Name: FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶ FRETベースの共焦点イメージングを用いて、血管平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動を直接測定する方法。この技術は細胞内カルシウム動態とERストレスの関係を解明するのに有用である。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、[CVB＆MEにMOP-1112666]カナダ衛生研究所からの資金によってサポートされていました。

倫理の声明：全ての実験および手順はブリティッシュ・コロンビア州、バンクーバー、カナダの大学の研究室バイオセーフティ指針と一致して行われました。 FRETベースの共焦点顕微鏡のための35ミリメートルのガラス底の培養皿の調製<ol><li>次の手順で36〜48時間前の実験とを使用してプレートを準備します。 </li><li> Cストレージ-20℃から選択されたゲル状のタンパク質混合物と0.25％トリプシン-EDTAを取得し、使用するまでモバイル氷浴に保管してください。 注：コーティングタンパク質混合物は、使用前に固化から混合物を防止するために、短時間室温にさらされるべきです。必要になるまでトリプシン溶液も冷やしておくべきです。代わりに、トリプシンは、ステップ1.5が完了した後、-20℃の貯蔵から取り出すことができます。 </li><li> DMEM（無血清添加、チルド）：タンパク質混合物の1時25希釈を準備します。各プレートが用意されているにタンパク質混合物/ DMEMの適切な量を転送。 35ミリメートルのガラス底板については、完全にプレートの底面に内側のガラスの円をカバーするために約200μlを添加します。 </li><li>安全キャビネット内、室温で少なくとも30分間座ってプレートを残します。この期間中の水浴中で37℃、10％NCSで暖かいDMEM。 </li><li>直前に次のステップに37℃に水浴中で暖かいトリプシン。 </li><li>ガラスピペットと吸引を用いて培養フラスコに現在あるDMEMを削除します。残りのDMEM残留物を除去するために暖かい滅菌PBSでフラスコの床を洗います。 </li><li>フラスコ底部から前培養平滑筋細胞を取り除きます。 注：フラスコは、細胞がプレートの準備の前に、所望の密集度（約80％）に達するようにするには、このステップに日に設立されました。細胞が元々 DMEM供給をリフレッシュし、細胞をインキュベーターに戻しした後、10％NCSを含むDMEM 20mlのフラスコ中に懸濁させ、24時間、5％CO 2電源で37℃でインキュベートしました。 DMEMは前夜に更新されました細胞がコンフルエントに達するまで、これらの初期の手順以下のRY 48時間。 <ol><li>ウォッシュは、トリプシンの1ミリリットルで素早くフラスコ、その後、吸引を用いて、1 mlのトリプシンを削除します。 </li><li>トリプシンの別の1ミリリットルに加え、酵素は、フラスコの底面全体に接触して確保するために、フラスコをswishing、より長い期間（約30-60秒）に向けて出発。 </li><li>フラスコからの分離に満足するまで、顕微鏡下で剥離しているどのくらいの細胞を観察します。代替は、トリプシン溶液をswishing、フラスコから分離された細胞の割合に満足するまで、細胞の剥離をチェックします。 注：フラスコを、37℃で、このプロセスをスピードアップするために約30〜60秒間インキュベーターに戻すことができます。 </li><li>細胞は、トリプシンを使用して取り除かれた後、（トリプシンをフラスコに総容量の1/8を形成するように十分な体積）トリプシン反応を停止し、フラスコに10％NCSを用いて新鮮なDMEMを加えます。 注：250mlの培養フラスコを使用した場合、例えば、これは、希望7 mlのDMEMを細胞溶液8mlにもたらすために、トリプシンの1mlに添加してもよいです。 </li></ol></li><li> （ラベル）クリーン50mlコニカルチューブにフラスコから細胞溶液を生じた譲渡。 </li><li>各プレートに1ミリリットルの新鮮なDMEM + 10％NCSを追加しますが（十分な媒体が24時間持続するために）準備されています。 </li><li>静かに形成された可能性のあるペレットを破壊するために細胞溶液を複数回含むチューブを反転。 </li><li>ピペットを各プレートに穏やかに混合した細胞溶液の体積を所望します。 注：このプロトコルのためにメッキ推奨SMCの数が35ミリメートル培養皿あたり0.5〜0.8×10 6です。これらの数は、細胞型に依存して変化してもよく、各研究所で試験され、修飾されるべきです。 </li><li>ガラス下部に細胞の平等な分配を確保するために、各プレート徹底的に時計回り/反時計回りの渦巻。 </li></ol> D1SRのCa 2+インジケーターを運ぶアデノウイルスベクター2.一過性トランスフェクション<ol><li>私の添加後各プレートにdiumとセルソリューション、細胞は皿の底にガラスに正しく取り付けることができるように、少なくとも1時間、5％CO 2電源で37℃でインキュベートし、プレートを残します。細胞が明確に添付されるまで、15分間隔で顕微鏡下でプレートを確認してください。 </li><li> -80℃ストレージからのアデノウイルスD1SRアリコートを取り出し、生物学的安全キャビネットに輸送するために、モバイル氷浴中に保ちます。 </li><li>ピペット所望の投与量を各プレートに冷却D1SRの（100の感染多重度）。 注：プレートごとに必要なアデノウイルス溶液の体積の計算は、プラーク形成単位（P​​FU）として提示され、元の原液、中のウイルス力価に依存します。我々の経験に基づいて、我々は培養プレートに1平滑筋細胞（SMC）を感染させるために必要な番号やウイルス粒子として解釈される100の（MOI）を、感染の多重度をお勧めします。 </li><li> 5％CO 2供給O / Nで37℃で感染させた細胞をインキュベートします。 </li><li>翌日、新鮮なDMEM + 10％NCSの1ミリリットルで細胞を補充します。 </li><li> 5％CO 2、O ​​/ Nで37℃の加湿インキュベーター中で培養します。 </li></ol> FRETベースの共焦点イメージングを使用して3.測定SR腔のCa 2+ <ol><li> O / Nインキュベーション後、プレートから培地を除去します。 </li><li>含む1ミリリットル温かい生理HEPES-PSS緩衝液で培養プレートを洗浄（mmol·Lに- 1）のNaCl 140、グルコース10、塩化カリウム5、HEPES 5、CaCl 2を1.5およびMgCl 2 1（pH7.4）で3回。 </li><li>直前の記録の開始に1ミリリットル新鮮な温かいHEPES-PSSのバッファを追加します。 </li><li>共焦点顕微鏡の関連ソフトウェアにFRET SE（増感エミッション）アプリケーション（または同様の機能）を使用して初期撮影を行います。 <ol><li>アプリケーションが開いたら、目的の実験条件を達成するために、設定を調整する「設定」タブにクリックします。 </li> &lt;李&gt;は手動（アクセプターチャネルのために）細胞は（ドナーのためにとチャンネルをFRET）440 nmで順番に興奮しているように、チャネルの設定を変更し、513 nmの。 （ドナー用）488 nmおよび535 nmの（FRETとアクセプターのため）で発光波長を収集します。 </li><li>露光の間で10秒間隔（3つの連続CFPドナー、FRET、およびYFPアクセプターチャネルのための時間を記録する）、細胞の150ミリ秒の励起の露光時間で、15％の透過率で光の強度を設定します。 </li></ol></li><li>顕微鏡ステージ上のプレートを安定させます。 </li><li>画像の解像度を確認するには、「ライブ」ボタンを使用します。所望の解像度に達するまで、さらに設定を微調整します。 </li><li>それでも「設定」タブの下に、「キャプチャ画像」ボタンを使用してサンプルの画像を取ります。 </li><li> 「評価」タブに移動する、行われている実験のためのFRET効率を計算するために適切な方法を選択します。レシオメトリック計算[E A（I）= B / Aを使用して方法3、]、このようなD1SR指標としてカメレオンを含む実験のために推奨されます。 </li><li>実験中にグラフ形式で記録された強度値を観察することができるように、「グラフ」タブに切り替え。 </li><li>実験が進むにつれて、グラフ上の関心のこの領域の対応する平均強度を観察するために、画像ビューアでROIを描きます。 注：研究者はまた、複数のROIを描き、対応する強度を記録し、グラフ上に同時に表示するように選択することがあります。また、研究者らは、最初の記録のための単一のROIを概説し、ソフトウェアのデータ分析指向のバージョンに実験ファイルを開くことによって、後で複数のROIの輪郭を描くに進むことができます。 注：FRETベースの実験をセットアップするために必要な手順に関するさらなる詳細は、FRETアプリケーションウィザードのマニュアルに記載されています。顕微鏡はFRETウィザードが装備されていない場合は、以下のプロトコルは、のパラメータを設定するために使用することができます手動で記録。 </li><li>記録を開始し、目的の薬剤を導入する前に、信号の安定した基礎記録を確実にするために、少なくとも3分のデータ収集を可能にします。 </li><li>手動で関心ビーイングの領域と近くにスポットでプレートに直接所定の線量をピペッティングすることにより、SRのCa 2+を枯渇させるためのツールとして、（100 nmのエンドセリン-1 例えば、2μMタプシガルギン）のCa 2+ -movingエージェントを導入可能性として記録。所望の時間の後処理のために記録を続けます。 </li><li>レシオメトリックをキャプチャFRET SEアプリケーションを用いた共焦点倒立顕微鏡の63X油浸対物レンズとのシリアル画像（512×512ピクセル）をFRET。 </li><li>関心の各領域における5-10のSMC（ROI）のクラスタからの撮像結果のデータを収集し、その後にフォーマットし、統計ベースのソフトウェアを使用して分析します。 <ol><li>後で使用するためにデータを保存するには、記録されたトレース上で右クリックして、SAVする「エクスポート」オプションを選択します電子記録とのスプレッドシートは、研究者の選択したドライブ上の信号強度を意味します。 </li><li>時点0秒​​で観察された開始強度値によって各データポイントを分割して、各個々の実験からのデータを正規化します。 </li><li>手動で元のスプレッドシート/秒から関連するデータ行をコピーして貼り付けることにより、統計プログラムのプロジェクトファイルへのスプレッドシートからのインポート正規化されたデータ。 </li><li>自動的にプログラムに貼り付けられたデータセットに対応するグラフを生成。 注：プログラムのデフォルト設定は、インポートしたデータから線グラフを生成します。表示されるグラフの種類は、メインツールバー内で見つかった見出し「変更」の「グラフの異なる種類を選択」ボタンをクリックして変更することができます。 </li><li>単一のデータ・シートに同一の実験の大きなグループ内の複数の独立した試験を表すプールのデータは、実行される特定のテストの平均トレースを生成します。 </li></ol></li></oL&gt; 細胞質のCa 2+インジケーターの4準備<ol><li>黒のマイクロ遠心チューブ内のジメチルスルホキシド（DMSO）1ml中0.0125 gでプルロニック酸（PA）を溶解（PAの溶解を助けるために、モバイル水浴中でチューブを暖めるために有していてもよいです）。 </li><li> -20℃の保存から細胞質のCa 2+指示薬色素（あるFluo-4 AM）のチューブ（50μgの）を取得します。 </li><li>光との接触からできるだけそれを保護するために、箔中の染料のチューブを包みます。 </li><li>色素を含有するチューブにDMSO + PAソリューションのピペット45μlの。 RTで箔とストア内のDMSO + PAソリューションを包みます。 </li><li>徹底的に解決策の上下に複数回ピペッティングすることにより、チューブの内容物を混合。あるいは、10分間染料管超音波処理。 注：完全にDMSO + PAソリューション全体に染料を分配する方法のいずれかが十分であろう。単に研究者の好みの問題です。治験責任医師は、溶液を超音波処理することを選択した場合、それ他はノイズによって影響されない孤立した地域/部屋で行う必要があります。研究者はまた、耳を保護するために重いマフラーを使用する必要があります。 <ol><li>ソリューションを超音波処理した場合、超音波洗浄器（ の dH 2 Oで）フル2/3の内側に発泡チューブホルダーと場所の内部に染料を含有するアルミホイルにくるまれたチューブを挿入します。 </li><li>上の孤立した地域/部屋とパワー機に入れ超音波処理浴が（保護帽子を確保する前に、超音波処理プロセスを開始する場所にあります）。 （できるだけ長く光から保護するためにホイルで包んでおく）部屋を出ると、それを遮断し、チューブを取得する前に10分間実行しているマシンのままにしておきます。 </li></ol></li><li>暗いマイクロ遠心チューブに今完全に混合した溶液アリコート（チューブあたり5μLを、10チューブ総作ることができるはずです）。 </li><li>ホイルで各アリコートチューブを包みます。使用するまで-20℃の条件で乾燥剤でラベルのチューブとストア。 </li></ol> 5.細胞質のCa 2+測定<ol><li>ラット大動脈のSMCの培養プレートを準備するために1.1から1.12の手順に従ってください。 </li><li> 48時間後の培養液でプレートから培地を除去します。 </li><li> -20℃の保存から細胞質のCa 2+インジケーター（5マイクロリットル）の先に調製したアリコートを削除し、使用するまでモバイル氷浴中で維持します。 </li><li>含む1ミリリットル温かい生理HEPES-PSS緩衝液で培養プレートを洗浄（mmol·Lに- 1）のNaCl 140、グルコース10、塩化カリウム5、HEPES 5、CaCl 2を1.5およびMgCl 2 1（pH7.4）で3回。 </li><li>暖かいHEPES-PSSの1ミリリットルでインジケータを混合し、培養プレート上にロードします。 </li><li> RT（24℃）で1時間の指標でのSMCをインキュベートします。 </li><li>培養プレートからインジケータを削除し、1ミリリットル温かい生理HEPES-PSSバッファ3回洗​​浄します。 </li><li>直前の記録の開始に1ミリリットル新鮮な温かいHEPES-PSSのバッファを追加します。 </li><li> 63X Oとシリアルの画像（512×512ピクセル）を取得共焦点倒立顕微鏡のIL-浸対物レンズ。 <ol><li>手動で細胞が488nmで励起されるように設定を変更し、発光波長は700ヘルツの走査速度で555 nmで収集されます。 </li><li>細胞の150ミリ秒の励起露光時間（細胞を記録中、指定された時間間隔で光に暴露される時間量）と露光の間に5秒間隔で、15％の透過率で光の強度を設定します。 </li></ol></li><li>顕微鏡ステージ上のプレートを安定させ、記録を開始します。 </li><li>前関心の薬剤を導入する信号の安定した基礎記録を確保するために、少なくとも3分間録音。 </li><li> SRのCa 2+を枯渇させるためのツールとしてのCa 2+ -moving剤（ 例えば 、2μMタプシガルジン）を導入する（ステップ3.16で説明したように）と時間後処理所望の量の記録を継続します。 </li><li>蛍光SIを平均化することにより、顕微鏡固有のソフトウェアを使用して記録信号強度興味（ROI）の各領域における5-10のSMCのクラスタからgnals（F / F 0）。収集フォーマット、およびデータ分析ソフトウェアを用いて画像化から生じるデータを分析します。このソフトウェアを使用して、データ収集の説明と分析のための手順を3.18.1-3.18.5参照してください。 </li></ol>

