Name: 勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 学ぶ勾配遠心法によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解解析。pH条件を制御してエンドソーム環境を模擬し、ウイルス脱殻メカニズムを定量的に評価する手法です。他のエンベロープウイルス研究にも応用可能です。

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私たちは、試薬をご提供するため洋平山内とロベルタマンシーニに感謝します。 AHの研究室は、マリー・キュリー初期研修ネットワーク（ITN）、欧州研​​究会議（ERC）によると、スイス国立科学財団（Sinergia）によってサポートされていました。

緩衝液および原液の調製<ol><li> 80ミリリットルののddH 2 Oで390ミリグラムMES水和物および580mgのNaClを、470mgのトリス塩酸塩を溶解することによりMNT緩衝液（20mMのMES、30mMのトリスおよび100mMのNaCl）を準備pH7.4に緩衝液を調整し、のddH 2 Oで最終容量100mlにそれを持って来ます</li><li> 80ミリリットルのdH 2 O毎に9.76グラムのMES水和物を溶解することによって500mMのMES緩衝液の3つの同一の溶液を調製します。濃NaOHで滴定することにより、それぞれ、pHが5.8、5.4にバッファを調整し、5.0。 dH 2 Oで最終容量100mlに各バッファを持参</li><li> 80ミリリットルのdH 2 Oそれぞれに7.88グラムのトリス塩酸塩を溶解することにより、500 mMトリス緩衝液の2つの同一のソリューションを用意し、濃HClで滴定することにより、それぞれ、7.4および6.4にpHを調整します。 dH 2 Oで最終容量100mlにバッファを持参</li><li> dH 2 O中の50％グリセロール溶液を準備し、glycまでよくかき混ぜエロールは均一に混合されます。ガラス瓶にSteritopフィルタユニット（0.22μmの孔サイズ）を通して溶液をフィルタリングします。 </li><li> 10％NP-40ソリューションとのdH 2 O中1MのNaClを準備</li><li> ddH 2 O 4ミリリットル中に2個の錠剤を溶解することにより25倍濃縮されたプロテアーゼ阻害剤を準備</li></ol>グリセロール勾配の調製<ol><li> 5ミリリットルの洗剤バッファマスターミックス準備（pHは7.4、6.4、5.8、5.4、および5.0）のテストに各pH条件の溶液（300mMのNaCl、2％NP-40を、2倍は、プロテアーゼ阻害剤を濃縮します）。この目的のために、1MのNaClの9ミリリットル、10％NP-40の6ミリリットル、25×プロテアーゼ阻害剤の株式の2.4ミリリットル、及び9ミリリットルののddH 2 0を混ぜます。 </li><li>各pH条件ピペット用の50mlコニカルチューブにマスターミックス4.4 mlです。 </li><li> 5.8以上のpH値についてチューブにそれぞれのpH調整500 mMトリスストック溶液の0.6ミリリットルを追加します。 pHが5.8と低いために、それぞれのpH調整の500mM MESストック溶液の0.6ミリリットルを追加します。 </li><li> 5を作ります300mMのNaClを含む緩衝液、2×プロテアーゼ阻害剤、pHが7.4とのddH 2 Oに調整し、60mMのトリスミリリットルこれは、界面活性剤を含まない対照勾配バッファとして機能します。 </li><li>必要に応じて、それぞれ、濃HCl又はNaOHソリューションを追加することにより、pHが7.4、6.4、5.8、5.4、および5.0に溶液のpHを微調整します。 </li><li> 6別の25％グリセロール溶液が得られる界面活性剤含有および界面活性剤を含まない緩衝液の混合物の5ミリリットルに50％のグリセロールストックの5ミリリットルを追加します。 pH指示薬ストリップを用いてpH値を確認します。 注：測定したpHが所望の値と大きく異なる場合は、それぞれの溶液を再度準備する必要があります。 </li><li> 7比：3でのdH 2 Oで50％のグリセロールストックを混合することにより、15％グリセロール溶液を準備します。 </li></ol> IAVの3超遠心<ol><li> 5ミリリットルの注射器や旧姓を使用することにより（13.2ミリリットル、X 89ミリメートル14ミリメートル）の超クリアな遠心チューブに3ミリリットル15％グリセロール溶液を追加DLE（9 cmの長さ21 G、）。これは勾配の整合性を乱す可能性があるとして、管の内壁に水滴を残さないでください。 6遠心分離管、テストに5 pH条件ごとに1つの対照試料のための1つの合計のためにこれを繰り返します。 </li><li>注意深く5mLの注射器と長い針を使用して、15％のグリセロール層の下に3.4 mlの25％グリセロール溶液を置きます。二つの層を混在させないように注意してください。それぞれのpH調整グリセロール溶液でテストするために、すべての6つの条件のためにこれを繰り返します。 注：以下の手順については、クラスII安全キャビネットで作業。 </li><li>静かに1ミリリットルMNT緩衝液で希釈IAV（X31、H3N2）を含む尿膜液を明らかにした30μlのグリセロール勾配を重ねるごとグラデーションの（周り20-30μgの総ウイルスタンパク質のに相当します）。 </li><li>バランスチューブに反対し、SW41超遠心ローターに入れます。 55,000×gで、150分間遠心し、12°C。 </li><li>遠心分離した後、慎重にきれいなパスツールピペットや吸引器を使用して上清を除去し、 すなわち 、両方のグリセロール層。 40μL（1×）非還元LDSサンプル緩衝液中にペレットを再懸濁します。完全にペレットを溶解するには、上下に数回ピペッティングすることが重要です。 1.5ミリリットルのマイクロチューブにサンプルを移します。 </li></ol> 4. SDS-PAGEペレット画分のクマシー染色<ol><li> 10分間95℃ですべてのサンプルを加熱します。これらはSDS-PAGEによって分析されるまで、この時点で、サンプルは-20℃で保存することができます。 </li><li>負荷溶解ペレット20μlのプレキャスト勾配（4から12パーセント）ビス - トリスミニゲル上に、バッファを実行している1×MOPS SDSで200 Vで1時間実行します。 </li><li> ddH 2 O中の40％メタノールおよび10％氷酢酸固定液を作ります</li><li>コロイド状クーマシー液の十分な量で一晩15cmの細胞培養皿に1時間と染色のための固定液中でゲルをインキュベートしながらそっと室温で振とう。 注：これは、染色溶液の蒸発を回避するために、皿を閉鎖することが重要です。 </li><li> ddH 2 O中でゲル脱色ゲルの背景が透明になるまでのddH 2 Oごとに15〜20分を交換してください。それはバンドの定量化のためにスキャンされるまで4℃でのddH 2 Oでゲルを保管してください。 </li><li>高解像度でゲルをスキャンし、タンパク質バンド強度の定量化のために市販されているか、またはカスタムメイドのソフトウェアを使用しています。各バンドに近い領域からバックグラウンド信号を減算し、界面活性剤を含まない対照試料（pH7.4で）にこれらの値を正規化します。 </li></ol>

