Name: 開発インビトロ眼プラットフォームはコンタクトレンズをテストします (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぼう、コンタクトレンズ評価のためのインビトロ眼モデル構築法。涙液分泌、まばたきによる機械的摩耗、空気曝露をシミュレートし、眼科デバイスの性能予測と薬物放出試験に応用できます。

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著者らは、高度な眼科材料の開発のための資金調達源NSERC 20/20ネットワークを承認したいと思います。

すべての実験は、大学のウォータールーの動物実験倫理委員会によって概説関連するすべてのガイドラインに従っやコンプライアンスに完成しました。ウシ目が寛大に地元の食肉処理場から寄贈されています。 1.アイモデル<ol><li>金型13の設計と製作<ol><li>ヒト成人の目の平均生理寸法に従って目のモデルを設計します。13 </li><li>眼球と眼球モデルのまぶた片間250μmのギャップを残します。コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して、それぞれの金型を設計します。 </li><li> AutoCADのか、SolidWorksの持つ新しい.CADファイルまたは.sldprtファイルを作成します。人間の眼球/まぶたの3Dモデルを作成します。モデルの金型を作成し、.STLファイルとして金型を保存します。 </li><li> 3Dプリンタソフトウェアにインポート.STLファイル（replicator2用など、makeware）。印刷のパラメータ（位置、まばら、スケール、向き、滑らかさ、 などを指定します </em&gt;の）13。 </li><li>読むために3Dプリンタ用のGコードファイルとしてファイルを保存します。このようなPLA（ポリ乳酸）、ABS（アクリロニトリルブタジエンスチレン）、PC（ポリカーボネート）、またはそれらの組み合わせのような選択の材料は、金型13を印刷します。 </li><li>選択の材料の所望のフィラメントをインストールします。読むために3DプリンタにGコードファイルをインポートします。金型を印刷します。 注：眼モデルに滑らかな表面が望ましい場合あるいは、コンピュータ制御の数値（CNC）マシンを使用して目の型を作り出します。 CNC金型製造のために、金型の材料は、もはや熱プラスチックに限定されないが、金属、セラミックス、およびポリテトラフルオロエチレンなどの化学的抵抗性ポリマーに延びています。 </li><li>切削ドリルに接続されたCNCソフトウェアのインターフェイスを開きます。前面、上面、側面、および制御ソフトウェアインターフェイスで以前に構成された眼球/瞼モデル金型の斜視図に従って3次元金型を構築します。以下のための適切なパラメータを選択します加工（ビットサイズ、基板材料、材料の厚さ）と、金型を切断するために進みます。 </li></ol></li><li> PDMSを用いた接眼レンズの合成<ol><li>注射器を使用して、PDMS（ポリジメチルシロキサン）ベースの10ミリリットル体積を測定し、15〜50ミリリットルの遠心管にそれを埋めます。 PDMSの全重量のエラストマー溶液のw / vの10％を追加します。攪拌棒を使用して、よく溶液を混合。 </li><li>眼球とまぶたの型にPDMSソリューションを注ぎます。 PDMSは、重合を開始し、気泡がポリマーの外に溶解することを可能にするRT O / N（または少なくとも12時間）で安定することを可能にします。 注：上昇または展開されますPDMSに残って気泡がないことを確認します。 </li><li>その後、1時間、または5分間150°C（302°F）、75℃（167°F）のオーブンに型を入れました。