シングルプローブの応用：周囲条件下での質量分析イメージングと単一細胞解析

この方法の全体的な目標は、周囲条件下で質量分析を使用して生きた単一細胞を分析するためのマイクロスケールサンプリングデバイスであるSingle-probeを作成することです。また、生体組織のアンビエント質量分析イメージングを高い空間分解能で行うことができます。この方法は、生物学および薬学研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。

例えば、生きた単一細胞に存在する分子は何か、それらは組織にどのように分布しているのかなどです。この手法の主な利点は、シングルプローブがライブシングルセル分析と高分解能周囲質量分析イメージング実験の両方に使用できる多機能デバイスであることです。この方法は単一の細胞や組織を分析できますが、化学物質や生きたマイクロコロニーやバイオフィルムのスパー分析など、マイクロスケールのサンプリングが望ましい他のシステムにも適用できます。

私と一緒に手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるWei Raoです。目的のマウス器官全体を小さなプラスチック製の井戸の中央に置きます。臓器を組織包埋化合物に約10mmの高さまで沈めます。

すぐに組織を液体窒素に入れて急速凍結します。マウス組織切片を調製するには、凍結したマウス臓器を採取し、温度制御されたクライオミクロトームで摂氏15度まで解凍します。約500マイクロリットルの組織包埋コンパウンドが入ったスチールベースに組織を固定し、クライオミクロトームセクショニングマウントに載せて、目的のセクショニングオリエンシーブがナイフに提示されるようにします。

組織を12ミクロンの厚さに切片化します。次に、切片化した組織スライスをポリカーボネート顕微鏡スライドに置き、室温で30分間乾燥させます。1 mLのHeLa細胞懸濁液などの細胞サンプルを採取し、標準的な10cm細胞培養プレートで9mLの完全細胞培養培地に加えます。

細胞を摂氏37度、5%CO2で2〜3日間培養し、成長面が細胞培養プレート上で70〜80%覆われるまで保管します。細胞培養プレートで細胞継代を行います。これを行うには、増殖培地を吸引し、5mLの1xリン酸緩衝生理食塩水で細胞をすすぎます。

滅菌吸引チップを使用してPBSを取り出し、細胞を2.5mLのトリプシンと摂氏37度で約5分間インキュベートして、細胞を培養プレートから分離します。7.5mLの完全細胞培養培地を添加してトリプシン活性を停止し、その後、細胞を均一に再懸濁します。シングルセル質量分析(SCMS)実験用の細胞サンプルを調製するには、まず個々のマイクロカバースライドを12ウェルプレートのウェルに入れます。

次に、1.8mLの細胞培養培地と0.2mLの細胞懸濁液をウェルに加えます。プレートを穏やかに攪拌しながら細胞を穏やかに混合した後、摂氏37度の5%CO2環境で約24時間インキュベートします。培養細胞の薬物処理を行うには、12ウェル細胞培養プレートに薬物化合物溶液を添加します。

デュアルボアクォーツチューブをレーザーマイクロピペットプーラーに入れ、デュアルボアクォーツ針を引っ張ります。開始点として、熱を 400 に、フィラメントを 3 に、速度を 80 に、遅延を 150 に、プルを 250 に設定します。プルチップをカットして、もう一方の端に引っ張られていないデュアルボアクォーツキャピラリーが約5mm残るようにします。

溶融シリカキャピラリーの80mm切片を溶媒供給キャピラリーとして切断します。次に、キャピラリーをデュアルボア石英針の平らな端にある1つの穴に挿入します。炎を使用して溶融シリカキャピラリーをnanoESIエミッターとして引っ張り、長さ7〜10mmにカットし、デュアルボア石英針の平らな端にあるもう一方の穴に挿入します。

デュアルボアクォーツ針の平らな端に最小限のUV硬化性樹脂を塗布します。LED UVランプで約20秒間樹脂を固化させ、溶剤供給キャピラリーとnanoESIエミッターを固定します。次に、標準的な顕微鏡スライドガラスを縦半分にカットします。

次に、シングルプローブをスライドガラスの一方の端に置き、nanoESIエミッターが外側を向くようにします。シングルプローブの本体に通常のエポキシ樹脂を塗布して、スライドガラスに固定されるようにしてから、硬化のために一晩放置します。このシステムには、質量分析計のカスタマイズされたイオン源インターフェースフランジと、USBデジタルマイクロスコープが取り付けられたアルミニウム光学ボード、小型手動XYZトランスレーションステージ、および電動XYZトランスレーションステージシステムが含まれています。

質量分析計のイオン源インターフェースフランジを変更し、テキストプロトコルで説明されているようにデジタル実体顕微鏡のスタンドを製作します。改造したデジタル実体顕微鏡、USBデジタル顕微鏡、フレキシブルクランプホルダー付きの小型手動XYZトランスレーションステージ、電動XYZトランスレーションステージシステムをアルミ光学基板に取り付けます。フレキシブルクランプホルダーを使用して、シングルプローブで取り付けられたスライドガラスを固定します。

