td></tr><tr><td>サンタンガム</td><td>シグマケミカル株式会社</td><td>11138-66-2</td><td></td></tr><tr><td>スライディングミクロトーム</td><td>Microm International</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida カメラ</td><td>MBF バイオサイエンス</td><td>ソフトウェア アプリケーション</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチンコーティング スライド</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー</td><td>12-545-M</td><td></td></tr><tr><td>ゴールデン ナイロン ブラシ</td><td>ロウ・コーネル&nbsp;</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>ナチュラルヘアサブレ&nbsp;</td><td>ロウ・コーネル&nbsp;</td><td>2022</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>1 L パイレックスボトル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>1395-1L</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュインサート(ティッシュストレーナー)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>7200214</td><td></td></tr><tr><td>イーグルピペット&nbsp;</td><td>ワールド精密機器</td><td>E10 for 1-10&#956;l</td><td></td></tr><tr><td>イーグルピペット&nbsp;</td><td>ワールド精密機器</td><td>E100 for 20-100&#956;l</td><td></td></tr><tr><td>イーグルピペット&nbsp;</td><td>ワールド精密機器</td><td>E200 for 50-200&#956;l</td><td></td></tr><tr><td>イーグルピペット&nbsp;</td><td></td><td>100-1000&#956のためのワールド精密機器E1000;l</td><td></td></tr><tr><td>イーグルピペット&nbsp;</td><td></td><td>1000-5000&#956のための世界の精密機器E5000;l&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルヒント.1-10&#956;l</td>ユニバーサル<td></td>チップ5-200&#956 500192<td></td><td>ワールド精密機器</td></tr>。<tr><td>l</td><td>ユニバーサル</td><td></td>チップ500-5,000&#956 500194<td></td>ワールド精密機器</tr><tr><td>l</td><td>ワールド精密機器</td><td>500198</td><td></td></tr><tr><td>ブレード バイブロスライス 100</td><td>ワールド精密機器</td><td>BLADE</td><td></td></tr><tr><td>DPX 実装媒体&nbsp;</td><td>電子顕微鏡&nbsp;</td><td>13510</td><td></td></tr><tr><td>15 ml遠心分離管</td><td>Biologix Research Co.</td><td>10-0501</td><td></td></tr><tr><td>スライドボックス</td><td>Biologix Research Co.</td><td>41-6100</td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー&nbsp;</td><td>マデルコーポレーション&nbsp;&nbsp;</td><td>ZD-9556</td><td></td></tr><tr><td>ボートの重量を量る&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-202-100</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 使い捨てピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-5AM</td><td></td></tr><tr><td>ステレオ調査ソフトウェア</td><td>マイクロ明視野</td><td>ソフトウェア アプリケーション</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>strongカタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド粒状</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウムモノベーシック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S468-500</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム二相</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>水素過酸化物&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>セーフクリアII&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-044-192</td><td></td></tr><tr><td>メタノール&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A412-1</td><td></td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ベクター</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>ベクター</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>ABC キット ペルオキシダーゼ 標準</td><td>ベクター</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>抗 cFos (Ab-5) ウサギ</td><td>EMD 化学/Cal Biochem</td><td>PC38</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>SigmaAldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td>3,3' ジアミノベンジジンテトラ塩酸塩&nbsp;</td><td>SigmaAldrich</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>SigmaAldrich</td><td>5881</td><td></td></tr><tr><td>一次 TH 抗体</td><td>EMD ミリポア</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>ユートソル</td><td>ビルバック AH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ラットにおけるナイーブ砂糖と脂肪の摂取後の中脳辺縁系と中間皮質ドーパミン報酬サイトからのc-fosの活性化の同時検出

Simultaneous Detection of c-Fos Activation from Mesolimbic and Mesocortical Dopamine Reward Sites Following Naive Sugar and Fat Ingestion in Rats