より柔らかいゲルについては、PDMSが完全に重合するために、少なくとも48時間室温で放置します。 </li><li>数分間冷凍庫にサンプルを置きます。これは、PDMSを縮小し、簡素化されます金型からのサンプルを除去します。薄いへらを使って型から接眼レンズを抽出します。 </li><li>眼球とまぶた片の間の空間への溶液の送達のために、1月16日「同等の脚カプラチューブコネクタと1/16 &quot;×1/8&quot;ポリテトラフルオロエチレンチューブを接続し、チューブの穴でまぶた片にそれを添付。 </li></ol></li><li>アガロースを使用した眼球ピースの合成 注：眼球片は、アガロースのような他のポリマーを用いて合成することができます。以下の手順は、例えば、PDA（ポテトデキストロース寒天）またはSDA（サブローデキストロース寒天）寒天タイプの様々な眼の部分を生成するように改変することができます。 <ol><li> 2％（2グラム/ 100ミリリットル）ゲル、メジャーアガロースの2グラムを生成し、超純水100mlと混合します。アガロースが完全に溶解するように沸騰（100ºC）に対する解決策をもたらします。溶液を5分間クールダウンしてみましょう。 </li><li>眼球の金型への溶液を注ぎ、溶液を3のために冷却することができますRTで0分。スパチュラで眼球の部分を削除します。 -20で眼球寒天を保存 後で使用するために℃の冷凍庫。微生物学研究のために、オートクレーブ処理および/またはUV照射による眼球型を滅菌します。 </li></ol></li><li> PDMS眼球上のウシ角膜の取り込み 注：このプロトコルは、Parekh らから適応されています14。 <ol><li>層流フードの下で無菌状態のウシ角膜の解剖と取り込みを実行します。目を取得し、同じ日に、それらを分析。 </li><li>使用前に10分間のフローフードを回して、70％エタノールアルコールで消毒します。すべての材料と器具が273°F / 45分間133℃でオートクレーブで滅菌され、および流フードの入り口から無未満4インチを位置付けていることを確認してください。 </li><li> 2分間の希釈ポビドンヨード溶液の入ったビーカーに牛の目を浸し。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）Pを含有するビーカー中に眼をすすぎますH 7.4。鉗子を使用すると、静かにガラスシャーレ、角膜顔アップに目を配置します。 </li><li>平滑末端解剖ハサミで強膜付着点で切断することにより、過剰な筋肉と脂肪組織を削除します。動物の排泄物に指定された無菌ビーカーに過剰な組織を処分。 </li><li>マイクロはさみを使用して、眼から結膜を削除します。角膜輪部から1cm以上の距離を維持し、滅菌ガーゼで目を包みます。 </li><li>下にある脈絡膜および硝子体の侵入を避けるためにメスを用いて、強膜に表面的に縁領域とから約2mmの切開。慎重にその自然な湾曲から角膜を変形させることなく、メスや解剖ハサミを使用して360°だけ切開部を拡張します。 </li><li>細かい鉗子で、目から角膜を削除します。鉗子を使用して、慎重に任意の付着ブドウ膜組織を除去し、PBSで角膜をすすぎます。 </li><li>文化と滅菌容器に31ºCで角膜を保存培地（培地199など）組織の水分および細胞栄養を維持するために、3％ウシ胎児血清を含有します。 </li><li>実験に先立ち、PDMSの眼球の摘出した角膜を休ま、および特殊なクリップオンと一緒に2枚をクランプします。 </li></ol></li></ol> 2.点滅プラットフォーム<ol><li>ブリンク・プラットフォームの設計と製作 注：眼（セクション1で説明した）モデル、ギアシステム、および電子システム：点滅プラットフォームは、3つの機能部品で構成されています。 <ol><li>眼モデル（セクション1.1）のために記載したのと同様のCADや3Dプリントを使用して、点滅プラットフォームを設計・製造しています。それは接眼レンズの横方向と回転運動にモータの単純な回転を変換するようなギアシステムを設計します。15 </li><li>ピニオンギア機構を用いて、瞼の部分に接続されたピニオンの横方向の運動にステッピングモータの回転運動に変換します。 </li><li>使い方共役ギアシステム、三つの異なる眼球片のための3つ（またはそれ以上）の回転運動にステッピングモータから一方の回転運動を増幅します。 </li><li> 2間の距離が一定になるように、2ギアシステム、まぶた用と眼球のための1つを合わせます。マイクロコントローラ、モーターシールド、および二つのモータと電子システムを組み立てます。 注：点滅運動にギアシステムによって翻訳された回転モータを、提供するために、2つのステッピングモータを使用してください。 </li><li>マイクロコントローラ上に積層モーターシールドからなるシステムを持つ2つのステッピングモータを接続します。オープンソースソフトウェア製品で動作するように電子部品を接続して設定します。 </li><li>このような毎分ラウンド（RPM）、前方ラウンド数、後方ラウンド数、および旋回スタイルとしてモータパラメータを制御するためのシステムをプログラム。 注：詳細については、補足「Arduinoのコードファイル」を参照してください。 </li><li>ミリアン​​ペアからシステムソフトウェアをダウンロードnufacturersのウェブサイト。 </li><li>ソフトウェアをインストールし、それを開きます。所望の形状にステッピングモータを制御するためのコードを記述します。研究者によって定義されるようにモータが所望の方法で移動するように電子システムに電力を供給するために、ソースをシステムに接続します。 注：補足「Arduinoのコードファイル」を参照してください。 </li></ol></li><li>マイクロフルイディクス（人工涙液）との組立<ol><li>合成された眼球とまぶたのピースを取ると目をモデルに、それらに対応するクリップオンにそれらをスリップ。注射器で参加し、まぶたピース（セクション1.2.5）を持つマイクロ流体ポンプ上に配置されたチューブを接続します。テストは、プラットフォームを実行し、一貫性のある動きをチェック。 </li><li>プライムチューブと人工涙液（ATS）の安定した流れを確認してください。 ATSのレシピは、以前に報告されている。16 </li><li>手動で、水平面上で一緒に目をモデル部品を移動させるように眼球と目蓋は接触しています。所望の値にマイクロ流体ポンプの流量を設定します。 1〜1.5μL/ minに生理的な流量を設定します。17 </li><li>実験を開始するために、ポンプとアクチュエータを起動します。薬物送達実験のために、眼球片に薬剤を含有するコ​​ンタクトレンズを置きます。 </li><li>フロースルー液を12ウェルプレートに滴下することを可能にします。所望の設定時間間隔で、例えば、紫外可視分光法または蛍光などの一般的な検出方法を使用して、分析物または薬物濃度を定量する。1,4,18 </li><li>コンタクトレンズ上の涙成分の沈着を評価する研究については、「眼球」片にコンタクトレンズを配置します。廃棄することができるフロースルー液を、収集します。 </li><li>所望の時間間隔の後、眼球片からコンタクトレンズを除去し、そのような共焦点顕微鏡などのさらなる分析のためのレンズを準備します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

