誘導気道のパターニング時にWntシグナル伝達を学びます

染色手順の全体的な目標は、遺伝子操作マウスモデルからの胚組織を使用して、上気道の発生初期段階におけるWntシグナル伝達経路の役割を実証することです。この方法は、肺生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、伝導性気道の支持構造がどのようにパターン化されているかなどです。

ここで紹介する技術により、気管軟骨の形成における重要なイベントである細胞増殖または間葉系凝縮のプロセスを研究することができます。この技術の主な利点は、少量の組織に使用できることです。これには、肺外植片、およびE11胚から分離された気管が含まれます。

一般的に言えば、この手順に不慣れな個人は、サンプルのサイズや利用可能な組織の量が限られていることに苦労します。胚組織を扱うときは快適に感じる必要があり、ステップ全体で注意を払い、ステップごとに同じ量の組織が利用可能であることを確認することでそれを行います。妊娠中の雌マウスをE11.5からE14.5で安楽死させ、テキストプロトコルに従って開腹術を行った後、鉗子と細いハサミを使用して子宮角を分離し、すぐに組織を冷やしたPBS溶液の入ったシャーレに入れます。

次に、皿を氷の上に置きます。子宮角から胚を分離するには、細い鉗子を使用して子宮組織を保持します。そしてハサミで子宮組織と受胎体を穿刺し、胚を解放します。

次に、残っている胚膜をすべて取り除きます。次に、針刃を使用した解剖顕微鏡で、横隔膜の下の頭と下半身を切り取り、肝臓を目印として位置を特定します。針の刃を使用して、体壁、脊椎、心臓の外側を切除します。

気管組織を傷つけないように注意してください。胚性気管肺組織を解剖するには、針の刃を使用して食道を引っ張ることにより、食道を気管から慎重に分離します。ガラスまたはトランスファーピペットを使用して組織を4mmスクリューキャップガラスバイアルに移す前に、ティッシュを氷上のPBSに置きます。

4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSに添加し、30分間インキュベートします。次に、PBSを使用してティッシュをすすぎます。サンプルからPBSを除去した後、2mmのX-gal染色溶液を加え、1〜2時間、またはさらに処理して包埋するために4時間インキュベートします。

PBS中の3%DMSOを使用して、組織を5分間ずつ3回洗浄して反応を停止します。次に、ティッシュを70%エタノールで保存します。自動プロセッサを使用してパラフィン包埋用のサンプルをテキストプロトコルに従って処理した後、組織を包埋ボートの底に平らにしてサンプルを向きます。

パラフィンを慎重に追加して埋め込みボートを充填し、パラフィンが固まるまですぐに埋め込みステーションのコールドプレートに置きます。次に、埋め込みボートからブロックを取り外し、ミクロトームで6マイクロメートルのセクションを切断します。次に、セクションをスライドに取り付けます。

そして、セクションを摂氏42度のスライドウォーマーに1時間置きます。スライドを摂氏56度のオーブンで一晩焼きます。次に、サンプルを非パラフィナイズするために、焼きたてのスライドをラックに入れ、200ミリリットルの100%キシレンで満たされた染色皿に、それぞれ10分間、3回移します。

段階的なエタノールシリーズをそれぞれ1分間使用して、スライドを再水和します。次に、Nuclear Fast Redを使用してサンプルを10〜30秒間対比染色します。水道水で、スライドを3回、それぞれ5分間すすぎます。

スライドを脱水するには、キシレンの3つの交換でサンプルを洗浄する前に、等級付けされたエタノールシリーズを使用します。次に、キシレンベースの封入剤とカバースリップを使用してサンプルを封入します。レクチン染色を行うには、気管肺組織を固定し、テキストプロトコールに従ってブロッキングバッファーを調製した後、サンプルを0.5ミリリットルのブロッキングバッファーに移し、室温で1時間インキュベートします。

トランスファーピペットを使用してブロッキングバッファーを取り外し、サンプルあたり250マイクロリットルのレクチン溶液と交換します。次に、アルミホイルを使用してガラスバイアルを覆い、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、PBSを使用してサンプルをすすぎた後、サンプルを覆うのに十分なPBSを含むアガロースコーティングされたペトリ皿に外植片を置きます。

次に、蛍光解剖顕微鏡を使用して、マウント全体を撮影します。全体のマウントで免疫蛍光染色を行うには、テキストプロトコルに従ってサンプルを固定した後、トランスファーピペットを使用してメタノールを除去し、次に高密度の漂白剤を添加して組織を2時間インキュベートし、サンプルを透過化します。PBSで希釈した段階的な一連のメタノールを使用して、各ステップで室温で10分間インキュベートすることにより、組織を水和します。

