覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

この手順の全体的な目標は、覚醒している動物に神経活性物質のマイクロイオントフォレティック注射を使用して、ニューロン処理のシナプス入力の影響を操作することです。この方法は、神経伝達物質の役割や、感覚刺激やコーディングにおけるそれらの相互作用などの感覚システムを使用して、主要な機能を解きほぐすのに役立ちます。この技術の主な利点は、麻酔の影響を受けずに、タブへの局所的な共鳴入力の操作とニューロン調節システムの研究を可能にすることです。

この放蕩息子は拘束されたマウスにいましたが、コウモリ、ラット、モルモットなどの他の哺乳類にも使用できます。この手順を開始するには、タングステンワイヤーをカスタムビルドの位置合わせツールに配置して切断します。ワイヤーの緩い端を粘着テープで慎重に取り付け、希望の長さにカットします。

次に、テープをそっと引っ張って、位置合わせツールからタングステンワイヤーを取り外します。すべてのワイヤーがテープに取り付けられたままであることを確認します。次に、テープを磨かれた真鍮のスピンドルに巻き、ワイヤーをスピンドルにしっかりと保持して、電気的接続が良好になるようにします。

その後、スピンドルをワークステーションの5RPMモーターに接続します。スピンドルアクセスは、エッチング溶液の表面に対して45度の角度が付けられています。その後、ワイヤーの3分の1を溶液に浸します。

次に、カーボンロッド電極をエッチングバスに浸して回路を閉じます。ワークステーションの電源を入れてスピンドルが回転し始め、電極とエッチング溶液を通過する電流を250ミリアンペアに調整します。電流が200ミリアンペアに下がったら、ワイヤチップを非常に細かい点にエッチングするために、チップエッチングを停止します。

次に、ホウケイ酸ガラスキャピラリーにワイヤーを配置し、その下端をモデリングクレイでブロックします。ヒーティングコイルと吊り下げられたプランジャーを使用してピペットを保持します。ガラスで覆われたワイヤーをスライドに固定してから、顕微鏡の下に置きます。

先端をセットし、ホウ素ビーズにピントを合わせて触れます。次に、ビーズがわずかに溶けるまで加熱します。その後、ワイヤーチップを約10〜15ミクロン挿入し、加熱ポテンショメータをオフにします。

ビーズが冷めたら、電極の先端からガラスを取り外してタングステンを露出させます。約 15 mm の先端を得るには、極性を適切なパラメーターに設定します。キャピラリーを引っ張ると、先端が隠された状態で2つのピペットが得られます。

モデリング粘土を使用してスライドにポールピペットを取り付け、細いはさみ、鉗子、またはメスの平らな面を使用してその先端を壊します。電極とマルチバレルの間の角度をわずかに調整して、より良い接合とより薄いアンサンブルを取得します。顕微鏡下で、タングステン電極をマルチバレルチップに慎重に合わせます。

位置合わせが完了したら、電極がマルチバレルに接触するまで電極を下げます。2つの上部バレルの間の溝にはめ込み、電極の先端をスライドさせて、マルチバレルの先端から15〜20マイクロメートル突き出ます。次に、タングステンとマルチバレルアンサンブルの先端から約5ミリメートル離れた場所に、光硬化性接着剤を少量滴下します。

マルチバレルチャネルを塞がないように、接着剤が先端に到達しないようにし、青色光LEDランプを使用して接着剤を硬化させます 次に、麻酔をかけた動物を加熱ブランケットの上に置いて、温度を摂氏38度に維持し、2つのイヤーバーとバイトバーを備えた定位固定装置フレームで動物の頭を安定させます次に、眼科用ジェルを塗布して目を保護します。次に、頭皮を剃り、ポビドンヨードを塗って皮膚を消毒します。メスを使用して、正中線に沿って切開を行い、頭蓋骨を露出させ、後頭骨の周囲およびより吻側部分を覆うペラスターを引っ込めます。

次に、頭蓋骨とヘッドポストの基部に光硬化型接着剤の薄い層を塗布します。10秒待ってから、ヘッドポストを正中線に沿って頭頂骨の吻側領域に置きます。青色光源を使用して接着剤を20秒間硬化させ、効果的な接着強度を実現します。

