Name: 誘導気道のパターニング時にWntシグナル伝達を学びます (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: 学ぶWntシグナル伝達の役割を気道パターニングにおける遺伝子改変マウスモデルを用いた染色法で。気管軟骨形成や間葉凝縮の細胞プロセスを詳細に可視化し、肺発生生物学の研究に有用です。

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私たちは、組織学的手順で共焦点イメージングとゲイルマッケとマイクMuntiferingとマットKofronの支援を認めます。この作品は、部分的に健康NHLBI（DSへK01HL115447）の国立研究所によってサポートされていました。

動物を無菌条件下で飼育しました。マウスはCCHMC施設内動物管理使用委員会（オハイオ州シンシナティUSA）によって承認されたプロトコルに従って取り扱われました。これらの研究を通して利用したマウスは混合バックグラウンドで維持しました。 1.ホールマウントX-ガラクトシダーゼ染色<ol><li> CO 2吸入によって、E14.5にE11.5で妊娠中の女性を安楽死させます。 、CO 2室で動物を置き、CO 2でチャンバーを充電。 5分間の最低室で動物を維持します。頚椎脱臼により安楽死の二次方法を実行します。 </li><li>エタノール（エタノール）70％と、単一の腹部正中切開で開腹術を行うときれいな腹部領域。手術用ハサミと標準パターン（ストレート鋸歯状）鉗子を利用します。 </li><li>鉗子と細かいハサミを使用して子宮角を分離し、直ちに冷却したPBS溶液を含むペトリ皿に組織を配置します。先に進むまで氷上で組織を維持胚を単離します。 </li><li>子宮角から胚を分離します。解剖顕微鏡を使用して、胚気管肺組織を分析。胚を放出子宮組織とconceptiを保持し、穿刺する先端の細いピンセットやハサミを使用しています。 <ol><li>残りの胚膜を削除します。針刃の支援を受けて胚および横隔膜下の下半身部分の頭をカット。ランドマークとして、肝臓の位置を確認します。 </li><li>胚の胸部の単離後、針の刃を使用して、体壁、脊椎、心臓の側面を除去するために進んでください。気管組織を傷つける避けるために心を除去しながら注意してください。最後に、慎重に、針の刃の支援を受けて食道を引いて、気管から食道を分離します。氷上のPBS溶液中で組織を維持します。 </li></ol></li><li> 4ミリリットル中に組織を置き、ガラスを使用して、キャップバイアルまたは転送ピペットをねじ込みます。 30分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で気管肺組織を修正しました。固定後、PBSで組織をすすぎます。すすぎながら、X-gal染色溶液（5mMのK 3のFe（CNを追加）6を、（100μlの0.5 Mストック）5 mMのK 4のFe（CN）6（100μlの0.5 Mストック）2のMgCl 2、（準備20μlの1 Mストック）0.01％NaDOC（50μlの2％ストック）、0.02％NP 4 O（100μlの2％ストック）、1mg / mlのX-galを（20 mg / mlでストック500μlの）および9.13ミリリットル10mlの最終容量）をもたらすために蒸留水。 </li><li>残りのPBSを削除し、ガラスバイアルにX-gal染色溶液の2ミリリットルを追加します。シェーカー上トレイにバイアルを置きます。 X-gal染色溶液で染色組織1~2時間。さらに処理および埋め込みのために4時間のX-gal溶液中で組織をインキュベートします。 </li><li> 3％のジメチルスルホキシド-PBSで組織を洗浄することによって反応を停止させます。 5分間、PBS中の70％エタノール中で各洗浄や店舗を3回すすいでください。 </li><li> 1％アガロース/ PBS溶液でペトリ皿を埋めます。アガロース固化することを可能にします。ガラス転移ピペットを用いて、アガロース共同で組織を配置PBS溶液で満たされたatedプレート。解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。明のための適切なフィルタを選択します。 </li><li>優れたパラフィン包埋し、切片用のX-gal染色処理サンプルのサイトを区別するために。細かい画面カセットでサンプルを置きます。 <ol><li>自動化されたプロセッサを使用するパラフィン包埋のためにサンプルを処理し、次のように短い周期を設定するには：アルコールの6変更：5分最初の変更及び残りの各変化当たり3分。キシレンの三つの変化：5分最初の変更と3分次の二つの変更。前の手順は、30℃で実施されています。 25分、8分および5分：最後に、62℃におけるパラフィンの3変更を行います。 </li></ol></li><li>ボートを埋め込むの底に平らに横たわっている組織で埋め込むための東洋サンプル。