この研究は、ラットにおける脳内のドーパミン（DA）経路上の脂肪と砂糖の新規摂取の効果を評価するための細胞のc-fosの活性化を使用しています。糖や脂肪の摂取量は、その生来の観光スポットだけでなく、学んだ嗜好によって媒介されます。脳ドーパミン、特にメソ大脳辺縁系と腹側被蓋野（VTA）からメソ - 皮質突起が、これらの未学習と学習した応答の両方に関与しています。いくつかのサイトと送信機/ペプチドシステムが対話前記分散脳ネットワークの概念は、口当たりのよい食物摂取を媒介することが提案されているが、経験的に、そのような行動を示す限られた証拠があります。したがって、砂糖の摂取は、DA放出を誘発し、側坐核を含む個別VTA DA投影ゾーンからのc-fosの様免疫反応性（FLI）（NAC）、扁桃体（AMY）を増加させ、前頭前皮質（のmPFC）だけでなく、背側線条体を内側。これらのサイトへの選択的DA受容体拮抗薬のさらに、集中管理糖または脂肪によって誘発さ条件付け味の好みの取得と発現を低下させる差別的です。これらのサイトは砂糖や脂肪の摂取量に応じて、分散脳のネットワークとして相互作用するかどうかを確認することにより、一つのアプローチは、VTAとその主要mesotelencephalic DA投影ゾーン（NACの縁前方のとinfralimbicのmPFC、コアとシェル、かどうかを評価連立することであろう基底外側および中央皮質内側AMY）だけでなく、背側線条体はコーン油（3.5％）、グルコース（8％）、フルクトース（8％）とサッカリン（0.2の経口、無条件摂取した後に調整され、同時FLIの活性化を表示するであろう％）ソリューション。このアプローチは、げっ歯類で口当たりの良い食物の摂取に報酬関連の学習を研究するために、関連する脳部位で同時に携帯のc-fosの活性化を使用することの実現可能性を同定することに成功した最初のステップです。

以下に記載されている全ての代表的な結果は、以前に69を公表されており、および技術の有効性を示すには「コンセプトの証明」をサポートするために、ここに再提示されています。 ソリューション摂取 ベースラインサッカリン摂取量の有意差は、全ての動物（F（3,108）= 57.27、P &lt;0.001）摂取量と（1日目のための最初の4日間にわたって観察された：1.3（0.2±）ミリリットル; 2日目：3.9（0.4±）ミリリットル; 3日目：5.9ミリリットル（0.6±）; 4日目：7.1（0.6±）ミリリットル）大幅に（p &lt;0.05、TukeyのHSD検定）と次第に増加。大幅に5日目に果糖とブドウ糖の摂取量ではなく、コーン油またはサッカリン摂取した（p &lt;0.05、TukeyのHSD検定）は4日目サッカリン摂取量に比べて増加した（p &lt;0.05、TukeyのHSD検定）...

本研究の目的は、ラットの脂肪と砂糖の新規摂取後のドーパミン経路と端末サイトにおける同時変化を測定するために、携帯のc-fosの活性化を使用して、信頼性の高い免疫組織学的手法を描くことで報酬関連の分散型の脳のネットワークを識別することです。

ラットにおけるナイーブ砂糖と脂肪の摂取後の中脳辺縁系と中間皮質ドーパミン報酬サイトからのc-Fosの活性化の同時検出

This study uses cellular c-fos activation to assess effects of novel ingestion of fat and sugar on brain dopamine (DA) pathways in rats. Intakes of sugars ...