<ol><li>Hennings, H., Michael, D., Cheng, C., Steinert, P., Holbrook, K., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Whitfield, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+calcium+and+cyclic+AMP+in+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The roles of calcium and cyclic AMP in cell proliferation.</a> Ann N Y Acad Sci. 339 (1), 216-240 (1980).</li>
<li>Nicotera, P., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in apoptosis.</a> Cell Calcium. 23 (2-3), 173-180 (1998).</li>
<li>Wei, C., Wang, X., Chen, M., Ouyang, K., Song, L. S., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+flickers+steer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium flickers steer cell migration.</a> Nature. 457 (7231), 901-905 (2009).</li>
<li>Ashby, M. C., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+the+functions+of+intracellular+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Sem+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER calcium and the functions of intracellular organelles.</a> Sem Cell Dev Biol. 12 (1), 11-17 (2001).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+calcium+and+Alzheimer%27s+disease%3A+in+a+state+of+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+signal%22%5BJournal%5D)">ER calcium and Alzheimer's disease: in a state of flux.</a> Sci signal. 3 (114), (2010).</li>
<li>Rutkowski, D. T., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+trip+to+the+ER%3A+coping+with+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A trip to the ER: coping with stress.</a> Trends Cell Biol. 14 (1), (2004).</li>
<li>Schroder, M., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+stress+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">ER stress and the unfolded protein response.</a> Mutat Res. 569 (1-2), 29-63 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+calcium+signaling+using+genetically+targetable+fluorescent+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Poburko, D., Liao, C. H., van Breemen, C., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+regulation+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in vascular smooth muscle cells.</a> Circ Res. 104 (1), 104-112 (2009).</li>
<li>Esfandiarei, M., Fameli, N., Choi, Y. Y., Tehrani, A. Y., Hoskins, J. G., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waves+of+calcium+depletion+in+the+sarcoplasmic+reticulum+of+vascular+smooth+muscle+cells%3A+an+inside+view+of+spatiotemporal+Ca2%2B+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Waves of calcium depletion in the sarcoplasmic reticulum of vascular smooth muscle cells: an inside view of spatiotemporal Ca2+ regulation.</a> PloS one. 8 (2), e55333(2013).</li>
<li>Cobbold, P. H., Rink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+bioluminescence+measurement+of+cytoplasmic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and bioluminescence measurement of cytoplasmic free calcium.</a> Biochem J. 248 (2), 313-328 (1987).</li>
<li>Park, M. K., Ashby, M. C., Erdemli, G., Petersen, O. H., Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear%2C+perigranular+and+sub-plasmalemmal+mitochondria+have+distinct+functions+in+the+regulation+of+cellular+calcium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Perinuclear, perigranular and sub-plasmalemmal mitochondria have distinct functions in the regulation of cellular calcium transport.</a> The EMBO journal. 20 (8), 1863-1874 (2001).</li>
<li>Lovett, J. L., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+stores+in+Toxoplasma+gondii+govern+invasion+of+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium stores in Toxoplasma gondii govern invasion of host cells.</a> J Cell Sci. 116 (14), 3009-3016 (2003).</li>
<li>Kleinman, H. K., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+basement+membrane+matrix+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Matrigel: basement membrane matrix with biological activity.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).</li>
<li>Palmer, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+indicators+based+on+computationally+redesigned+calmodulin-peptide+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ indicators based on computationally redesigned calmodulin-peptide pairs.</a> Chem Biol. 13 (5), 521-530 (2006).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