慎重に埋め込むボートを埋めるためにパラフィンを追加します。パラフィンが凝固するまで駅を埋め込むのコールドプレートにすぐに冷却します。ボートを埋め込むからブロックを削除してください。ミクロトームを用いて、6ミクロンのを生成ections。スライド上の前処理し、スライドやドライスライド上のマウント部1時間42℃で暖かいセット。 </li><li>焼く56ºCのオーブンで一晩スライドします。ラックにスライドを置きます。脱パラフィンは、100％キシレンの3変化、10分ごとにスライドします。キシレンの200ミリリットルで満たされた皿を染色に使用します。 </li><li> 10〜30秒間核ファーストレッドで対比染色する前にPBSに段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％及び30％、工程ごとに1分間）を用いてスライドを再水和します。水道水で5分間の核ファストレッドの過剰を削除するたびに3回スライドを洗浄します。 </li><li>キシレンベースの取り付けメディアで滑る3キシレンの変化（20ディップそれぞれ変化する）と、カバー中で洗浄する前に段階的エタノールシリーズ（50％、70％および100％エタノール）でスライドを脱水。 </li></ol> 2.レクチン染色<ol><li>ステップ1.4から1.1に記載されているようにE13.5とE14.5の気管肺組織を解剖。ガラス転送ピペットを使用すると、スクリューキャップバイアルに組織を配置します。 2mlで気管肺組織を修正しました。4℃で2％PFA溶液を一晩。固定後、PBSで10分間ずつ洗浄するための三回の試料をすすぎます。 </li><li>緩衝溶液の10mlを、通常、最終容積を遮断準備します。 8mlのPBSにBSA（1％）の0.1グラムを追加します。 BSAが溶解することを可能にします。ヤギ血清（2％）トリトンX-100（0.3％）の0.03ミリリットルの0.2ミリリットルを追加します。 PBSで10ミリリットルに最終容量を持参。室温でブロッキング緩衝液の0.5ミリリットルで1時間ブロックサンプル。 </li><li>トランスファーピペットを使用して、ブロッキング緩衝液を除去し、レクチンのを50μg/μlの、10％ヤギ血清およびPBSで構成されるレクチン溶液と交換してください。サンプルあたりのレクチン溶液の250μlのを使用してください。 4℃で一晩インキュベートします。アルミホイルで組織を含有するガラスバイアルをカバーすることを確認します。レクチン溶液とインキュベートした後、10分間、PBS中で3回のサンプルをリンス。 </li><li>サンプルをカバーするのに十分なPBSを含むアガロースコーティングされたペトリ皿に入れ植。蛍光解剖顕微鏡を使用して全体のマウントを撮影。 appropを選択riateフィルタは、蛍光を検出します。レクチンPNAは通常、GFPに結合されています。 </li></ol> 3.ホールマウント免疫染色および共焦点顕微鏡<ol><li> 4ミリリットルガラススクリューキャップバイアルに移し、4％PFAで一晩固定し、気管肺組織を分離します。 E11.5組織を2％PFAで固定することができます。メタノール中の100％を保管してください。サンプルは-20℃で数ヶ月まで保存することができます。 </li><li>トランスファーピペットを用いてメタノールを除去し、2時間デントのブリーチ（4部メタノール、1部のDMSOと1部の30％H 2 O 2）を用いて試料を透過。次のようにPBSで希釈したメタノールの段階的シリーズの水和物組織：100％メタノール、75％メタノール、50％メタノール、25％メタノール、100％PBS。水和の各ステップ中、室温で10分間インキュベートします。 </li><li> PBSで希釈した0.5％ブロッキング試薬でブロック組織攪拌しながら室温で2時間（詳細は材料を参照されたいです）。 </li><li>ブロッキング、一次抗体を希釈溶液（Sox9を1：100、Nkx2.1 1：200、αSMA1：250）と4℃で一晩サンプルをインキュベートします。室温でPBSでサンプルを5回洗浄。 1時間ごとの洗浄を行います。 </li><li> 0.5％のブロッキング溶液中で1：500希釈で二次抗体を適用します。二次抗体の間で結合を防止するために二次抗体を慎重に選択します。暗い部屋で4℃で一晩インキュベートします。洗浄サンプルを室温で20分間3回洗浄しました。 25％メタノール、50％メタノール75％メタノール、100％メタノール、10分で各工程を以下のようにPBSで希釈したメタノールの段階的な系列でサンプルを脱水します。 注：サンプルはアルミホイルで覆い、光への曝露を最小限に抑えるたままであることを確認してください。撮影されるまで、組織は現在、数週間4℃で保存することができます。 </li><li>カスタムメイドへの転送サンプルステージプレートは、マレーの透明な溶液19,20（2部安息香酸ベンジル、1部ベンジルアルコール）、直ちにBEFの約200μlのメタノールとクリアを削除します鉱石イメージング。共焦点顕微鏡を用いて写真。プロセスおよびイメージングソフトウェアを用いて画像を解析します。 </li></ol> 4.細胞増殖<ol><li>体重を100μgのBrdU / gの濃度でのBrdUの溶液で腹腔内E11.5妊娠マウスに注入します。 E12.5またはE13.5で胚を、プロトコルのセクション1で説明し、単離のように女性を生け贄に捧げます。ナイフの刃、消費税ヘッドや胸腔下の下半身を使用。 </li><li> 4ミリリットルキャップバイアルをねじで胸部組織を置き、一晩4％PFAの1ミリリットルで固定します。 5分間のPBSで2回洗浄サンプルを、以下のように70％エタノールを蒸留水までで希釈したエタノールの一連のサンプルを脱水：30％、50％および70％エタノールを、5分間、各ステップは。 <ol><li>ミディアムサイズの画面カセットに入れサンプル。プロセッサを使用し、自動化されたパラフィン包埋のためのプロセスの組織。 8分間、アルコールの6変化、6分間、キシレンの3変化、3つのCを次のように周期を設定します25分、9分と8分間のパラフィンのhanges、。 </li></ol></li><li>スライド上のセクション1.セクションで説明したように6ミクロンの横方向または縦方向のセクションを生成し、組織が1時間42℃でスライドウォーマーセットにスライドするように付着することを可能にする所望の位置に組織を配向パラフィンに埋め込みます。 </li><li>一晩56℃のオーブンでその両側にスライドし、焼きます。プラスチック製のラックにスライドを置きます。 100％キシレンの3変化、変化当たり10分に浸漬することによって脱パラフィンを塗るスライド。完全にスライドを沈めるためにキシレンの200ミリリットルを使用してください。 PBS（5分）まで段階的エタノールシリーズ（100％、70％、50％および30％、攪拌しながらステップごとに5分）を用いてスライドを再水和します。 </li><li> 0.1 Mクエン酸の18ミリリットルは、一水和物、クエン酸緩衝液混合物の100ミリリットルと0.1 Mクエン酸ナトリウムの82ミリリットルを調製するために、10mMのにクエン酸緩衝液、pHが6を用いて、抗原回復を実行します。 <ol><li>高電力で6.5分間、抗原回収溶液とマイクロ波で満たされたプラスチック製のコプリンジャーに入れサンプル。 DISを追加6分間40％のパワーで蒸発させ、クエン酸緩衝液と再加熱を補償するために、コプリンジャーに水を耕作。 </li><li>水でトップ、そして6分間、40％のパワーで再び再加熱するコプリンジャーを記入してください。マイクロ波の時間は、使用されるマイクロ波に基づいて異なる場合があります。 </li><li>スライドを5分間PBSに続いて、1分間蒸留水でスライドを洗浄する前に室温で20分間冷却してください。 PBS後TBS（トリス塩基の2.425 gの蒸留水1Lに希釈したNaClを8.765 g）を10％ロバ血清および1％BSAを含有するブロッキング溶液中で、2時間ブロックスライドを洗います。 </li></ol></li><li>溶液（10％ロバ血清および1％BSAを含むTBS）をブロックに希釈した一次抗体を加えます。 BrdU（有糸分裂マーカー）、Nkx2.1（気道上皮）、Sox9を（軟骨に上昇を与える細胞）およびαSMA（平滑筋細胞）。 4℃で、一晩スライドをインキュベートします。抗体を節約するために、オーバーレイメソッドを使用します。ガスケットへの抗体の180μLを適用した後、カバースリップかのようにスライドを取り付けpingを実行。 </li><li>蒸留水にスライドを浸漬することによりガスケットを外します。ガスケットを除去した後、0.1％のTween-20を含むTBSで6 5分間の洗浄を行うことにより、未結合一次抗体を洗浄します。 <ol><li>室温で1時間、200：1の希釈でブロッキング溶液中に希釈した二次抗体を用いてスライドをインキュベートします。それらの間の望ましくない結合を防ぐために慎重に二次抗体を選択します。 0.1％のTweenを含むTBSで3 5分間洗浄を行うことにより、未結合の二次抗体を除去します。 </li><li> 5分間二回、0.1Mトリス塩基でスライドを洗浄し、5分間二回、その後0.05 M Tris塩基。またはDAPI（1.5 / mlの）せずに取り付けメディアを使用してcoverslipingながらスライドを0.05 Mトリス塩基のままになることがあります。 4℃でスライドフォルダに保管スライドとアルミホイルでフォルダを覆うことにより、光から保護します。 </li></ol></li><li>自動化された蛍光顕微鏡を用いて染色し、写真を視覚化します。標識細胞とで撮影フィールドあたりの全細胞を数えます20Xと40Xは、全細胞に増殖細胞の割合を決定します。 </li></ol>

