FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

このイメージング技術の全体的な目的は、特に血管平滑筋細胞において、カルシウム動員剤に反応した腔内SRカルシウム濃度の変動をモニタリングすることです。この手法は、細胞内のカルシウムサイクリングをより直接的な方法で解明するのに有用です。例えば、筋小胞体におけるカルシウム輸送とERストレスとの関係を明らかにすることは非常に重要です。

この手法の利点は、細胞質内の変化の間接的な測定から外挿する必要がなく、筋小胞体腔内のカルシウムを直接測定できることです。この手法の実演は、私の研究室の大学院生であるGabriela Ziomekが行います。この手順を開始するために、DMEMを用いてタンパク質混合物を1:25に希釈して準備します。

次に、タンパク質混合物を含むDMEMを200 µLずつ各35 mmガラス底プレートに移し、底面のガラス円形部分を完全に覆います。プレートを安全キャビネット内で室温に少なくとも30分間静置します。その間に、10% NCSを含むDMEMをウォーターバスで37 °Cに温めておきます。

その後、ガラスピペットを用いて培養フラスコからDMEMを除去します。続いて、残ったDMEMの残留物を除去するために、温めた滅菌PBSでフラスコ底面を洗浄します。培養した平滑筋細胞をフラスコ底面から剥離させるため、1 mLのトリプシンでフラスコを迅速に洗浄し、それを回収します。

次に、トリプシンをさらに1 mL加えます。フラスコを取り出す前に、酵素がフラスコの底全体に接触するように、30〜60秒間ほどフラスコをゆすってください。トリプシンによって細胞が剥離したら、10% NCSを含む新鮮なDMEMをフラスコに加えてトリプシン反応を停止させます。

得られた細胞懸濁液をフラスコから、ラベルを貼った清潔な50 milliliterコニカルチューブに移します。次に、準備する各プレートに、新鮮なDMEMに10 % NCSを加えたものを1 milliliterずつ加えます。その後、細胞懸濁液が入ったチューブをゆっくりと数回反転させ、形成された凝集塊を分散させます。

緩やかに混ぜ合わせた細胞懸濁液の所定量を各プレートにピペッティングします。その後、各プレートを時計回りまたは反時計回りに十分に回転させ、底面のガラス上に細胞が均一に分散するようにします。効果的なイメージングを行うため、今後48時間で十分に高いコンフルエンシーに達するだけの細胞数をプレートに添加する必要があります。

各プレートに培地と細胞懸濁液を添加した後、細胞がガラス底に適切に接着するように、37°C、5% CO₂条件下で少なくとも1時間インキュベートします。細胞が明確に接着するまで、15分間隔で顕微鏡を用いてプレートを確認してください。その後、-80°Cの保存庫からAdenovirus D1 SRのアリコートを取り出し、移動式アイスバスを用いて生物安全キャビネットまで搬送します。その後、

冷却したD one SRを規定量ずつ各プレートにピペットで分注し、感染細胞を37°Cで一晩インキュベートします。翌日、1 mLの新鮮な10% NCS含有DMEMを細胞に補充します。その後、プレートを5% CO₂濃度の加湿インキュベーター内で37°Cにて一晩インキュベートします。

一晩インキュベートした後、プレートから培養液を除去します。温めた生理的HEPES-PSS緩衝液1 mLを用いて、培養プレートを3回洗浄します。次に、記録の直前に、温めた新鮮なHEPES-PSS緩衝液1 mLを添加します。

共焦点顕微鏡の関連ソフトウェアを開き、FRET SEアプリケーションを使用して初期イメージングを行います。アプリケーションが開いたら、セットアップタブをクリックして、目的の実験設定を調整します。チャンネル設定を手動で変更し、ドナーおよびFRET用に440 nanometers、アクセプター用に513 nanometersで細胞を順次励起させます。