このプロトコルは、SRのルーメン内のCa 2+濃度を研究するためにD1SRアデノウイルスとのVSMCのトランスフェクションを説明します。この方法は、異なるカルシウム移動剤を適用した結果に/ SRのうち、直接この細胞小器官内のCa 2+の測定だけでなく、その動きを可能にします。この方法は、SRおよび細胞質のCa 2+レベルの変化は、全体的な携帯の健康に影響を与えるとどのようにこれらの変更が相互に関連しているかの包括的な理解に向けて取り組んで研究者のための多くの利点を有しています。細胞内Ca 2+運動の伝統的な観測が唯一の細胞質のCa 2+レベルの変化を追跡することを含みます。 D1SRまたは類似の構築物を用い由来の重要な利点は、したがって、むしろSRに対するアゴニストの効果によって上あいまいな結論を引き出すするよりも、このようなSRのような特定の細胞小器官を含むこのイオンの動きを監視する機能です間接的にこのような操作によって誘発され、細胞質のCa 2+レベルの変化を観察します。同じ静脈に沿って、SRのCaに影...

Ca 2+が 、体内のすべての単一のセル内に豊富に見られる非常に重要なイオンで ​​す。それは、成長、増殖、遊走、およびアポトーシス1-4を含む多くの異なる細胞機能、で重要な役割を持っています。よくのCa 2+は両方の直接的および間接的な作用を介してこれらのプロセスに影響を与えることができることが確立されているため、このイオンの正常な細胞内濃度の変更が容易に影響を受けた細胞についてのネガティブな結果をもたらすことができます。 SRは、セル5内の最大の細胞内Ca 2+ストアとして考えられています。 SRと細胞質の両方におけるCa 2+の定常状態レベルは正常にし、この細胞小器官のの Ca 2+ -transportingチャンネルのうち、一定の磁束によって維持されています。損傷または疾患のいずれかの形式に起因する細胞に課さストレスの多い条件は、一般的に、彼に長期的な効果を持っているために行くSRのCa 2+の有意な変化と関連していますセルのALTH。例最も深刻で、ストレスを受けた細胞のできないことは、定常状態のSR Caを回復し、維持するため2+レベルはあっても、アポトーシス6-8により死に終わることがあります。 携帯のCa 2+動態への現在の研究は、その数少ない研究試験細胞小器官の Ca 2+ストアのコンテンツを直接9-11事実によって制限されます。最も一般的な方法ではなく、SR の Ca 2+含有量12-14の変化の間接的な測定として、細胞質のCa 2+レベルの測定を含みます。これらの実験において、 の Ca 2+は、一般的に細胞小器官の枯渇を引き起こす薬剤（ 例えば、タプシガルジン）の使用を介してSRから放出されるように誘導されます。結論は、その後、細胞質のCa 2+濃度の変動に基づいて、SRのCa 2+への変更に関連して描かれています。ラウンドアバウトのミリアンペアで、このような結論を導き出すために研究者のための残りの能力にもかかわらず、nner、のCa 2+測定SRのこの方法は明らかに収集されたデータの解釈に関する多くの制限で、そのような情報を収集するための間接的な方法です。この明確な制限を回避するためには、SR管腔ネットワーク内で直接見出さの Ca 2+の量を測定する必要があります。 直接管腔内SRのCa 2+レベルを記録することができるというの最終的な結果にバイタルは、細胞培養ツールと使用のCa 2+指標です。現在の原稿に参照されるデータについては、使用されたVSMCは、凍結した細胞株からのものであることに注意することが重要です。細胞を、5％CO 2電源で一定37℃でインキュベート概説した実験用通路22-26上ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％新生仔ウシ血清（NCS）で培養しました。現在の方法を使用して、例えば、細胞が非常にうまく外をシミュレートするタンパク質混合物に成長しました組織15の多くの異なる種類の環境。 SRのCa 2+研究の静脈に沿って成功のための重要なのは、使用されるタンパク質の混合物の一種です。この場合には、低成長因子品種は、通常のCa 2+シグナル伝達と絶えず試験された細胞内で起こる動きに影響を与えることから、このツールの構成要素を回避するために必要でした。試験細胞の正常な成長に続いて、のCa 2+インジケータも効果的に、これらの培養細胞に導入されなければなりません。これは、SR-在住のCa 2+インジケーターD1SRを運ぶアデノウイルスベクターを使用することによって可能となりました。高いトランスフェクション効率を達成するために、細胞は、イメージングの前に、少なくとも36〜48時間のためのウイルスベクターを用いてインキュベートされなければなりません。この調製は、高い精度と再現性でSRルーメン内のCa 2+トランジェントを測定するための信頼性の高いツールを提供します。 このプロトコルで使用されるD1SRインジケータはD1ERのCa 2+、iの修正変異体でありますもともとカリフォルニア大学の博士ロジャー・Y・チエンの研究室、サンディエゴ、USA 9,16によって作成されたndicator。元D1ERは、前のCa 2+指標9,16に比べてはるかに広い範囲（0.5から160μM）を介してのCa 2+感受性を表示カメレオンと呼ばれる遺伝的にコード化された Ca 2+指標の第二世代に属しています。新しい変種D1SR、博士ウェイン・チェン（アルバータ大学、カナダ）からの親切な贈り物は、しかし、（代わりに元D1ERのように、カルレティキュリンシーケンスの）変異カルセケストリンシーケンスを運びます。変異カルセケストリンは11ルーメンSR内のCa 2+に結合する内因性カルセケストリンと競合の問題を解消するのCa 2+への結合を減少しています。 D1SRインジケータが変更されたカルモジュリン（CAM）とM13（トンを含むリンカータンパク質によるその結合切り捨て強化シアン蛍光タンパク質（CFP）と黄色蛍光タンパク質（YFP）を運びます彼のCaM）配列に結合ミオシン軽鎖キナーゼの26残基ペプチド。カムM13配列は、内在性カルモジュリンに結合するM13のを防止するように改変されています。また、SR保持を確実にするために、カルセケストリン配列はCFP 11の5 &#39;末端に追加されています。 Ca 2+と結合すると、カムM13ドメインは、FRETシグナル強度の増大として記録され、隣接CFPとYFPとの間のエネルギー伝達の増加をもたらす立体構造変化を経ます。ドロップ2+ SR腔のCa濃度は、カムM13ドメインが隣接CFPとYFPの間のエネルギー移動、及びFRETシグナル強度の有意な低下が低下、逆コンフォメーション変化を通過する一方、 。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコの修正イーグルのミディアム(高グルコース、ピルビン酸)</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー11995-0653333</td>°C<td>で暖かい。使用前のCウォーターバス</td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス成長因子減少、5 ml</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>-20 >Cは使用直前まで</td></tr><tr><td>新生子牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td>-<td>-20°Cに保ちます。C使用直前まで</td></tr><tr><td>35 mmガラス底プレート</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 0.2 &mu;Mベントブループラグシールキャップフラスコ</td><td>BDファルコン</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/ EDTAソリューション</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td><td>25200056-20°Cに保ちます。C 使用直前まで</td></tr><tr><td>50 ml ポリプロピレン コニカル チューブ</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>D1SR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Gift</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8779</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-AM</td><td>Life technologies</td><td>F-23917</td><td>-20 >C 使用直前まで</td></tr><tr><td>1.5 ml 黒色微量遠心チューブ</td><td>Argos Technologies</td><td>T7100BK</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 共焦点顕微鏡</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fretベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