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</ol>

&quot;著者らは、開示することは何もありません。」

気道の形態形成の基礎となるイベントは、完全に、誘導気道のパターニングのために必要な、特にプロセスを理解されていません。以前の研究では、現像外植片が気液相間での培養またはマトリゲル21,22内に埋め込まれている、請求エキソビボ技術を利用しています。これらの研究は、成長因子は現像気管のパターニングおよび気管軟骨の形成にどのように影響するかを示しています。これらの研究の限界は、組織の構造が適切に維持されていないので、それらは非常に軟骨の生体内プロセスを再現しないことです。 我々は気道のパターニングを行う過程におけるWntシグナル伝達の役割を研究することを約束したアプローチは、全マウント染色技術、免疫蛍光およびイメージングと相まってin vivo試験に含まれています。全体のマウント・組織のX-gal染色は、それ自体が続きますctioningと対比染色、パラフィン切片の染色に勝る利点を提供します。ホールマウント染色は、Wnt /βカテニン活性が動作するサイトの直接検出を可能にします...

気道の開発は腹側内胚葉の前腸1,2におけるNkx2.1陽性細胞の出現と日胚9（E9）により開始されます。管は別個のエンティティとして区別することができるときに食道・気管チューブ分離は、E11.5によって間葉組織3で囲まれたを解決します。 Wntシグナル伝達は、肺の発育不全4,5になります内胚葉気道上皮からの内臓間葉とβカテニンの欠失によって表現さWNT2とWnt2bの削除など気道の仕様に重要な役割を果たしています。我々の以前の研究では、肺の発育不全における内胚葉気道結果から、肺血管の開発および気管間葉6,7の誤パターニングの欠陥をWLSの削除、すべてのWntリガンドの分泌を媒介する貨物の受容体を決定しました。これらのデータは、上皮間葉CROの重要性をサポートそれはまた、他の研究8,9に示されているように、SSは、細胞分化および仕様で話します。 肺の開発の初期段階の研究では、私たちはより良い呼吸アイデンティティ10-16を駆動する機構を理解することができましたvitroおよびex vivoの技術では、遺伝的に依存しています。空気液体間期における全肺外植片培養物を広く形態形成10,17,18に分岐肺の初期段階での成長因子の効果を研究するために利用されています。この方法は、形態素など分枝形態形成などの変更、および遺伝子発現調節の読み出しとして使用されているが、それは文化そのものが血管系17の開発をサポートしていないとして、発達過程の初期段階の研究に限定されています。気管軟骨の発達は、この培養技術と互換性がないとすることができる、より長いインキュベーション時間を必要とします。 アナライザーへ電子気道形成中のWntシグナル伝達の役割は、私たちは、胚の研究のニーズを満たすために、標準的な技術を適応しています。我々は、気管・肺組織の清算のためのパラフィン包埋し、タイミングのためにボリューム、染色倍、処理サイクルを変更しました。本研究に記載された技術の最適化の主な目的は、E14.5までE11から行わマウスにおける気管開発の初期段階を分析することでした。レポーターマウスラインAxin2LacZ開発気管間充織におけるWnt /βカテニン活性を、我々正確に決定部位を使用して。また、全体のマウント気管組織のためのレクチン染色法を適応しています。したがって、我々は、間葉系縮合を視覚化し、軟骨形成が行われる部位を予測することができました。高度な顕微鏡技術と相まって、全体のマウントとWlsShhCreのマウスから得られた胚組織の切片の染色は、私たちはTRAによって生成されたWntリガンドの役割を明らかにするために許可されました気管パターニングでCHEAL上皮。