設計と製造の金型（1.1節）、プラットフォームアセンブリ（セクション2.2.1-2.2.3）、および実験操作を監視する（セクション2.2.4-2.2.7：特別な注意を必要とするプロトコル内の3つの重要なステップがあります。 ）。カビ（セクション1.1）の設計と生産の面では、眼球の作品は、人間の角膜の寸法に応じて設計されるべきです。眼球片が完全に商業コンタクトレンズ（CL）に収まるように作成することができる前に、しかし、金型の複数のプロトタイプを必要とし得ます。眼球と瞼片CLが存在するときに涙液が全眼モデルを通してスムーズに流れを保証するために接触している場合に加えて、250μmのニーズが維持されます。この距離は、将来の反復で変更することができるが、CLにフィットするのに十分な間隔を可能にするために、150ミクロン未満であってはなりません。プラットフォームアセンブリ（セクション2.2.1-2.2.3）は眼球とまぶた作品はコンタに入って来るように細心の注意が必要ですまばたき運動中のct。接眼レンズが完全に接触していない場合は、閉じたまぶたのシミュレーションと機械的擦れは失敗します。オペレータは、眼球とまぶたの両方が接触している、およびプログ...

コンタクトレンズ（CL）アリーナ内の関心のある二つの重要な領域は、不快感や小説CLアプリケーションの開発が含まれています。 CLの不快感を根底にあるメカニズムを解明することは、新規の開発8。何十年もの間、フィールドの目を逃れている問題であるような薬物送達デバイス1,3,9およびバイオセンサーなどの機能のCL、10月12日には、関心の領域ですかなりの潜在的な市場と。両方の状況では、 インビトロモデルにおける高度な開発フェーズの間、適切なレンズ材料又は設計特性を選択することを支援するための関連情報を提供するであろう。残念ながら、のCLおよび他の眼関連のアプリケーションを評価するためのin vitroモデルの電流は比較的原油と洗練されていないです。伝統的に、涙液層の堆積または薬物送達を評価するin vitroでのCLの研究は、固定された流体体積を含む静的な、大容量のバイアル中で行われるのGreATLY生理量を超えています。さらに、この単純なモデルは、自然の涙流れ成分と点滅反射を欠いている眼の環境の要因を定義しているどちらも。 洗練されたの開発は、生理学的に関連の眼」モデルは、「学際的なアプローチを必要とし、実質的なin vivoでの検証が必要になります。これらの理由から、私たちのin vitro眼モデルのための基本的な枠組みは、モデルが継続的に将来のアップグレードおよび変調によって改善することができるように、汎用性の高いです。現在までに、モデルは、涙液量、涙液の流れ、機械的摩耗及び空気曝露をシミュレートすることが可能です。その目的は、in vivoおよびex vivo観察中に予測し、無料で意味のある結果を提供するin vitroモデルを作成することです。

<table><tbody><tr><td>Arduino Uno R3 (Atmega328 - 組み立て済み)</td><td>Adafruit</td><td>50</td><td>ボード</td></tr><tr><td>ステッピング モーター</td><td>Adafruit</td><td>324</td><td>モーターとモーター シールド</td></tr><tr><td>イコール レッグ カプラー 1.6mm 1/16"</td> <td>VWR</td><td>CA11009-280</td><td>チューブ PT</td></tr><tr><td>/SIL 1/16" x1/8"</td> <td>VWR</td><td>16211-316</td><td>50フィート</td></tr><tr><td>PDMS</td> ダ<td>ウ コーニング</td><td>のケースSylgard 184 太陽電池カプセル化</td><td></td></tr><tr><td>アガロース、タイプ 1-A、低 EEO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0169-25G</td><td></td></tr><tr><td>PHD UltraTM</td><td>ハーバード 装置</td><td>703006</td><td>MicroFluidic ポンプ</td></tr><tr><td>牛角膜</td><td>カーギル、グエルフ/オン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soldidworks</td><td>ダッソー システムズ</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>3Dプリンティング</td><td>ウォータールー大学 - 3D プリント センター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖ツール</td><td>ファインサイエンスツール</td><td></td><td>一般的な解剖ツール</td></tr><tr><td>メディウム 199</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td></td><td>角膜用培地の保管</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td>培地に加える 総量3%</td></tr></tbody></table>

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;眼プラットフォームはコンタクトレンズをテストします

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

現在、薬物送達のためのコンタクトレンズ(CL)のin vitro評価は、通常、生理的な涙液量を模倣できない大容量のバイアル1-6で行われています。7 従来のモデルには、眼の環境を定義する要因である自然な涙流成分とまばたき反射も欠けています。この研究では、生理学的な涙液量を模倣できる独自の2ピースデザイン、眼球とまぶたのピースで構成される新しいモデルの開発について説明します。モデルは、3Dプリントされた金型(ポリテトラフルオロエチレンまたはテフロン金型)から作成され、ポリジメチルシロキサン(PDMS)や寒天などのさまざまなポリマーから眼のモデルを生成するために使用できます。外植されたヒトまたは動物の角膜またはヒトの角膜構築物の統合など、眼球のさらなる変更により、より複雑なin vitro眼科研究が可能になります。市販のマイクロ流体シリンジポンプがプラットフォームに統合されており、生理的な涙液分泌をエミュレートします。空気への曝露と機械的摩耗は、2つの機械式アクチュエータを使用して実現され、そのうちの1つはまぶたを横方向に動かし、もう1つは眼球接眼レンズを円状に動かします。このモデルは、CLへの薬物送達およびCLへの涙液成分の沈着についてCLを評価するために使用されています。