<ol><li>Taubenberger, J. K., Kash, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+Virus+Evolution%2C+Host+Adaptation%2C+and+Pandemic+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+%26+microbe%22%5BJournal%5D)">Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation.</a> Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ウイルスキャプシドは、準安定巨大分子複合体です。ビリオンのアセンブリは、ウイルスゲノムのキャプシド形成及び縮合を必要とするが、感染の次のラウンドの開始は、このコンパクトなキャプシド構造の分解に依存します。ウイルスは、細胞受容体、シャペロン、タンパク質分解酵素、モータータンパク質またはヘリカーゼ、ならびにpHおよびイオンスイッチ26,27により提供される物理的な力を含むコーティング-脱殻サイクルを制御するために、様々な細胞機構を利用するために進化してきました。ここでは、特にIAVコアの分解を促進因子の効果をテストするために、グリセロール勾配遠心分離に基づいて、in vitroでのアプローチについて説明します。技術は、潜在的には他のエンベロープウイルスの脱殻のプロセスを解剖するために適合させることができます。 コロイド状クーマシーを使用して、主要な構造IAVタンパク質M1、NPおよびHAは明らかに比較的小さなウイルス気難しいとSDS-PAGEで検出することができますル数。しかし、より詳細な沈降キャプシド構造の特徴付けおよびフォローアップを必要とす...