<table><tbody><tr><td>アンチソックス9 ab。</td><td>ミリポア</td><td>AB5535</td><td>1:400、ウサギ</td></tr><tr><td>Anti Sox9 ab。</td><td>サンタクルス</td><td>SC-20095</td><td>1:50、ウサギ</td></tr><tr><td>抗平滑筋アクチンab。</td><td>シグマ</td><td>A5228</td><td>1:2k、マウス</td></tr><tr><td>アンチ NKX2.1 ab.</td><td>セブンヒルズ</td><td>N / a</td><td>1:100、モルモット</td></tr><tr><td>アンチNKX2.1 ab。</td><td>セブンヒルズ</td><td>N / A</td><td>1:400、マウス</td></tr><tr><td>Anti Brdu ab。</td><td>アブカム</td><td>AB1893</td><td>1:200、羊</td></tr><tr><td>アンチブルドゥab。</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-32323</td><td>1:4k, mouse</td></tr><tr><td>PNA Lectin</td><td>Sigma</td><td>L 7381</td><td></td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>ライフサイエンス</td><td></td><td>Alexa fluor 分子プローブ</td></tr><tr><td>K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>K4Fe(CN)6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3289</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>NaDOC</td><td>Life Technologies</td><td>89905</td><td></td></tr><tr><td>NP4O</td><td>Life Technologies</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX</td><td>Sigma</td><td>A-3157</td><td></td></tr><tr><td>Fisher ブランドのスーパーフロストと</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>PFA (16%)</td> <td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>Sigma</td><td>11K413</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>TSA キットのコンポーネント #2&nbsp;&nbsp;&nbsp;( T20932)</td></tr><tr><td>BrDu</td><td>Sigma</td><td>B5002-5g</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 埋込媒体</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-loc カセット Histoscreen</td><td>Fisher</td><td>C-0250-GR</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy カセット</td><td>Premiere</td><td>BC0109</td><td>Available in different colors</td></tr><tr><td>Nuclear fast red&nbsp;Kernechtrot 0.1%</td><td>シグマ</td><td>N3020</td><td></td></tr>ク<tr><td>エン酸</td><td>シグマ</td><td>C1909-500G</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物</td><td>シグマ</td><td>S4641-1Kg</td><td></td></tr><tr><td>トリズマ塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>T5941-500G</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>399000000</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>マイクロナイフ</td><td>FST</td><td>10318-14</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 セラミックコーティング</td><td>FST</td><td>11252-50</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5CO</td><td>FST</td><td>11295-20</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5</td><td>FST</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>サーモ/シャンドン エクセルシオール ES</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2135</td><td></td></tr><tr><td>ニコン i90</td><td>ニコン</td><td></td><td>広視野顕微鏡</td></tr><tr><td>ニコンA1Rsi</td><td>ニコン</td><td></td><td>共焦点顕微鏡。設定:NikonA1 plusカメラ、スキャナー:ガルバノ、検出器:DU4。光学プラン Apo lambda 10X. モダリティ: 広視野蛍光レーザー共焦点。</td></tr><tr><td>ライカ MS 16 FA</td><td>ライカ</td><td></td><td>蛍光解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>ツァイス</td><td>ツァイス</td><td></td><td>全自動蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>ライカアプリケーションスイート</td><td>ライカ</td><td></td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>NIS</td><td>ニコン</td><td>ニコン</td><td></td>イメージングソフトウェア</tr><tr><td>IMARIS</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td>イメージング処理ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

誘導気道のパターニング時にwntシグナル伝達を学びます

Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways

Wntシグナル伝達経路は、気道の発達中に重要な役割を果たします。Wntシグナル伝達によって制御される分化と形態形成の正確なメカニズムを定義することは、正常な発生中に組織がどのようにパターン化されるかを理解するために必要です。この知識は、肺形成不全や気管支軟化症などの先天性欠損症の病因を決定するためにも重要です。気道の発達の最も初期の段階の分析は、組織の量が限られているため、出生後の研究により適した標準的なプロトコルの実行を妨げるため、課題を課します。この論文では、気道における細胞の分化と増殖を研究するための方法論について説明します。ホールマウント染色、共焦点顕微鏡法のための組織の処理、気管肺の発達に適用されるパラフィン切片の免疫蛍光法などの技術について説明します。また、気管間葉の分化、特に軟骨形成の研究のための方法論についても議論します。現在の論文で議論されているアプローチと技術は、胚組織を扱う際の材料の制限を回避し、導電性気道を発達させるパターン化プロセスをよりよく理解することができます。