本実験プロトコルの総合的な目的は、コーンオイル、グルコース、フルクトース、またはサッカリン溶液を初めて摂取した後に、VTAおよびその主要な中脳皮質DA投射領域において、c-Fosの活性化が協調的かつ同時に起こるかを確認することです。この手法は、モチベーションなどの神経生物学分野における重要な疑問への回答に寄与し、嗜好性刺激に応じて複数の脳部位が協調的に活性化されるかどうかを特定するのに役立ちます。本手法の主な利点は、確立された行動解析、細胞活性化技術、および統計解析を組み合わせている点にあります。装置を設置するために、校正済みのゴム栓付き遠心チューブと、ラットに提示する溶液を正確に測定するための45度角度の金属製シッパーチューブを使用します。これを、校正値を確認できるように、ピンと張った金属製スプリングでホームケージに固定します。トレーニングの3〜5日前に、溶液の摂取意欲を高めるため、ラットの給餌量を制限し、体重を元の体重の85%まで減少させます。その間、ラットがその後のテスト溶液を短時間で試行する確率を最大化するため、0.2%サッカリンを含むプレトレーニング溶液10 millilitersを、1回1時間のセッションとして4日間、動物に投与します。各セッションの前後でチューブの重量を測定し、摂取量を算出します。その後、5日目に、6種類の溶液のいずれかを受けたサブグループに対して摂取テストを実施します。ラットのサンプル溶液の潜時が短いことを確認し、この条件を満たさない個体は研究から除外してください。組織を調製するため、動物を安楽死させた後、速やかに頭蓋骨から脳を取り出します。ロンジュールを使用して、後方から前方に向かって慎重に骨を砕き、脳から取り除いてください。小脳の下の領域で作業を行い、論ジャー（骨鉗子）が骨と髄膜の軟膜の間にあることを確認します。頭蓋骨の上部と側面を除去した後、小さなスパチュラを用いて脳を基底部から持ち上げ、小さな鋏で脳神経を切断します。その後、脳を4%パラホルムアルデヒド溶液に入れ、4°Cで一晩固定します。翌日、脳を室温でショ糖溶液に浸し、容器の底に沈むまで放置します。その後、嗅球を除去します。続いて、小脳と橋を除去します。次に、脳を冠状面に向くように設置し、尾側をミクロトームのステージに固定して、厚さ 40 µm の冠状切片を作成します。この手順において、切片を 5% 通常ヤギ血清および 0.2% Triton x-100 含有 PBS 5 mL で 1 時間処理します。続いて、1 mL の PBS が入ったウェル内で、処理した切片を一次抗体とともに 4 °C で 36 時間インキュベートします。36時間後、切片を5 mLのPBSで10分間、3回洗浄します。次に、1 mLのPBSが入ったウェル内で、室温で2時間、二次抗体とともに切片をインキュベートします。その後、切片を5 mLのPBSで10分間、3回洗浄します。次に、洗浄した切片を市販のアビジンホースラジペルオキシダーゼ混合液中で2時間インキュベートします。2時間後、切片を5 mLのPBSで3回、各10分間ずつ洗浄します。その後、過酸化水素の存在下でDABを用いて切片を5〜10分間反応させます。その後、5 mLのPBSを用い、4°Cで一晩、チロシン水酸化酵素抗体とともにVTA切片をインキュベートし、二重標識を行います。翌日、5 mLのPBSで切片を3回、各10分間ずつ洗浄します。続いて、5 mLのPBSを用い、室温で2時間、二次抗体とともに切片をインキュベートします。2時間後、5 mLのPBSで切片を3回、各10分間ずつ洗浄します。二次抗体ペルオキシダーゼ複合体を用いて抗体を可視化するために、DABと0.3%硫酸ニッケル溶液の混合液で5〜10分間反応させます。ソフトウェアのアイコンをダブルクリックして細胞数をカウントします。メニューバーから「Acquisition」を選択し、「Live Image」をクリックします。次に、関心領域（ROI）に焦点を合わせ、画面上をクリックして基準点を設定します。続いて、グリッドツールバーで「Display Grid」と「Use Grid Labels」をクリックします。あらかじめ設定したトレースを用いて、関心領域を囲みます。次に、各関心領域内のすべての細胞をカウントし、左側のサイドバーで「Plus」を選択してc-Fos陽性細胞の数を登録します。明確な濃赤色の円が観察される細胞を、c-Fos陽性と判定してください。この工程を各部位で繰り返し、各関心領域の各セクションにおける2名の盲検評価者間の評価者間信頼性が常に0.8を超えることを確認します。その後、関心領域内のc-Fos陽性ニューロン数をカウントします。VTAにおいて、c-Fos免疫反応がTH陽性細胞およびTH陰性細胞のいずれに認められるかを判別します。この画像は、脂質または糖質の摂取が、扁桃体全体および基底外側核、中心・皮質内側核の各亜領域におけるc-Fos活性化を異なる形で増強させることを示しています。この画像では、コーンオイル、グルコース、およびフルクトースを摂取させた動物において、実際の扁桃体c-Fos活性化が観察されました。また、コーンオイルと水を摂取させた動物では、VTAにおけるc-Fos活性化も観察されました。黒色の矢印は代表的なTHおよびc-Fosの二重標識陽性細胞を示し、灰色の矢印は代表的なc-Fos単独陽性細胞を示しています。この手法に習熟すれば、適切に実施することで3〜4週間で完了させることができます。本手順を行う際は、正確な手法、保存方法、およびカウントを行うことが重要です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

simultaneous-detection-c-fos-activation-from-mesolimbic-mesocortical

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腸-脳神経コミュニケーションのリアルタイム解析:腸管グルコース刺激に応答した皮質ワイドカルシウムダイナミクス

学ぶラットの脳報酬回路におけるc-Fos活性化の免疫組織化学的手法。砂糖と脂肪摂取後の中脳辺縁系ドーパミン経路の同時活性化パターンを解析し、動機づけの神経生物学的機構を解明する。

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