インフルエンザAウイルス（IAV）はエンベロープウイルスであり、 オルトミクソウイルス科に属します。その遺伝子は、セグメント化ネガティブセンス一本鎖RNAゲノム上にコードされています。ヒトでは、IAVは、季節の集団発生で発生する呼吸器感染症を引き起こし、世界的なパンデミック1の可能性を負いません。宿主細胞表面2上のシアル酸残基に結合すると、IAVは、クラスリン依存性エンドサイトーシスとクラスリン依存性経路3-8によって内在化されます。エンドサイトーシス液胞における酸性環境（pH値&lt;5.5）は、ウイルスの融合および後期エンドソーム膜9の結果IAVスパイク糖タンパク質ヘマグルチニン（HA）、の主要なコンフォメーション変化を誘発します。サイトO - IAVキャプシドは、（ここではまた、ウイルス「コア」と呼ばれる）後期エンドソーム（LE）をから脱出した後、これを核に、ウイルスリボ（vRNPs）の輸送に続いて細胞質ゾルでコーティングされていませんFウイルスの複製および転写10-13。 HAの酸活性化の前に、ウイルスはその後の解体14-16のためのコアをプライムエンドサイトーシスシステム、内pHの漸減を経験します。この「プライミング」で陽子とK +10,14,16の流入を媒介するウイルス膜中のM2イオンチャネルをステップ。ウイルス内部のイオン濃度の変化は、相互作用がウイルスのマトリックスタンパク質M1と8 vRNPバンドルによって構築の妨げとなり、膜融合10,14-17以下の細胞質にIAVの脱殻を促進します。 プライミング工程の直接的かつ定量的な分析がエンドソームを実験的にアクセスすることが困難であるという事実によって妨げられてきました。エントリー方法は、さらに、非常に非同期です。また、このような放出されたウイルスRNAまたは感染力の測定値の定量RT-PCRのようなエンドポイントアッセイは、ウイルスcapsiの生化学的状態についての詳細な画像を提供していません。エントリの任意の段階で、D。 siRNAまたは薬物治療によってエンドソームの摂動が大幅IAVエントリ18-20の理解に貢献してきましたが、微調整が厳密に制御されたエンドソームの成熟プログラムで非特異的な副作用に困難となりやすいです。 これらの問題を回避するために、我々は速度勾配遠心分離17の使用に基づいて、以前に開発されたin vitroでのプロトコルを適応しています。主にタンパク質分解切断およびEM分析続く界面活性剤処理の組み合わせに基づいていた他の試み21,22、23,24、とは対照的に、このアプローチは、容易に定量化可能な結果を可能にしました。異なる傾斜層を介して遠心分離沈降粒子がに露出されることを可能にし、制御された方法で変化する条件に反応します。提示されたプロトコルでは、IAV清澄尿膜腔液または精製されたウイルス粒子に由来する二層グリセロール中に沈殿さ底部層は、非イオン性界面活性剤NP-40（ 図1）を含有する勾配。ウイルスは二、界面活性剤含有層に入ると、ウ​​イルスの脂質エンベロープおよびエンベロープ糖タンパク質は、静かに可溶化し、残されています。コアは、8 vRNPバンドルで構成され、ペレット画分に安定な構造としてマトリックス層、堆積物に囲まれています。例えばM1およびvRNP関連核タンパク質（NP）、ウイルスコアタンパク質は、SDS-PAGEおよびクマシー染色によってペレットに同定することができます。具体的には、市販の勾配ゲルを利用して高感度コロイド状クーマシー25で染色し、高精度及びウイルスコア関連タンパク質であっても、少量の検出を可能にします。 これは、pH、塩濃度、および推定脱殻因子コア成分及びコアSTABILの沈降挙動に影響を与えるように異なる条件かどうかを試験するための基準を設定します<html>性。この目的のために、グリセロール勾配だけ低く、界面活性剤含有層は、目的の因子または条件を導入することによって改変されます。技術は、IAVコア16の完全に異なるpH値および塩濃度の効果を調査する際に特に貴重でした。 IAVの脱殻の中間ステップは、pHが5.5と低い16,17（ 図1）でvRNP解離に続いて、弱酸性のpH（&lt;6.5）で、マトリクス層の解離を含む監視することができます。後者のステップは、さらに後期エンドサイトーシス環境16を反映し 、グリセロール層中の高K +濃度の存在によって増強されました。したがって、ウイルスおよび勾配を通って沈降コアとして、彼らはそのエンドソームにおける模倣条件変更環境を経験しました。結果は、細胞生物学アッセイから得られた結果を補完し、in vitroでのウイルスコアの段階的分解しました。 tは&quot;&gt;ここで紹介する方法は、高速で有効になっているとIAV（X31およびA / WSN / 33）と、IBV（B /リー/ 40）の再現性の高い分析は、酸性pHによってトリガーされ、K +16,17だけでなく、分解を増加させること脱殻アルカリ性のpH暴露17時のパラミクソウイルスのコアの。アプローチが細胞侵入時にウイルスキャプシド構造およびキャプシド解体の生化学的性質への洞察を得るために、他のエンベロープウイルスに適合させることができると考えられます。