Wnt /βカテニン活動ホールマウントラック-Z染色は記者Axin2 ラック -Zマウス 11から分離された胚の気管・肺組織で検出されました。染色のサイトは、Wnt /βカテニンの活性を示しています。全マウント染色のセクションの分析は、Wnt /βカテニン活性は気管の間充織における途上の肺の周辺領域の間充織に存在したと判断しました。 （気道の上皮からWntリガンドの分泌が抑制された前記）WlsShhCre胚ではラック-Z染色はほとんど存在しない（ 図1）でした。 気管間充織における間葉系縮合<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

全体のマウントと切片染色に連結されたレポーターマウスの使用、顕微鏡およびin vivoアッセイは、気道の正常なパターニングのメカニズムの解析を容易にします。ここでは、これらの技術は気管開発中のWntシグナル伝達の解析にどのように貢献したかを説明します。

誘導気道のパターニング時にWntシグナル伝達を学びます

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis ...

染色手順の全体的な目的は、遺伝子組換えマウスモデルの胚組織を用いて、上気道の発生初期段階におけるWntシグナリング経路の役割を実証することである。これらの手法は、伝導気道の支持構造がどのようにパターン形成されるかなど、肺生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立つ。ここで紹介する手法により、気管軟骨の形成における重要なイベントである細胞増殖や間葉系凝集のプロセスを研究することが可能になります。この手法の主な利点は、少量の組織に使用できることです。これには、肺外植体やE11胚から単離された気管が含まれます。一般的に、この手順に不慣れな方は、サンプルのサイズや利用可能な組織量が限られているため、困難に直面することがあります。胚組織の取り扱いに習熟する必要がありますが、各ステップに細心の注意を払い、ステップ間で同量の組織が維持されるようにすることで対応可能です。妊娠E11.5からE14.5の雌マウスを安楽死させ、テキストプロトコルに従って開腹した後、ピンセットと精細鋏を用いて子宮角を分離し、直ちに冷却したPBS溶液が入ったシャーレに組織を移します。その後、ディッシュを氷上に置きます。子宮角から胚を分離するため、微細ピンセットで子宮組織を保持します。次に、ハサミで子宮組織と概念物（conceptus）を穿刺し、胚を放出させます。次に、残っている胚膜をすべて取り除きます。その後、解剖顕微鏡下でニードルブレードを用い、頭部と横隔膜より下の下半身を切り離し、肝臓を指標として位置を確認します。ニードルブレードを使用して、体壁の側面、脊椎、および心臓を取り除きます。気管組織を傷つけないように注意します。胚の気管および肺組織を摘出するため、ニードルブレードを用いて食道を牽引し、気管から注意深く分離します。組織を氷上のPBSに置き、ガラスピペットまたは転送ピペットを用いて、組織を4 mmスクリューキャップガラスバイアルに移します。PBSで希釈した4%パラホルムアルデヒド（PFA）を加え、30分間インキュベートします。その後、PBSで組織を洗浄します。サンプルからPBSを除去した後、X-gal染色液を2mm加え、1〜2時間インキュベートします。さらに処理を行い包埋する場合は、4時間インキュベートしてください。PBSに3% DMSOを加えた溶液を用いて組織を5分間ずつ3回洗浄し、反応を停止させます。その後、組織を70% ethanolに保存します。テキストのプロトコルに従って自動組織処理装置でパラフィン包埋処理を行った後、包埋ボートの底に組織が平らになるようにサンプルを配置します。パラフィンを慎重に注いで包埋ボートを満たし、すぐに包埋装置の冷却プレートに置いてパラフィンを凝固させます。次に、包埋ボートからブロックを取り出し、ミクロトームを用いて6 µmの厚さで薄切します。その後、切片をスライドガラスに貼り付けます。切片をスライドウォーマーに入れ、42°Cで1時間温めます。その後、56°Cのオーブンでスライドを一晩乾燥させます。次に、サンプルの脱パラフィンを行うため、乾燥させたスライドをラックに入れ、100%xyleneを200 mL満たした染色容器に3回、各10分間ずつ浸します。段階的なエタノール系列を用いて、各1分間ずつスライドを親水化させます。次に、Nuclear Fast Redを用いてサンプルを10〜30秒間対比染色します。水道水で、5分間ずつ3回スライドを洗浄してください。スライドを脱水させるには、段階的なエタノール系列を用い、その後、キシレンを3回交換してサンプルを洗浄します。次に、キシレンベースのマウント剤とカバーガラスを用いてサンプルを封入します。レクチン染色を行うには、気管肺組織を固定し、テキストプロトコルに従ってブロッキングバッファーを調製した後、サンプルを0.5 millilitersのブロッキングバッファーに移し、室温で1時間インキュベートします。転送ピペットを用いてブロッキング緩衝液を除去し、サンプルあたり250 microlitersのレクチン溶液に置換します。次に、ガラスバイアルをアルミホイルで覆い、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、PBSでサンプルを洗浄した後、サンプルが浸る十分な量のPBSが入ったアガロースコートペトリ皿に外植体を移します。次に、蛍光解剖顕微鏡を用いてホールマウント標本を撮影します。ホールマウント標本の免疫蛍光染色を行うには、テキストプロトコルに従ってサンプルを固定した後、転送ピペットでメタノールを除去し、高濃度漂白剤を加えて組織を2時間インキュベートしてサンプルの透過処理を行います。