テキストプロトコールに従って組織をブロッキングした後、一次抗体とブロッキング溶液を添加し、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。サンプルをPBSで洗浄したら、PBSで二次抗体を1〜500希釈分に加え、4°Cの暗所で一晩インキュベートします。翌日、サンプルをPBSで3回、各20分間洗浄した後、PBSで段階的なメタノールシリーズを使用して、各ステップでサンプルを10分間脱水します。

サンプルをカスタムメイドのステージプレートに移します。メタノールを取り除きます。次に、200マイクロリットルのマレーの透明な溶液を使用してサンプルを透明にします。

共焦点顕微鏡を使用してすぐに画像化します。E11.5妊娠マウスにBrdUを注入し、テキストプロトコルに従ってE12.5またはE13.5で胚を分離した後、ナイフブレードを使用して胚頭部と胸腔の下の体の下部を切除します。胸部組織を4ミリリットルのスクリューキャップバイアルに入れ、1ミリリットルの4%PFAを追加します。.

テキストプロトコルに従ってサンプルを包埋、切片化、および再水和した後、スライドをCoplinジャーに入れ、10ミリモルのクエン酸緩衝液、pH 6で満たします。サンプルを高出力で6分半マイクロ波した後、蒸留水を使用して蒸発したクエン酸バッファーを交換し、再度加熱します。テキストプロトコルに従ってスライドを冷却、洗浄、ブロッキングした後、ブロッキング溶液で希釈した180マイクロリットルの一次抗体をガスケットに塗布し、カバースリップを塗布するようにスライドを取り付けます。

翌日、スライドを蒸留水に浸してガスケットを外します。次に、TBSと0.1%Tween 20を使用して、スライドを5分間ずつ6回洗浄します。スライドを二次抗体とインキュベートした後、0.1モルのTris Baseを使用してスライドを5分間ずつ2回洗浄した後、05モルのTris Baseで2回洗浄します。

スライドを05モルトリスベースに保持しながら、DAPIの有無にかかわらず、封入剤を追加し、カバースリップを追加します。最後に、自動蛍光顕微鏡を使用してサンプルをイメージングし、テキストプロトコルに従って分析します。この図は、Reporterマウスと2匹のlacZマウスから単離された全量気管肺組織であり、気管間葉および発生中の肺の末梢領域でlacZ染色が検出され、Wntβカテニン活性が示されました。

この実験では、E12.5からE14.5の気管肺組織をPNAレクチンで染色しました。対照動物では、軟骨が形成される間葉に周期的なバンドとして蛍光が検出されました。しかし、Wntlessソニックヘッジホッグクリー胚の染色の欠如は、Wntシグナル伝達が間葉系凝縮に必要であることを示しています。

E11.5胚の全マウント気管組織では、SOX9の発現は連続ストライプとして間葉に限定されていますが、発生中の肺では、SOX9は呼吸器上皮の周辺で観察されます。このように、NKX2.1は気管の上皮に限定されています。上皮からのWntリガンドの分泌を防ぐと、間葉でのSOX9の発現は減少しますが、末梢肺上皮でのSOX9の発現には影響しません。

アルファ平滑筋アクチン染色は、気管組織では低レベルで検出されますが、喉頭や胃でははっきりと観察されます。最後に、この図に示すように、BrdU、SOX9、およびα平滑筋アクチンによる気管組織のin vivo標識は、SOX9で染色された細胞がα平滑筋アクチンで染色された細胞よりも高いレベルで増殖することを示しています。Wntless sonic hedgehog Cree気管組織では、増殖パターンが元に戻ります。

一度習得すると、これらのテクニックのほとんどは、正しく実行すれば2日で完了できます。この手順を試みる際には、二次抗体を選択する際に一次抗体の供給源を覚えておくことが重要です。これはすべての免疫染色において重要ですが、一次抗体が複数ある場合は特に重要です。

X-ガラクトシダーゼ染色に続いて、in situハイブリダイゼーションなどの追加の技術を実行して、追加情報を取得するだけでなく、Wntシグナル伝達中に特定の目的遺伝子が発現するかどうかなどの追加の質問に答えることができます。ここで紹介する手法は、Wntシグナル伝達によって媒介されるサイレントパターニングメカニズム、または開発に対する他の主要なシグナル伝達力に関心のある研究者にとって有用です。このビデオを見た後、気道の発達中の分化プロセスを研究する方法をよく理解しているはずです。

また、伝導性気道のパターン化におけるWntシグナル伝達の役割についても理解を深めることができます。パラホルムアルデヒドと安息香酸ベンジルを使用する場合は、手袋のイヤリング、ボンネットの下での溶液の準備、地域の法律や規制に従って廃棄物溶液を処分するなど、適切な予防措置を講じることを忘れないでください。