<table><tbody><tr><td>、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11873580001</td><td>ストック溶液は2〜8°Cで保存できます。C 1〜2週間</td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>メルクミリポア</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>無水グリセロール BioChemica</td><td>AppliChem</td><td>A1123</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>メルクミリポア</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>ロング注射針 (21&nbsp;G、9 cm、斜角または鈍い端)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I8896</td><td>IGEPAL&reg;CA-630</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris ミニゲル、10&nbsp;ウェル、1.0 mm</td><td>Life Technologies</td><td>NP0321</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS サンプルバッファー (4x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS ランニングバッファー (20x)</td><td>Life Technologies</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>pH インジケーターストリップ、pH 4.0-7.0</td><td>Merck Millipore</td><td>109542</td><td></td></tr><tr><td>QC Colloidal Coomassie Stain</td><td>BIO RAD</td><td>1610803</td><td></td></tr><tr><td>Sodium塩化物</td><td>メルク ミリポア</td><td>106406</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>メルク ミリポア</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>ステリトップ フィルターユニット</td><td>メルク ミリポア</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti、超遠心ローターセット</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>薄壁、超透明遠心チューブ、13.2&nbsp;ml、14 mm x 89 mm</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩酸塩&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A1087</td><td></td></tr><tr><td>X31インフルエンザAウイルス(H3N2)、卵子成長、清澄尿</td><td>Virapur</td><td></td><td>4°Cで新たに解凍。ハ</td></tr></tbody></table>