PBSで希釈した段階的なメタノール系列を用いて、各ステップで室温にて10分間インキュベートし、組織を親水化させます。テキストのプロトコルに従って組織をブロッキングした後、一次抗体とブロッキング溶液を加え、サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。サンプルをPBSで洗浄した後、PBSで500倍に希釈した二次抗体を加え、暗所で4°Cで一晩インキュベートします。翌日、サンプルをPBSで20分間ずつ3回洗浄し、PBSで調製した段階的なメタノール系列を用いて、各ステップ10分間ずつサンプルの脱水を行います。サンプルを特製のステージプレートに移行します。メタノールを除去します。次に、200 µLのMurrayの透明化溶液を用いて、サンプルの透明化を行います。共焦点顕微鏡を用いて直ちにイメージングを行います。テキストのプロトコルに従い、E11.5の妊娠マウスにBrdUを注入し、E12.5またはE13.5に胚を単離した後、メスを用いて胚の頭部および胸腔より下の身体下部を切り出します。胸部組織を4 mLのスクリューキャップ付きバイアルに入れ、1 mLの4% PFAを加えます。テキストプロトコルに従ってサンプルの包埋、切片作成、および再水和を行った後、スライドをコプリンジャップに入れ、pH 6の10 millimolarクエン酸緩衝液を満たします。高出力で6分30秒間サンプルを電子レンジ加熱し、蒸発したクエン酸緩衝液を蒸留水で補充した後、再度加熱します。テキストプロトコルに従ってスライドの冷却、洗浄、およびブロッキングを行った後、ブロッキング溶液で希釈した一次抗体180 microlitersをガスケットに滴下し、カバーガラスをかけるようにしてスライドを取り付けます。翌日、スライドを蒸留水に浸してガスケットを剥がします。次に、0.1% Tween 20を含むTBSを用いて、スライドを5分間ずつ6回洗浄します。二次抗体でスライドをインキュベートした後、0.1 molar Tris Baseで5分間ずつ2回洗浄し、続いて0.5 molar Tris Baseで2回洗浄します。封入剤（DAPIを含む、または含まない）を添加し、カバーガラスを載せる間、スライドは0.5 M Tris Baseの中に保持します。最後に、自動蛍光顕微鏡を用いてサンプルを撮像し、テキストプロトコルに従って解析します。Reporterマウスおよび2匹のlacZマウスから分離した気管肺組織のホールマウント図において、気管の間葉および発達中の肺の周辺領域でlacZ染色が検出されており、これはWnt beta catenin活性を示しています。本実験では、E12.5からE14.5の気管および肺組織をPNAレクチンで染色しました。対照群の動物では、軟骨が形成される間充織に周期的なバンド状の蛍光が検出されました。しかし、Wntless sonic hedgehog Cree胚では染色が見られなかったことから、間充織の凝集にはWntシグナリングが必要であることが示されました。E11.5胚の気管組織のホールマウントにおいて、SOX9の発現は間葉系に連続的な帯状に限定されていますが、発達中の肺では、SOX9は呼吸上皮の周辺部で観察されます。ここで示されているように、NKX2.1は気管の上皮に限定されています。上皮からのWntリガンドの分泌を抑制すると、間葉におけるSOX9の発現は減少しますが、肺周辺上皮におけるSOX9の発現には影響しません。気管組織ではα平滑筋アクチンの染色は低レベルで検出されますが、喉頭および胃では明確に観察されます。最後に、この図に示されているように、気管組織をBrdU、SOX9、およびα平滑筋アクチンでin vivo標識したところ、SOX9陽性細胞はα平滑筋アクチン陽性細胞よりも高いレベルで増殖することが示されました。この増殖パターンは、Wntless sonic hedgehog Cree気管組織において反転します。習得すれば、これらの手法のほとんどは正しく行えば2日間で完了できます。この手順を行う際は、二次抗体を選択する際に一次抗体の由来を考慮することが重要です。これはすべての免疫染色において重要ですが、特に複数の一次抗体を使用する場合に不可欠です。X-gal染色に続き、in situ ハイブリダイゼーションなどの追加手法を実施することで、さらなる情報を取得し、また、Wntシグナリング中に特定の目的遺伝子が発現しているかといった追加の疑問に答えることができます。ここで紹介する手法は、Wntシグナリングや、発生における他の重要なシグナリング経路によって媒介されるサイレントなパターニングメカニズムに関心を持つ研究者にとって有用です。このビデオを視聴することで、呼吸器系の発生過程における分化プロセスの研究方法について十分に理解できるはずです。また、伝導気道のパターニングにおけるWntシグナルの役割について、より深い理解を得ることができます。パラホルムアルデヒドおよび安息香酸ベンジルを取り扱う際は、手袋の着用、ドラフト内での溶液調製、および地域の法律や規制に従った廃液処理など、適切な予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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ここで原稿がアフリカツメガエルにおける蛍光タグ付きリガンドの分泌と普及を分析するための方法の簡単なセットを提供します。これは、リガンドの分布を変更するための他のタンパク質の能力を試験し、モルフォゲン勾配を調節するメカニズムへの洞察を与えることが実験を可能にするためのコンテキストを提供します。...

