覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

この手順の全体的な目的は、覚醒状態の動物において、神経活性物質をマイクロイオントフォレーシス法で注入することにより、神経処理におけるシナプス入力の影響を操作することです。この手法は、神経伝達物質の役割や、それらが感覚刺激およびコーディングに及ぼす相互作用など、感覚系を用いた主要な機能の解明に役立ちます。この技術の最大の利点は、麻酔の影響を受けることなく、標的部位への局所的なシナプス入力を操作し、神経修飾系を研究できることです。

この手法は拘束されたマウスを用いて行われましたが、コウモリ、ラット、モルモットなどの他の哺乳類にも適用可能です。この手順を開始するには、タングステン線を切断用に特製したアライメントツールに配置します。線の緩い端を粘着テープで慎重に固定し、目的の長さに切断します。

次に、アライメントツールからタングステン線を剥がすために、テープをゆっくりと引き剥がします。この際、すべての線がテープに付着したままであることを確認してください。その後、テープを研磨済み真鍮製スピンドルに巻き付け、電気的接続が良好になるよう、線をスピンドルにしっかりと押し当てて固定します。

その後、スピンドルをワークステーション内の5 RPMモーターに接続します。スピンドルのアクセス角度は、エッチング溶液の表面に対して45度に設定します。続いて、ワイヤーの3分の1を溶液に浸します。

次に、カーボンロッド電極をエッチング液に浸し、回路を閉じます。ワークステーションの電源を入れ、スピンドルを回転させたら、電極とエッチング液に流れる電流を 250 milliamps に調整します。ワイヤーの先端を非常に鋭い点状にエッチングするため、電流が 200 milliamps まで低下した時点でチップのエッチングを停止してください。

次に、下端をモデリングクレイで塞いだホウケイ酸ガラスキャピラリーにワイヤーを挿入します。加熱コイルと吊り下げプランジャーを使用してピペットを保持します。顕微鏡下に配置する前に、ガラスで覆われたワイヤーをスライドグラスに固定します。

チップをセットし、ホウ酸ビーズの接点にピントを合わせます。次に、ビーズがわずかに溶けるまで加熱します。その後、ワイヤーチップを約 10 〜 15 µm 挿入し、加熱用ポテンショメータの電源を切ります。

ビーズが冷却されたら、電極の先端からガラスを取り除き、タングステンを露出させます。先端を約15 mmにするため、ポーラーを適切なパラメータに設定します。キャピラリーを引いて、先端が隔離された2本のピペットを作成します。

モデリングクレイを用いてポールピペットをスライドガラス上に固定し、細いハサミ、ピンセット、またはメスの平らな面を使用してその先端を折ります。電極とマルチバレル間の角度をわずかに調整し、より良好な接合とより細いアンサンブルを得られるようにします。顕微鏡下で、タングステン電極をマルチバレルの先端上に慎重に合わせます。

位置合わせが完了したら、電極を下げてマルチバレルに接触させます。上の2つのバレルの間の溝にフィットさせ、電極の先端がマルチバレルの先端から15〜20 micrometers突出するまでスライドさせます。次に、タングステンとマルチバレルの複合体の先端から約5 millimeters離れた位置に、光硬化性接着剤を少量塗布します。

マルチバレルチャネルの閉塞を防ぐため、接着剤がチップに到達しないようにし、青色LEDランプを用いて接着剤を硬化させます。次に、麻酔をかけた動物をヒートブランケットの上に置き、体温を38 °Cに維持します。その後、2本のイヤーバーとバイトバーを用いて、ステレオタキシックフレームで動物の頭部を固定します。続いて、眼球を保護するために眼科用ゲルを塗布します。次に、頭皮を剃毛し、ポビドンヨードを塗布して皮膚を消毒します。メスを用いて正中線に沿って切開し、頭蓋骨を露出させ、頭頂骨および後頭骨のより吻側部分を覆う骨膜を剥離します。

次に、頭蓋骨とヘッドポストの底部に光硬化性接着剤を薄く塗布します。10秒間待機した後、正中線に沿って頭頂骨の吻側領域にヘッドポストを配置します。青色光源を用いて接着剤を20秒間硬化させ、十分な接合強度を確保します。