勾配遠心によるインフルエンザaウイルスキャプシドのインビトロ分解で

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

酸によって引き起こされる分子プロセスは、エンドサイトーシスシステムを通じて侵入する多くのウイルスの細胞侵入を密接に制御します。インフルエンザA型ウイルス(IAV)の場合、エンドソーム膜とのウイルス融合と、それに続くウイルスカプシドの分解(アンコーティング)は、エンドサイトーシス小胞内のイオン条件によって支配されます。ウイルスのライフサイクルの初期段階は、エンドソームに直接実験的にアクセスすることができないため、研究が難しく、in vitroアプローチの必要性が生じています。ここでは、IAVコアとその安定性の分析を可能にする、2層のグリセロールグラジエントによる精製ビリオンの速度勾配遠心分離に基づく方法について説明します。グラジエントは、ウイルスが底に向かって沈殿するときに可溶化することによりウイルス膜を除去するために、その下層に非イオン性界面活性剤(NP-40)を含んでいます。中性pHでは、ウイルスコアは安定な構造としてペレット化されます。主要なコア成分であるマトリックスタンパク質(M1)とウイルスリボ核タンパク質(vRNP)は、SDS-PAGEによってペレット画分で明確に同定できます。最下層でpHを6.0以下に下げると、ペレットからM1が選択的に除去され、続いてより酸性の条件下でvRNPが放出されます。Coomassie染色ゲル上のウイルスタンパク質バンドは、IAV分解の中間状態をモニターするために、デンシトメトリー定量にかけることができます。pH以外にも、塩分濃度や推定されるウイルスのコーティング解除因子など、ウイルスコアの安定性に影響を与える他の要因を、洗剤含有グリセロール層を適宜変更するだけで評価できます。まとめると、提示された技術は、in vitroでのウイルスコーティング解除の再現性の高い定量的な分析を可能にします。これは、複雑なコーティング解除プロセスを経る他のエンベロープウイルスに適用できます。

既に論じたように、エンドソーム内のプライミングコンピ脱殻IAVコアをレンダリングするために必要とされます。コアのプロトンは、（ウイルスRNA、NP、およびポリメラーゼ複雑PB1 / PB2 / PAから成る）M1とvRNPsの相互作用を弱めます。入ってくるウイルスは初期エンドソーム（のEE）6.5（またはそれ以下）のpHに露出してのLEでpH約5.0でのウイルスのヒューズまで継続されると、このプロセスが開始されます。 pH値の減少を模倣するために、グリセロール勾配の最下層は、一定の塩濃度でpHを7.4と5.0の間の値に調整しました。清澄尿膜腔液から誘導X31は、速度勾配遠心分離にかけ、SDS-PAGE（ 図2A、B）で分析しました。の特徴的なパターンに反映されるように勾配（ 図2A、レーン1）に存在する洗剤なしで無傷のビリオンは、ペレット化されていま...

宿主細胞へのウイルス侵入中のインフルエンザAウイルスコアの分解は、多段階のプロセスです。ここでは、ウイルスのコーティング解除の初期段階をin vitroで解析する方法について説明します。このアプローチでは、速度勾配遠心分離を使用して、定義された条件下でコーティング解除を開始するステップを生化学的に分析します。