の共焦点分析を用いました<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt; WntおよびShhのモルフォゲン勾配の調節を調査するために、

一次繊毛は、さまざまなシグナル伝達経路に影響を与えます。哺乳類の蝸牛は、平面細胞極性(PCP)シグナル伝達を調べるのに理想的です。繊毛の機能障害は、蝸牛の成長、細胞パターン化、有毛細胞の配向、PCPの読み取りに影響を与えます。私たちの目標は、表現型解析、免疫組織化学、走査型電子顕微鏡法を通じて、マウス蝸牛のPCPシグナル伝達を分析することです。...

繊毛病マウス変異蝸牛における平面セル・-極性表現型の評価

このビデオの記事では、体系的かつ効率的に多くの無脊椎動物の胚では、複雑なシグナル伝達経路および制御ネットワークの構成要素を特徴付けるために使用することができるin vivoでの方法論に簡単な詳細を示します。...

シンプルの力：ウニ胚として<em&gt; in vivoで</em&gt;複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

4 次元 (4-d) ゼブラフィッシュで心の開発を視覚化するためのプロトコルを紹介します。4 D イメージング、光シート蛍光顕微鏡 (LSFM) は、開発の心を再構築する時間を 3 次元 (3 D) 画像を引き継ぎます。質的にも量的そのせん断応力が心臓の肉を推進室開発時に心内膜 Notch...

光シート蛍光顕微鏡のゼブラフィッシュ心臓の開発上のせん断応力を変調効果の 4次元画像をキャプチャするには

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ソミトジェネシスを支配するシグナル伝達振動の機能的調査のためのマイクロフルイディクスアプローチ

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ヒト人工多能性幹細胞分化プロトコールにおける最近の進歩は、器官特異的細胞型の段階的な誘導を可能にする。ここでは、気液界面培養におけるiPSC由来気道基底細胞の維持・拡大と粘液繊毛上皮への分化のための詳細な手順を述べる。...

ヒト多能性幹細胞からの気道上皮細胞気液界面培養物の生成

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学ぶWntシグナル伝達の役割を気道パターニングにおける遺伝子改変マウスモデルを用いた染色法で。気管軟骨形成や間葉凝縮の細胞プロセスを詳細に可視化し、肺発生生物学の研究に有用です。

誘導気道のパターニング時にWntシグナル伝達を学びます

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