次に、シングルプローブセットアップを質量分析計に取り付けます。フレキシブルクランプホルダーとミニチュアXYZステージを調整して、シングルプローブのエミッターを質量分析計の入口の前に配置します。サンプル切片を室温で解凍し、シングルプローブの下にある電動XYZトランスレーションステージシステム上に置きます。

制御ソフトウェアで座標を変更して、サンプルの位置を調整します。シリンジを使用して、サンプリング溶媒を適切な速度でポンピングします。そして、イオン化電圧を印加します。

シングルプローブの高さを調整して、サンプルの表面のすぐ上に置き、代謝物の表面抽出を実行できるようにします。Zステージを慎重に持ち上げてから、USBデジタルマイクロスコープを使用して、シングルプローブチップと組織表面の間の距離変化を監視します。サンプル内の対象セクションを横断するラスタリングのパラメータを設定します。

ここに示すマウスの腎臓切片では、毎秒 10 マイクロメートルのラスタリング速度とライン間の距離 20 マイクロメートルを使用します。サンプル内の対象セクションを横断するラスタリングのパラメータを設定します。ここに示すマウスの腎臓切片では、毎秒 10.0 マイクロメートルのラスタリング速度と、ライン間の距離を 20 マイクロメートルにします。

質量分析計からMSスペクトルを自動的に取得するためのメソッドを設定します。マウス腎臓サンプルの高質量分解能MSIには、60, 000の質量分解能、5kVポジティブモード、1マイクロスキャン、150ミリ秒の最大注入時間、および自動ゲイン制御を使用します。MSIデータ集録を開始し、テキストプロトコルで説明されているように、生のMSファイルからMS画像を構築します。

MSIの指示に従ってシングルプローブシステムをセットアップし、溶媒流量を調整します。マイクロカバースライドガラスに付着した培養細胞をPBSで洗浄し、培地や細胞外薬物成分を除去します。次に、細胞を含むスライドガラスを電動XYZトランスレーションステージシステムに配置して実験します。

デジタル実体顕微鏡をサンプルの上にあるシングルプローブの先端にピントを合わせ、分析中の細胞浸透をモニターします。シングルプローブの側面にあるUSBデジタルマイクロスコープを使用して、シングルプローブ上のnanoESIエミッターの動作状態を監視します。電動XYZステージ制御プログラムとデジタル実体顕微鏡を使用して、目的の細胞を特定し、シングルプローブチップをサンプルの上に正確に配置します。

シングルプローブチップをセルに挿入する前に、MSデータの取得を開始してください。細胞内包括プレートを下げて、シングルプローブの先端を細胞から引き出します。最後に、溶媒を約3分間流して、シングルプローブを完全に洗い流します。

マウス腎臓切片のアンビエント質量分析イメージングを行ったところ、組織表面に存在する多数の分子を検出することができました。組織表面上の複数の分子の空間分布と相対的な存在量をプロットしました。質量分析データ内に存在する特徴の急激な遷移を観察することにより、8.5ミクロンの空間分解能が達成されました。

シャープな先端とオープンチャネルを備えたシングルプローブを作製することは、シングルセル分析にとって重要です。標的細胞を特定し、細胞浸透過程を監視するには、顕微鏡が必要です。マススペクトルからのシグナルの変化は、細胞の浸透を確認するための追加情報も提供します。

生きた単一細胞から多数の分子が検出されています。抗がん剤の研究では、コントロール細胞の実験を用いて抗がん剤治療の違いを示します。このビデオを見れば、シングルプローブがどのように製造され、このデバイスがシングルセルの質量分析および生体組織のアンビエント質量分析イメージングにどのように使用されるかについて十分に理解できるはずです。

一般に、この方法に不慣れな人は、シングルプローブデバイスの製造、システム全体のセットアップ、および機器の操作に詳細な指示が必要なため、苦労する可能性があります。一度習得すると、シングルセル解析を多くの細胞に対して連続的に実行できます。また、各分析にかかる時間は 3 分未満です。

アンビエントMSイメージング実験の終了には、サンプルサイズ、空間分解能、使用する質量分析計によっては、数時間かかる場合があります。この手順を試行する際には、高品質のシングルプローブを作製することが重要なステップであることを覚えておくことが重要です。さらに、実験を成功させるためには、機器のチューニングと操作が重要です。

他の方法は、ここで紹介する方法と同様の手順に従って開発できます。例えば、サンプル溶媒に試薬を添加し、反応性シングルセル分析やアンビエントMSIを行うことで、サンプルからの分子の検出を向上させることができます。開発後、この技術は、室温条件下でのシングルセル解析と質量分析イメージング研究の両方において、研究者に道を開きました。

この技術は、細胞生物学研究、薬理学研究、および臨床試験に使用できる可能性があります。鋭利な石英キャピラリーやUV硬化エポキシでの作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは、手袋やUV安全ゴーグルの着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。