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

この速度勾配遠心法の全体的な目的は、細胞進入時にウイルスが直面するエンドサイトーシス環境を模倣した条件下で、インフルエンザAウイルスキャプシドを分析することです。この手法は、軽度の酸性pHがキャプシドの安定性に及ぼす特異的な影響など、細胞進入中にインフルエンザAウイルスキャプシドがどのように解体されるかという重要な疑問を解明するのに役立ちます。この技術の主な利点は、定義された実験条件下でインフルエンザAウイルスの脱殻プロセスの定量的な分析が可能になることです。この手法は、インフルエンザAウイルスの脱殻がどのように開始されるかについての知見を提供すると同時に、関連する脱殻機構を持つ他のエンベロープウイルスの研究にも適用できます。本手順の実演は、私の研究室の元学生であるFirat Neblogluが行います。テキストプロトコルに従ってストックバッファーと試薬を調製した後、テストする各pH条件について、1 Mの塩化ナトリウム 9 mL、10% NP40 6 mL、25Xプロテアーゼ阻害剤ストック 2.4 mL、および二回蒸留水 9 mLを混ぜ合わせて、界面活性剤バッファーマスターミックスを調製します。次に、各pH条件について、マスターミックス4.4 millilitersを50 milliliterコニカルチューブにピペットで分注します。pHが5.8より高い場合は、それぞれのpH調整済み500 milliMolar Trisストック溶液を0.6 millilitersチューブに加えます。pHが5.8以下の場合は、それぞれのpH調整済み500 milliMolar MESストック溶液を0.6 milliliters加えます。300 mM 塩化ナトリウム、2X プロテアーゼ阻害剤、60 mM Trisを含み、pH 7.4に調整した二回蒸留水を用いて、バッファー溶液を5 mL調製します。これを界面活性剤を含まないコントロールグラジエントバッファーとして使用します。次に、界面活性剤含有および界面活性剤非含有の各バッファー混合液5 mLに、50%グリセロールストック溶液を5 mLずつ加え、6種類の異なる25%グリセロール溶液を作成します。pH試験紙を使用してpH値を確認します。50%グリセロールストック溶液と蒸留水を3:7の比率で混合し、15%グリセロール溶液を調製します。5 mLシリンジと針を用い、6本のウルトラクリア遠心チューブに15%グリセロール溶液を3 mLずつ加えます。各ステップの後に、針を二回蒸留水で洗浄します。5 mLシリンジと長い針を用い、2層が混ざらないように注意しながら、15% glycerol層の下に3.4 mLの25% glycerol溶液を慎重に注入します。両層の間の界面がはっきりと確認できます。それぞれのpH調整済みグリセロール溶液を用いて、テストする全6条件についてこの操作を繰り返します。次に、クラスIIバイオセーフティキャビネット内で、インフルエンザAウイルスを含む清澄化・希釈済みの尿膜液1 mLを用いて、グリセロール勾配の上層を慎重に覆います。チューブをローターバケットに移し、対向するチューブの重量バランスを合わせた後、あらかじめ冷却したSW-41超遠心機ローターに注意深くセットします。2100 rpm、12 °Cで150分間遠心分離します。遠心分離後、清潔なパステールピペットとアスピレーターを用いて、グリセロール層を2層とも慎重に取り除きます。次に、40 mLの1X非還元LDSサンプルバッファーを加え、ピペッティングでペレットを完全に再懸濁させてから、サンプルを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。SDS-PAGEを行うには、すべてのサンプルを95 °Cで10分間加熱します。溶解したペレット20 µLをプリキャストグラジエントBis-Trisミニゲルにロードし、1X MOPS SDSランニングバッファー中で200 Vで1時間泳動します。その後、ゲルを固定液中で1時間インキュベートします。水で1〜2回洗浄し、15 cmの細胞培養ディッシュ内で十分な量のコロイドCoomassie溶液に浸し、室温で緩やかに振盪しながら一晩染色します。二回蒸留水で脱色し、ゲルの背景が透明になるまで15〜20分ごとに液を交換します。バンドの定量のためにスキャンを行うまで、ゲルを二回蒸留水に入れ4 °Cで保存します。最後に、ゲルを高解像度でスキャンし、市販のカスタムソフトウェアを用いてタンパク質バンドの強度を定量します。各バンドに近い領域のバックグラウンド信号を差し引き、値を界面活性剤不含のコントロール値で正規化します。本実験では、精製した尿囊液由来のX31をpH 7.4から5.0の範囲で速度勾配遠心分離にかけ、SDS-PAGEで分析しました。勾配中に界面活性剤が存在しない場合、完全なビリオンがペレット化され、クマシー染色ゲルにおいてHA、NP、およびM1を示す特徴的なバンドパターンとして現れます。底部グリセロール層にNP40を添加すると、HA、NA、およびM2を含むウイルスエンベロープが可溶化され、超遠心分離中にウイルスコアのみがペレットへと沈降しました。pH 6.5以下から、M1はペレット画分から徐々に消失し、pH 5.8からpH 5.4の間で最小値に達します。pH 5.8以下では、vRNPが解離し、その結果ペレットから消失しました。解析したタンパク質バンドから、M1層の分解とvRNP束の解離に関する2つの明確なpH閾値が明らかになり、それぞれpH 6.5およびpH 5.8でした。この手順を行う際は、インフルエンザAウイルス株や変異株によって、異なる分解特性が観察される可能性があることに留意することが重要です。本手順に続いて、電子顕微鏡法などの他の手法を用いることで、単離したインフルエンザウイルスキャプシドの構造など、さらなる知見を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

インフルエンザウイルスのゲノムは、RNAとタンパク質の8つの独立した複合体と呼ばれる、ウイルスのリボ核タンパク質複合体（vRNPs）で構成されています。本論文では、グリセロール勾配精製とインフルエンザvRNPsの透過型電子顕微鏡の可視化について説明します。...