次に、ドナーの放出波長を488 nanometersに、FRETおよびアクセプターの放出波長を535 nanometersに設定します。続いて、光強度を透過率15 percentに設定し、細胞の励起露光時間を150 millisecond、露光間隔を10 secondに設定します。次に、プレートを顕微鏡ステージ上で固定します。

ライブボタンを使用して画像解像度を確認します。目的の解像度になるよう、さらに設定を調整してください。セットアップタブで、キャプチャ画像ボタンを使用してサンプルの画像を撮影します。

次に評価（Evaluation）タブに移動し、実施している実験に応じたFRET効率の算出方法を選択します。D1 SRインジケーターなどのカメレオン（Cameleons）を用いる実験には、レシオメトリック計算を使用する方法3が推奨されます。その後、グラフ（Graph）タブに切り替えて、記録されている強度値をグラフで確認します。

必要に応じて、画像ビューア内でROI（関心領域）を描画し、グラフ上でその領域の平均強度の変化を確認します。記録を開始し、目的の薬剤を導入する前に安定したベースライン信号を確保するため、少なくとも3分間データを収集してください。その後、記録中の関心領域付近のプレート内に直接投与することで、SRカルシウムを枯渇させるためのカルシウム移動剤を導入します。

処理後、任意の時間まで記録を継続します。その後、FRET SEアプリケーションを用い、共焦点倒立顕微鏡でレシオメトリックFRET連続画像をキャプチャします。このステップでは、ラット大動脈平滑筋細胞の培養プレートを準備するため、1 mLの温めた生理的HEPES-PSSバッファーで培養プレートを3回洗浄します。

次に、インジケーターを1 mLの温めたHEPES-PSSと混合し、培養プレートに分注します。平滑筋細胞をインジケーターとともに室温で1時間インキュベートします。1時間後、培養プレートからインジケーターを除去し、1 mLの温めた生理的HEPES-PSS緩衝液で3回洗浄します。

その後、記録の直前に、新鮮で温めたHEPES-PSS緩衝液を1 mL添加します。共焦点倒立顕微鏡を用いて連続画像をキャプチャします。続いて、SRカルシウムを枯渇させるためのツールとしてカルシウム移動剤を導入し、処置後、必要な時間だけ記録を継続します。

ここでは、CFP、FRET、およびYFPのバンドパスフィルターを用いて、D one SRインジケーターをトランスフェクトした平滑筋細胞の代表的なスナップショットを示します。この図は、D one SRをトランスフェクトした培養ラット大動脈平滑筋細胞のリアルタイム擬似カラー・スナップショットです。2 µMのサプシガルジン（Thapsigargin）による処理では、シグナル強度の低下が認められ、これはサプシガルジン誘発性のカルシウム放出によるSRカルシウム含量の著しい減少を示しています。また、このグラフは、2 µMのサプシガルジンで処理した培養平滑筋細胞における標準化されたD one SR比の代表的なトレースであり、SRカルシウムの有意な減少が確認されました。

以下は、細胞質カルシウムインジケーターを導入し、2 µMのタプシガリンで処理した培養ラット大動脈平滑筋細胞の代表的なスナップショットです。示されているように、タプシガリンはSRからのカルシウム放出により、細胞質内の信号強度を著しく上昇させます。また、このグラフは、2 µMのタプシガリンで処理した培養平滑筋細胞における、正規化されたFluo-4 AM比の代表的なトレースを示しています。ここに描かれたカルシウム信号の上昇は、SRから放出されたカルシウム量に比例すると考えられます。この手法に習熟すれば、適切に実施した場合、開始から終了まで約48時間で完了できます。

本手順を実施する際は、カルシウムインジケーターでトランスフェクションを行う前に、細胞の健全性を確保するために記載された条件下で維持することが重要です。このビデオを視聴することで、D one SRインジケーターを用いてSR内腔のカルシウムレベルを測定するための、培養細胞の調製方法について明確に理解できるはずです。