勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

この速度勾配遠心分離の全体的な目標は、細胞侵入中に侵入するウイルスが遭遇するエンドサイトーシス環境を模倣した条件下で、インフルエンザA型ウイルスのカプシドを分析することです。この方法は、弱酸性pHがカプシドの安定性に及ぼす特異的な影響など、インフルエンザA型ウイルスのカプシドが細胞侵入中にどのように分解するかに関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、定義された実験条件下でのインフルエンザA型ウイルスのコーティング解除プロセスの定量分析が可能になることです。

この方法は、インフルエンザA型ウイルスのコーティング解除がどのように開始されるかについての洞察を提供するだけでなく、関連するコーティング解除メカニズムを持つ他のエンベロープウイルスの研究にも適用できます。その手順を実演するのは、私の研究室の元学生であるFirat Neblogluです。テキストプロトコルに従ってストックバッファーと試薬を調製した後、試験する各pH条件について、9ミリリットルの1モル塩化ナトリウム、6ミリリットルの10%NP40、2.4ミリリットルの25Xプロテアーゼ阻害剤ストック、および9ミリリットルの二重蒸留水を混合して、界面活性剤バッファーマスターミックスを調製します。

次に、各pH条件について、マスターミックスの4.4ミリリットルを50ミリリットルの円錐管にピペットで移します。pH値が5.8を超える場合は、それぞれのpH調整された500ミリモルトリスストック溶液をチューブに0.6ミリリットル追加します。pH値が5.8以下の場合は、それぞれのpH調整済み500ミリモルMESストック溶液を0.6ミリリットル追加します。

300ミリモルの塩化ナトリウム、2Xプロテアーゼ阻害剤、60ミリモルのトリス、pH 7.4に調整した水、および二重蒸留水を含む5ミリリットルの緩衝液を作成します。これは、洗剤を含まない制御グラジエントバッファーとして機能します。次に、50%グリセロールストックの5ミリリットルを、洗剤含有および洗剤を含まない緩衝液混合物5ミリリットルに加えて、6つの異なる25%グリセロール溶液が得られます。

pHストリップを使用して、pH値を確認します。蒸留水と50%グリセロールストックを3〜7の比率で混合することにより、15%グリセロール溶液を調製します。5ミリリットルのシリンジと針を使用して、3ミリリットルの15%グリセロール溶液を6本の超透明遠心分離チューブに加えます。

各ステップの後に針を二重蒸留水で洗います。5ミリリットルの注射器と長い針を使用して、2つの層が混ざらないように注意しながら、15%グリセロール層の下に3.4ミリリットルの25%グリセロール溶液を慎重に注入します。.両方のレイヤー間のインターフェースがはっきりと見えます。

これを6つの条件すべてで繰り返して、それぞれのpH調整グリセロール溶液で試験します。次に、クラスIIバイオセーフティキャビネットで、インフルエンザAウイルスを含む1ミリリットルの清澄化希釈尿膜液を使用して、グリセロール勾配を穏やかに覆います。チューブをローターバケットに移し、対向するチューブのバランスを取り、予冷したSW-41超遠心ローターに慎重に配置します。

2100rpm、摂氏12度で150分間遠心分離します。遠心分離後、清潔なパスツールピペットと吸引器を使用して、両方のグリセロール層を慎重に除去します。次に、40 mLの1X non-Reducing LDSサンプルバッファーを使用して、ピペッティングを上下させてペレットを完全に再懸濁してから、サンプルを1.5 mLの微量遠心チューブに移します。

SDS-PAGEを実行するには、すべてのサンプルを摂氏95度で10分間加熱します。溶解したペレット20マイクロリットルをプレキャストグラジエントBis-Trisミニゲルにロードし、1X MOPS SDSランニングバッファーで200ボルトで1時間運転します。ゲルを固定液中で1時間インキュベートします。

水で1〜2回すすぎ、室温で穏やかに振とうしながら、十分な量のコロイド状クマシー溶液を含む15cmの細胞培養皿で一晩染色します。ゲルを二重蒸留水で脱ステインし、ゲルの背景が透明になるまで15〜20分ごとに液体を交換します。ゲルを摂氏4度の二重蒸留水に保管し、バンド定量のためにスキャンします。

最後に、ゲルを高分解能でスキャンし、市販のカスタムメイドソフトウェアを使用してタンパク質バンド強度を定量化します。それぞれのバンドに近い領域からバックグラウンド信号を減算し、その値を洗剤を含まない制御値に正規化します。本実験では、清澄化された尿膜液由来のX31をpH7.4〜5.0で速度勾配遠心分離を行い、SDS-PAGEで解析しました。

グラジエントに界面活性剤が存在しないと、無傷のビリオンは、クマシー染色ゲル中のHA、NP、およびM1を表すバンドの特徴的なパターンに反映されるようにペレット化されます。NP40を下部のグリセロール層に添加すると、HA、NA、M2などのウイルスエンベロープが可溶化され、超遠心分離中にウイルスコアのみがペレットに沈殿しました。pH 6.5 未満から開始すると、M1 はペレット画分から徐々に失われ、pH 5.8 から pH 5.4 の間の最小値に達します。

pH 5.8未満では、vRNPは解離し、ペレットから失われました。分析したタンパク質バンドから、M1 層の分解と vRNP バンドルの解離の 2 つの異なる pH 閾値(それぞれ pH 6.5 と pH 5.8)が明らかになりました。この手順を試みる際には、特定のインフルエンザAウイルス株または変異体によって、異なる分解特性が観察される場合があることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、電子顕微鏡などの他の方法を実行して、単離されたインフルエンザウイルスのカプシドの構造などの追加の洞察を得ることができます。