インフルエンザウイルスリボ核タンパク質複合体の精製と可視化

我々は、感染細胞から高純度のヘルペスウイルスヌクレオカプシドDNAを単離するプロセスを説明します。ソリューションから取り込んだ最終的なDNAは、それが理想的にハイスループットシーケンシング、高忠実度PCR反応、および新たなウイルスの組換え体を生産するトランスフェクションに最適です、高濃度および純度である。...

ヌクレオカプシドからウイルスDNAの調製

脱殻は、HIV - 1のライフサイクルの初期段階に必須の工程であるとカプシド殻の分解とウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNP）のリリースとして定義されています。ここで、我々はHIV -...

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

を経由して植物細胞に複数のウイルス成分の配信を同期化する、シンプルで効率的かつ強力な方法...

シンプルで堅牢な<emin vivoでの>と in vitroで</emウイルスの組み立てを学ぶための>アプローチ

インフルエンザウイルスは、宿主細胞のクロマチンに関連して、そのRNAゲノムを複製します。ここでは、感染細胞のクロマチンから無傷のウイルスのリボ核タンパク質複合体を精製する手法を提案する。ウイルスの複合体を精製し、それぞれウェスタンブロット、タンパク質およびRNA含量のプライマー伸長の両方で解析することができます。...

感染細胞のクロマチンからのインフルエンザウイルスのリボ核タンパク質複合体のアフィニティ精製

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

In Vitro Disassembly of the Influenza A Virus Core Using pH-Controlled Gradient Centrifugation

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Visualizing the Effect of pH on Solubilization of the Influenza A Viral Core

ウイルス遺伝子増幅を利用したルーチンの検出方法は、非感染性粒子から感染を区別する無力によって制限されます。この資料の目的は、アプタマー...

代替体外ウイルスのカプシド構造健全性の定量方法

組換えレトロ ウイルス ・ ウイルス DNA の両端を模倣した DNA オリゴマー、インタソームと呼ばれる酵素によって実行中の複合体を形成できます。Intasomes は、生化学、構造、および速度論的研究に使えます。このプロトコルは、組み立てるし、プロトタイプ フォーミー ウイルス intasomes...

アセンブリおよびプロトタイプ フォーミー ウイルス Intasomes の精製

アデノ随伴ウイルスは浮遊細胞培養で産生され、二重ヨージキサノール密度勾配遠心分離によって精製されます。ウイルスの総収量を増やし、ウイルス沈殿のリスクを低減し、最終的なウイルス生成物をさらに濃縮するためのステップが含まれています。予想される最終力価は10,12 ウイルス粒子/mLに達し、前臨床 in vivo...

In vivoアプリケーションのためのヨジキサノール密度勾配遠心分離によるアデノ随伴ウイルスの浮遊培養産生と精製

遺伝子治療の分野が進化し続ける中、これらの課題に対処できる革新的な方法の必要性が高まっています。ここでは、細胞工場プラットフォームを使用して高収量で高純度のAAVベクターを生成するプロセスを効率化し、 in vivo...

Cell Factory Platformを利用した高力価で高品質なアデノ随伴ウイルスベクターを生成するための合理化および標準化された手順

学ぶ勾配遠心法によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解解析。pH条件を制御してエンドソーム環境を模擬し、ウイルス脱殻メカニズムを定量的に評価する手法です。他のエンベロープウイルス研究にも応用可能です。

勾配遠心によるインフルエンザAウイルスキャプシドのインビトロ分解で

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