機械工場から3-D印刷から得られる合成目の鋳型は、 図1に示されている。これらの型は、所望の特性を有する接眼レンズを製造するために、例えば、アガロースPDMSとのようなポリマーの様々な使用することができます。マイクロ流体シリンジポンプと眼モデルプラットフォームの合図アセンブリは、図2に示されている。プラットフォームは、内とまぶた駒の動きうち横を通って眼球片の回転、空気暴露を介して機械的摩耗をシミュレートします。涙液は、所望の流量でマイクロ流体ポンプから瞼に注入され、フロースルー液を12ウェルプレートに回収することができます。 ウシレンズの切開、及びPDMSの接眼レンズに装着するための手順は、図3に示されている。過剰な組織を眼から分離し、廃棄し、除去しました結膜の。角膜の除去は、角膜輪部付近の強膜切開から始まる。 図4は、</strong...

コンタクトレンズ（のCL）および他の眼関連のアプリケーションを評価するための現在のin vitroモデルは厳しく制限されています。提示眼のプラットフォームは、生理的な涙の流れ、涙ボリューム、空気暴露と機械的摩耗をシミュレートします。このシステムは、非常に汎用性とのCLで分析インビトロで種々に適用することができます。

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

このin vitroアイモデルの全体的な目標は、生理的な涙液量、自然な涙液の流れ、空気への曝露、まばたき中に生じる機械的摩耗をシミュレートして、コンタクトレンズの性能を評価することです。この方法は、コンタクトレンズや眼に関連する眼科用デバイスの性能を予測するなど、コンタクトレンズ分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、現在利用できない複数の眼内因子をシミュレートするためのシンプルで費用対効果の高いin vitroモデルを提供することです。この方法は、コンタクトレンズの性能に関する洞察を提供するように設計されていますが、現在GoogleとNovartisが開発しているグルコーススマートコンタクトレンズなど、他の眼科システムのテストにも使用できます。この手法を視覚的に示せることは、アイモデルがどのように動作し、さまざまな研究シナリオでどのように効果的に使用できるかを理解するために重要です。モデルのまぶたと眼球のパーツはPDMSで作られています。まず、PDMSを準備します。シリンジを使用して、10ミリリットルのPDMSベースを15ミリリットルまたは50ミリリットルの遠心分離管に移します。次に、重量比10%の重量でエラストマー溶液を添加して秤量し、混合します。攪拌棒を使用して溶液をよく混合します。次に、PDMS溶液を眼球とまぶたの型に注ぎます。気泡が引っかからないように、型を慎重に満たします。PDMSを室温で一晩沈殿させ、その間に重合し、小さな気泡が金型から溶解します。翌日、型を摂氏75度に設定されたオーブンに1時間移します。次に、型をマイナス80°Cの冷凍庫に数分間入れます。PDMSは少し縮小します。次に、へらを使用してサンプルを型から放出します。次に、等脚カプラーにPTFEチューブをつなぎ、まぶたピースに取り付けます。このチューブは、サンプル間に流体を導入します。次に、アガロースまたは同様の寒天から眼球片を合成します。まず、溶液中に100ミリリットルの2%アガロースを作ります。溶液が摂氏約40度に冷めたら、眼球型に流し込みます。余分な寒天は、後で使用するために冷凍することができます。溶液を室温で30分間冷ましてから、へらで眼球片を取り除きます。微生物学研究では、眼球の型をオートクレーブまたはUV照射で滅菌します。フード内の換気を少なくとも10分間実行した後、70%エタノールアルコールで表面を消毒します。この手順は、無菌条件下で層流フード内のウシ角膜で実行します。収穫した直後に目を解剖します。オートクレーブ処理されたツールのみを使用し、ワークスペースの前端から4インチ以内に何も置かないでください。ウシの眼を0.5%ポビドンヨウ素溶液に2分間浸すことから、ウシの眼での作業を開始します。次に、ポビドンヨード溶液から目を取り除き、pH7.4のPBS