>jove_content<血管平滑筋細胞(VSMC)の筋小胞体(SR)におけるカルシウム(Ca2+)の定常状態の維持は、彼らの全体的な健康にとって不可欠です。細胞内Ca2+含有量の大部分は、VSMCのSRストア内にあります。SRは、原形質膜-SR接合を介して周囲の細胞外空間と密接に関連している唯一の細胞内小器官として、Ca2+過渡現象の不規則性、または細胞が経験するストレスに対する応答の第一線を構成すると考えることができます。その多くの機能の中で、最も重要なものの1つは、細胞全体にCa2+制御シグナルを伝達し、下流のさらなる細胞全体の反応を誘導する役割です。この点に関する細胞質Ca2+指標のより一般的な使用は、まだ完全に特徴付けられていない管腔内SR Ca2+貯蔵への非常に動的な変化に関する研究には全体的に不十分です。ここでは、管腔SR Ca2+の直接かつ明確な測定のための詳細なプロトコルを提供します。このツールは、SR Ca2+の微妙な変化がその後、細胞の正常な機能と健康に重大な影響を与えるかどうかを調査するのに役立ちます。SR Ca2+含有量の変動は、特に、細胞が経験する疾患やストレス状態に対する細胞応答に関する大量の情報を提供することができます。この方法では、SRを標的とするCa2+インジケーターの修正版であるD1SRを使用して、培養ラット大動脈平滑筋細胞(SMC)への薬剤の導入に応答してCa2+の変動を検出します。D1SRインジケーターとのインキュベーション後、共焦点蛍光顕微鏡法および蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)ベースのイメージングを使用して、制御条件下での管腔内SR Ca2+レベルの変化を直接観察し、細胞内Ca2+運動を誘導する機能を持つアゴニスト剤を添加します。

このセクションでは、間接的に、細胞質のCaの変動を観察することによっての Ca 2+ストア濃度オルガネラへの変更を測定する一般的に用いられる方法と比較して、SR腔Ca 2+濃度データを捕捉するために記載された方法を用いて得られる結果の例を提供する2+ 。 図1Aは、（514 nm励起/ 535 nmの発光）YFPチャンネルでD1SRアデノウイルスでトランスフェクトされたSMCの文化の関心領域（ROI）のスナップショットを示しています。全てのSMCはD1SR発現について陽性であるが、示されているように、それはD1SRインジケーターの発現レベルは、同じROI内の異なるセル間で異なることは明らかである。 図1Bは、D1SRでトランスフェクトされたSMCの蛍光画像の2次元投影を示しますCa 2+...

現在、ほとんどの利用可能なカルシウム指標は、培養平滑筋細胞の筋小胞体から放出されるカルシウムの間接的な測定値として、細胞質のカルシウム過渡現象を定量化するために使用されています。このプロトコルは、筋小胞体内腔内のカルシウムシグナルの直接測定を可能にする特定のFRETベースのインジケーターの使用を説明しています。