次に、小さなドリルビットを使用して、ヘッドポストの基部の周囲と背後に2つの穴を開けます。ドリルで開けた穴に時計用ネジを挿入し、頭蓋骨とヘッドステージの間の追加の接点として機能させます。ネジを1回半回転させてしっかりと固定し、ピンセットで確認して緩んでいないかテストしてください。

次に、銀色の接地線の先端を3番目の穴に挿入し、硬膜に接触していることを確認します。耐水性シアノアクリレート接着剤を少量塗布し、電線を頭蓋骨に固定します。その後、ヘッドポストの底部、銀線の下部、およびネジを覆うように光硬化コンポジットを塗布し、ヘッドポストと頭蓋骨の接合部を補強します。

記録中のアクセスを確保するため、ラムダを超えて延長しないように注意し、青色光源を用いてコンポジットを硬化させます。次に、頭蓋骨への付着部近くにある後頸筋を牽引します。小型のトレパネーションドリルを用いて、ラムダ縫合の直下かつ正中線外側に円形の窓を開け、下丘を露出させます。

この手順では、動物の体をカスタムメイドのフォームクッション付き固定装置に安置します。ヘッドポストをステレオタキシックフレームに取り付けられたホルダーに固定してください。このタイミングで、動物に液状の報酬を与えるのが適切です。

次に、動物の体を綿のブランケットで覆い、プラスチック製の半円筒と粘着テープを用いて緩く固定します。柔軟なチップを備えたシリンジを使用して、選択した薬剤をバレルに充填します。マイクロマニピュレーターを用いて、マルチバレル電極をホルダーに設置します。

次に、各バレルにコード化されていない銀線を配置し、片端が溶液に接触し、もう一方の端がアクセス可能な状態にします。その後、それらの端をマイクロイオントフォレーシス装置に接続します。続いて、正極をタングステン電極の端に、接地端を硬膜に接触している銀線に接続します。

続いて、マルチバレル電極を移動させ、先端を脳表面に接触させます。脳組織の乾燥を防ぐため、加温した滅菌生理食塩水を投与してください。その時点で、シングルユニット活動を探索しながら、バレル先端からの薬剤漏出を避けるために保持電流を印加します。

神経活動の記録とガバジンのイオン導入による投与。ここでは、下丘で記録された4つのニューロンについて、ガバジンのマイクロイオン導入注射の前と最中における周波数応答領域を示している。黒い十字は、稀な音および反復的な音として提示するために選択された周波数を示している。

ここでは、ガバジン注入前および注入中に、応答領域を構築するために提示したすべての周波数および強度に対する神経応答の累積ペリスティミュラス時間ヒストグラムを示します。黒いバーは音の提示時間を表しています。また、ガバジン適用前および適用中に、稀に提示された周波数を赤色で、繰り返し提示された刺激を青色で示した、一対の周波数に対するスパイク応答のドットラスター図を示します。

網掛け部分は刺激の持続時間を表しています。これらのドットラスタは、パラ周波数の相対的な確率を切り替えた際の応答を示しています。このグラフは、gabazine投与前および投与中に、稀な音と反復的な音として提示された7組の周波数に対する単一ニューロンの応答を示しています。

このグラフは、ガバジン投与前および投与中の、希有音および反復音に対する神経反応のSSA指数を示しています。上述の手順を習得すれば、目的とする神経構造やニューロンの種類に応じて、特定のパラメータを調整することが可能です。頭部固定動物での記録を行う際は、記録時間は動物の慣化レベルによって決定され、制限されるという点に留意することが極めて重要です。しかし、重要な利点として、同一の動物を用いて数日間にわたり複数回の記録が可能であり、使用する動物数を最小限に抑えられることが挙げられます。

ピギーバック電極を用いたマイクロイオン導入法を行うことで、ニューラルトランジスタの注入などの他の手法を組み合わせることができ、記録部位にあるニューロンの入力源や投射標的といった追加の疑問を解消することが可能です。覚醒動物を用いる際に極めて重要なのは動物の福祉であるため、プロトコルで承認された想起時間を決して超えないようにし、不快感の兆候がないか常にモニタリングしてください。もし兆候が見られた場合は、直ちに記録を停止しなければなりません。