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、形態学、生理学、極性、および成人のネイティブ組織の蛋白質と遺伝子の発現パターンを示すことを人間の胎児の網膜色素上皮細胞（hfRPE）細胞の培養コンフルエントな単層のための再現可能な方法を提供する。この作品は、いくつかの眼疾患の動物モデルに拡張されています。...

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

このビデオは、眼の微小血管血管新生を研究するための脈絡膜発芽のex...

眼の微小血管増殖をex vivoで研究するための脈絡膜萌芽アッセイ

ここで説明されているのは、上皮組織の本来の微小環境における損傷応答のメカニズムを調査するために使用できる、臨床的に関連性のあるex vivo模擬白内障手術モデルの確立です。...

臨床的に関連の確立<em&gt;エクスビボ</emネイティブ微小環境における上皮創傷修復を調査するための&gt;モック白内障手術モデル

我々は、3次元再構成人間の角膜のような上皮（RHCE）組織モデルを利用した眼刺激性試験を開発しました。テストは、眼刺激性及び腐食性物質（GHSカテゴリー1と組み合わせた2）とラベル（GHSなしカテゴリ）を必要としないものとを区別することができます。...

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

ウシ角膜内皮細胞の初代培養は、角膜内皮間葉移行のメカニズムを調べるために使用しました。さらに、ラット角膜内皮cryoinjuryモデルは、in vivoで角膜内皮間葉移行を示すために使用されました。...

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

ここでは、腫瘍性角質症(BK)のエクスビボ病モデルとして、ネオジム:YAG(Nd:YAG)レーザーを用いて、デセメットの膜(DM)から角膜内皮細胞(CEC)を剥離するプロトコルを提示する。...

角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発

オープングローブの目の怪我は、農村部や軍事関連のシナリオで数日間治療を受けず、失明を引き起こします。治療は視力の損失を最小限に抑えるために必要とされる。ここでは、臓器文化のオープングローブ傷害モデルについて詳しく説明します。このモデルを用いて、これらの傷害を安定させる潜在的な治療は適切に評価することができる。...

オープングローブ損傷と治療性能を追跡するための前セグメント臓器培養プラットフォーム

このプロトコルペーパーはレンズの開発の間に蛋白質のその 場 機能そして表現を調査するための用具としてRCAS...

組換えRCAS(A)レトロウイルスのニワトリ胚水晶体へのマイクロインジェクション

この原稿では、初代水晶体上皮細胞(LEC)を培養するための詳細なビデオプロトコルの概要を説明し、白内障および後嚢混濁(PCO)の再現性を向上させ、研究を支援することを目的としています。レンズの解剖、LECの分離、バリデーションに関するステップバイステップの説明を提供し、特にこの分野の初心者にとって貴重なガイドとなります。...

マウス一次水晶体上皮細胞培養の最適化:トリプシン処理の包括的ガイド

眼状レンズが網膜に光を集中させる機能は、組織の透明度、生体力学、屈折率に依存します。本レビューでは、レンズの三次元構造を強調し、組織の恒常性を維持する複雑なメカニズムについて論じます。...

『哺乳類の眼レンズに焦点を当てる:発生、解剖学、生理学、透明性、生体力学、そして加齢に伴う課題』

学ぼう、コンタクトレンズ評価のためのインビトロ眼モデル構築法。涙液分泌、まばたきによる機械的摩耗、空気曝露をシミュレートし、眼科デバイスの性能予測と薬物放出試験に応用できます。

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