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

このイメージング技術の全体的な目的は、特に血管平滑筋細胞において、カルシウム動員剤に反応した腔内SRカルシウム濃度の変動をモニタリングすることです。この手法は、細胞内のカルシウムサイクリングをより直接的な方法で解明するのに有用です。例えば、筋小胞体におけるカルシウム輸送とERストレスとの関係を明らかにすることは非常に重要です。この手法の利点は、細胞質内の変化の間接的な測定から外挿する必要がなく、筋小胞体腔内のカルシウムを直接測定できることです。この手法の実演は、私の研究室の大学院生であるGabriela Ziomekが行います。この手順を開始するために、DMEMを用いてタンパク質混合物を1:25に希釈して準備します。次に、タンパク質混合物を含むDMEMを200 µLずつ各35 mmガラス底プレートに移し、底面のガラス円形部分を完全に覆います。プレートを安全キャビネット内で室温に少なくとも30分間静置します。その間に、10% NCSを含むDMEMをウォーターバスで37 °Cに温めておきます。その後、ガラスピペットを用いて培養フラスコからDMEMを除去します。続いて、残ったDMEMの残留物を除去するために、温めた滅菌PBSでフラスコ底面を洗浄します。培養した平滑筋細胞をフラスコ底面から剥離させるため、1 mLのトリプシンでフラスコを迅速に洗浄し、それを回収します。次に、トリプシンをさらに1 mL加えます。フラスコを取り出す前に、酵素がフラスコの底全体に接触するように、30〜60秒間ほどフラスコをゆすってください。トリプシンによって細胞が剥離したら、10% NCSを含む新鮮なDMEMをフラスコに加えてトリプシン反応を停止させます。得られた細胞懸濁液をフラスコから、ラベルを貼った清潔な50 milliliterコニカルチューブに移します。次に、準備する各プレートに、新鮮なDMEMに10 % NCSを加えたものを1 milliliterずつ加えます。その後、細胞懸濁液が入ったチューブをゆっくりと数回反転させ、形成された凝集塊を分散させます。緩やかに混ぜ合わせた細胞懸濁液の所定量を各プレートにピペッティングします。その後、各プレートを時計回りまたは反時計回りに十分に回転させ、底面のガラス上に細胞が均一に分散するようにします。効果的なイメージングを行うため、今後48時間で十分に高いコンフルエンシーに達するだけの細胞数をプレートに添加する必要があります。各プレートに培地と細胞懸濁液を添加した後、細胞がガラス底に適切に接着するように、37°C、5% CO₂条件下で少なくとも1時間インキュベートします。細胞が明確に接着するまで、15分間隔で顕微鏡を用いてプレートを確認してください。その後、-80°Cの保存庫からAdenovirus D1 SRのアリコートを取り出し、移動式アイスバスを用いて生物安全キャビネットまで搬送します。その後、冷却したD one SRを規定量ずつ各プレートにピペットで分注し、感染細胞を37°Cで一晩インキュベートします。翌日、1 mLの新鮮な10% NCS含有DMEMを細胞に補充します。その後、プレートを5% CO₂濃度の加湿インキュベーター内で37°Cにて一晩インキュベートします。一晩インキュベートした後、プレートから培養液を除去します。温めた生理的HEPES-PSS緩衝液1 mLを用いて、培養プレートを3回洗浄します。次に、記録の直前に、温めた新鮮なHEPES-PSS緩衝液1 mLを添加します。共焦点顕微鏡の関連ソフトウェアを開き、FRET SEアプリケーションを使用して初期イメージングを行います。アプリケーションが開いたら、セットアップタブをクリックして、目的の実験設定を調整します。チャンネル設定を手動で変更し、ドナーおよびFRET用に440 nanometers、アクセプター用に513 nanometersで細胞を順次励起させます。次に、ドナーの放出波長を488 nanometersに、FRETおよびアクセプターの放出波長を535 nanometersに設定します。続いて、光強度を透過率15 percentに設定し、細胞の励起露光時間を150 millisecond、露光間隔を10 secondに設定します。次に、プレートを顕微鏡ステージ上で固定します。ライブボタンを使用して画像解像度を確認します。目的の解像度になるよう、さらに設定を調整してください。セットアップタブで、キャプチャ画像ボタンを使用してサンプルの画像を撮影します。次に評価（Evaluation）タブに移動し、実施している実験に応じたFRET効率の算出方法を選択します。D1 SRインジケーターなどのカメレオン（Cameleons）を用いる実験には、レシオメトリック計算を使用する方法3が推奨されます。その後、グラフ（Graph）タブに切り替えて、記録されている強度値をグラフで確認します。必要に応じて、画像ビューア内でROI（関心領域）を描画し、グラフ上でその領域の平均強度の変化を確認します。記録を開始し、目的の薬剤を導入する前に安定したベースライン信号を確保するため、少なくとも3分間データを収集してください。その後、記録中の関心領域付近のプレート内に直接投与することで、SRカルシウムを枯渇させるためのカルシウム移動剤を導入します。処理後、任意の時間まで記録を継続します。その後、FRET SEアプリケーションを用い、共焦点倒立顕微鏡でレシオメトリックFRET連続画像をキャプチャします。このステップでは、ラット大動脈平滑筋細胞の培養プレートを準備するため、1 mLの温めた生理的HEPES-PSSバッファーで培養プレートを3回洗浄します。次に、インジケーターを1 mLの温めたHEPES-PSSと混合し、培養プレートに分注します。平滑筋細胞をインジケーターとともに室温で1時間インキュベートします。1時間後、培養プレートからインジケーターを除去し、1 mLの温めた生理的HEPES-PSS緩衝液で3回洗浄します。その後、記録の直前に、新鮮で温めたHEPES-PSS緩衝液を1 mL添加します。共焦点倒立顕微鏡を用いて連続画像をキャプチャします。続いて、SRカルシウムを枯渇させるためのツールとしてカルシウム移動剤を導入し、処置後、必要な時間だけ記録を継続します。ここでは、CFP、FRET、およびYFPのバンドパスフィルターを用いて、D one SRインジケーターをトランスフェクトした平滑筋細胞の代表的なスナップショットを示します。この図は、D one SRをトランスフェクトした培養ラット大動脈平滑筋細胞のリアルタイム擬似カラー・スナップショットです。2 µMのサプシガルジン（Thapsigargin）による処理では、シグナル強度の低下が認められ、これはサプシガルジン誘発性のカルシウム放出によるSRカルシウム含量の著しい減少を示しています。また、このグラフは、2 µMのサプシガルジンで処理した培養平滑筋細胞における標準化されたD one SR比の代表的なトレースであり、SRカルシウムの有意な減少が確認されました。以下は、細胞質カルシウムインジケーターを導入し、2 µMのタプシガリンで処理した培養ラット大動脈平滑筋細胞の代表的なスナップショットです。示されているように、タプシガリンはSRからのカルシウム放出により、細胞質内の信号強度を著しく上昇させます。また、このグラフは、2 µMのタプシガリンで処理した培養平滑筋細胞における、正規化されたFluo-4 AM比の代表的なトレースを示しています。ここに描かれたカルシウム信号の上昇は、SRから放出されたカルシウム量に比例すると考えられます。この手法に習熟すれば、適切に実施した場合、開始から終了まで約48時間で完了できます。本手順を実施する際は、カルシウムインジケーターでトランスフェクションを行う前に、細胞の健全性を確保するために記載された条件下で維持することが重要です。このビデオを視聴することで、D one SRインジケーターを用いてSR内腔のカルシウムレベルを測定するための、培養細胞の調製方法について明確に理解できるはずです。