次に、小さなドリルビットを使用して、ヘッドポストの基部の周囲と後ろに2つの穴を開けます。ドリル穴に時計ネジを取り付けて、頭蓋骨とヘッドステージの間の追加の接点として機能します。ネジをぴったりとフィットさせるために1回転半をし、鉗子でテストして緩んでいないことを確認します。

次に、銀色のアース線の先端を3番目の穴に挿入し、硬膜に接触していることを確認します。耐水性のシアノアクリレート接着剤を少量塗布して、ワイヤーを頭蓋骨に結合します。その後、光硬化型複合材を塗布して、ヘッドポストの基部、銀線の下部、ネジを覆うことにより、ヘッドポストと頭蓋骨の結合を補強します。

記録中にアクセスを許可し、青色光源を使用してコンポジットを硬化させるために、ラムダを超えて拡張しないように注意してください。次に、頭蓋骨に挿入されている近くの首の後ろの筋肉を引っ込めます。小さなトレフィンを使用して、ラムダ縫合糸のすぐ下と正中線の外側に丸い窓を開けて、下丘を露出させます。

この手順では、動物の体をカスタムメイドのフォームクッション付きレストレインに入れます。ヘッドポストを脳定位固定装置フレームに取り付けられたホルダーに固定します。これは、動物に液体の報酬を与えるのに良い時期です。

次に、動物の体を綿の毛布で覆い、プラスチック製の半シリンダーと粘着テープを使用してゆるく固定します。先端が柔軟なシリンジを使用して、選択した薬をバレルに充填します。マイクロマニピュレーターを使用して、マルチバレル電極をホルダーに置きます。

次に、コード化されていない銀線を各バレルの内側に配置して、一方の端が溶液に接触し、もう一方の端にアクセスできるようにします。次に、それらの端をマイクロイオントフォレーシスデバイスに接続します。その後、プラス端子をタングステン電極の端に接続し、アース端子をデュラに接触する銀線に接続します。

その後、先端が脳の表面に接触するまでマルチバレル電極を動かします。脳組織の乾燥を防ぐために、温かい滅菌生理食塩水を適用します。その時点で、バレル先端からの薬物漏れを避けるために保持電流を印加しながら、単一ユニットの活動を探します。

ガバジンの神経活動とイオントフォレティックアプリケーションを記録します。ここに示されているのは、ガバジンのマイクロイオントフォレティック注射前と注射中の下丘に記録された4つのニューロンの周波数応答領域です。黒い十字は、周波数がまれで反復的な音として提示されるように選択されたことを示しています。

ここでは、ガバジンの注射前および注射中の応答領域を構築するために提示されたすべての周波数および強度に対する神経応答の蓄積された刺激時間ヒストグラムです。黒いバーは音の持続時間を示しています。これは、ガバジンの適用前および適用中に赤でまれに、青で反復刺激として提示される周波数のペアに対するスパイク応答のドットラスターです。

影付きの背景は、刺激の持続時間を示しています。これらのドット ラスターは、パラ周波数の相対確率が入れ替わったときの応答を示しています。このグラフは、ガバジンの適用前と適用中にまれで反復的な音として提示される7対の周波数に対する単一のニューロンの応答を示しています。

そして、このグラフは、ガバジンの適用前と適用中に測定されたまれで反復的な音に対する神経応答のSSAインデックスを示しています。一度習得すると、説明された手順により、関心のあるニューロンの神経構造とタイプに応じて特定のパラメータを調整できます。ヘッドレスト動物の記録を試みる際には、記録時間は動物の慣れのレベルによって決定され制限されることを覚えておくことが重要ですが、重要な利点は、同じ動物に対して複数の記録切開を数日間行うことができ、使用する動物の数を最小限に抑えることができることです。

ピギーバック電極を使用してマイクロイオントフォレティックを行うことにより、ニューラルトランジスタの注入などの他の手順を組み合わせて、入力源や記録部位内のニューロンの投影ターゲットなどの追加の質問に答えることができます。覚醒している動物と仕事をする際の重要な問題は、彼らの健康状態ですので、プロトコルで承認されたリコール時間を超えないようにし、不快感の兆候がないか常に監視してください。その場合は、すぐに録音を停止する必要があります。