measurement-calcium-fluctuations-within-sarcoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

カルシウムの信号は、遺伝子発現、生存と分化を含む多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす。ここでは、フラ-2回答を使用して、カルシウムのイメージングを実行する方法を示します。カルシウムイメージングでは、リアルタイムとシグナル伝達カスケードの調節における細胞内カルシウムの調節を研究する貴重なツールです。...

AMフラ-2を用いて皮質ニューロンのカルシウムイメージング

焦点のCa 2 +</sup平滑筋の>過渡検出

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

我々は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いた生細胞における遅いフラックスから（マイクロ秒）急激なカルシウムのイベントを分離する方法を提示する。方法は、細胞に数百画素のラインスキャンを記録することによって、カルシウムの指標の蛍光強度の変動を測定する。ヒストグラム解析により、異なるカルシウムフラックスの時間スケールを分離することができます。...

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

カルシウムは、多くの生理学的および病態生理学的なシグナル伝達経路に関与している。生細胞イメージングは​​、特殊な設備を必要とし、時間がかかる可能性がある。懸濁液中に持ち込ま付着上皮細胞における細胞質カルシウムの相対的変化を決定するために、フローサイトメーターを使用して迅速に、簡単な方法を最適化した。...

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

ここでは、Ca2+インジケーターをロードした無傷の哺乳類細胞で蛍光顕微鏡を使用して、局所的なIP3媒介Ca2+イベントをイメージングする技術と、これらのイベントの識別と分析を自動化するアルゴリズムを紹介します。...

イメージングローカルCA<sup&gt; 2+</sup&gt;培養哺乳動物細胞内シグナル

細胞内カルシウム リサイクル心筋収縮および拡張機能の調節に重要な役割を果たしています。ここでは、カルシウム イメージング システムにより筋小胞体 Ca2...

分離の心室心筋の筋小胞体カルシウム拡張予備能と細胞内のカルシウム除去の評価

我々は、リアルタイム蛍光顕微鏡法を用いて、HEK293および骨格筋C2C12細胞の小胞/筋小胞体（ER / SR）における急速なカルシウム過渡状態をモニタリングするための、標的遺伝子操作されたカルシウムインジケータ（GECI）CatchER + in situ K d測定および較正のためのプロトコルについても議論する。...

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング<sup&gt; 2+</sup&gt;センサーキャッチャー<sup&gt; +</sup

ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。...

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

プロトコルは、切断された神経を通してマウス運動神経終末に蛍光カルシウム色素をロードする方法を説明しています。さらに、共焦点顕微鏡を使用して末梢神経終末の高速カルシウム過渡現象を記録するためのユニークな方法が提示されます。...

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録

本プロトコールは、マウスの精密切断肺スライスを調製し、利用して、ほぼ in vivo環境における...

精密切断肺スライスを利用して気道・肺内動脈平滑筋の収縮調節を研究

学ぶ FRETベースの共焦点イメージングを用いて、血管平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動を直接測定する方法。この技術は細胞内カルシウム動態とERストレスの関係を解明するのに有用である。

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

さらに動画を探す