Name: 覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学ぶマイクロイオントフォレシス法で覚醒マウスの神経活動を細胞外記録し、神経伝達物質の役割を解析する手法。局所シナプス入力の操作と感覚処理における神経調節系の理解に有用です。

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MINECOによって資金を供給されたこのプロジェクトは、BFU201343608-PとPSI2013-49348-EXP、およびARPにMSMとMRCコア資金へのJCYLグラントSA343U14を付与します。 YAAはCONACyT（216106）と9月の交わりを開催しました。

<ol><li>Harris, K. D., Thiele, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+state+and+attention%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical state and attention.</a> Nat Rev Neurosci. 12 (9), 509-523 (2011).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

覚醒した動物における神経活性物質のmicroiontophoresisは、プローブと単一ニューロン40,41の活性に特定のシナプス入力の役割を分析するための強力な手法です。さらに重要なのは、この手順では、麻酔薬の潜在的な干渉なしに神経回路上の神経伝達物質および神経調節物質の影響の決意を可能にします。ここで、我々は目を覚ましたマウスのICでgabazineのアプリケーションはロバスト周波数同調（ 図4A）、時間応答パターン（ 図4B）およびSSA（ 図5）に変更することを示しています。 記載された手順の主な制限は、レコーディング・セッションに動物の慣れのレベルによって決定され、比較的短い記録時間（〜3時間）、です。一方、複数の記録セッションは、同じ動物で行うことができます。 microiontophoresisを使用すると、それがどの程度まで不明です適用される神経刺激性物質が周囲の組織に拡散します。したがって、神経回路網の活動上の可能な効果が記録されたニューロン...

神経興奮と抑制の相互作用は、感覚情報1を処理するための基本です。また、麻酔は、皮質の活性化およびシナプス入力2,3の時間パターンの動態に強い影響を有することが知られています。例えば、麻酔薬は皮質ニューロン3,4における視覚誘発反応の持続時間を変化させることが観察されています。また、興奮性と抑制性シナプス入力間 ​​の比率は、両方の誘発と自発的活動率6,7を変更すること、麻酔し、覚醒した動物で4,5異なります。覚醒中に、阻害は励起よりも強かったのに対し、シナプスのコンダクタンスを測定することにより、ハイダーや同僚4は阻害が麻酔下での振幅で励起と一致したことがわかりました。これらの知見は、覚醒動物における感覚処理に関する特定のシナプス入力の影響を研究するための実験手順の開発を促します。 &lt;Pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;（NAのオーダーの）小電流注入を適用することにより、帯電した神経活性物質の制御放出は、広くシナプス入力の寄与と感覚処理8-13で推定細胞受容体の役割を研究するために使用されてきました。 microiontophoresisと呼ばれるこの技術は、迅速かつ閉じ込め効果に寄与する記録ニューロンの近傍に薬剤の適用を可能にします。この手順は、全身注射、微小透析または光遺伝学技術の使用など、他の実験操作によって誘発される広範囲の効果と比較して、神経活性物質の局所作用を研究するために、より適しています。通常、ピギーバック電極構造14,15は、同時に標的ニューロンを記録し、関心の神経活性物質を送達するために使用されます。これは、神経活性物質を運ぶmultibarrelピペットに装着された記録電極から構成されています。 Oの修正HaveyとCaspary 14によって説明riginal手順が実施されてきました。例えば、タングステン電極の代わりにガラスの一つは、神経活動16を記録するために使用することができます。記録の要件を満たすためにタングステン線のヒント、ガラス絶縁、および先端露出の調整の電解エッチング：タングステン電極17,18の製造のための以前に公表された方法は、3つの一般的なステップを伴います。 聴覚神経科学における興味深いと緊急フィールドは、刺激固有の適応（SSA 19）の研究です。 SSAは、他の、めったに提示しない音に一般化されていない反復的な音に神経応答の特定の減少です。 SSAの重要性は、聴覚脳内の逸脱検出の基礎となる神経機構としての潜在的な役割に存在するだけでなく、聴覚の後期ミスマッチ陰性コンポーネントの可能性の神経相関は、潜在的な20,21を誘発しました。 SSA O聴覚皮質19,22-24までICからccurs。 GABA媒介阻害はまた、麻酔26の影響を受けることが示されたSSA 7,16,25の利得制御機構として作用することが実証されています。ここでは、前と覚醒したマウスにおけるGABA A -受容体の選択的アンタゴニストの適用中にICニューロンのシングルユニット活動を記録するために前述の方法を組み合わせたプロトコルを提示します。まず、ピギーバック電極と次の、外科的および記録方法の製造を説明します。薬物放出の有効性を試験するために、我々は受容野と同様に前とgabazineのmicroiontophoretic排出中のICニューロンのSSAのレベルを比較しました。

<table><tbody><tr><td>タングステンワイヤー</td><td>ハーバード装置株式会社</td><td>33-0099</td><td>0.005インチx 3インチ</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus LTD</td><td>30-0053</td>フィ<td>ラメントなしのホウケイ酸標準壁、外径1.5 mm、内径0.86 mm、長さ100 mm</td></tr><tr><td>のマルチバレルガラスキャピラリー&nbsp;</td><td>ワールド精密機器</td><td>5B120F-4&nbsp;</td><td>5バレルキャピラリー、長さ4インチ、外径1.2 mm、フィラメント付き</td></tr><tr><td>Diaplus</td><td>DiaDent</td><td>2001-2101</td><td>ガラス製マルチバレルピペットにタングステン電極を取り付けるために使用される光硬化型接着剤</td></tr><tr><td>G-Bond</td><td>GC Corporation</td><td>2277</td><td>動物の頭蓋骨にヘッドポストを取り付けるために使用される光硬化型接着剤</td></tr><tr><td>カリスマ性</td><td>ヘレウス・クルツァー</td><td>66000087</td><td>ヘッドポストと頭蓋骨の結合を強化するために使用される光硬化型複合材料</td></tr><tr><td>Araldit Cristal</td><td>ガラスマルチバレルピペットへのタングステン電極の取り付けをさらに固定するために使用される</td><td>Ceys</td><td></td> 2成分エポキシ</tr><tr><td>加熱ブランケット</td><td>Cibertec</td><td>RTC1</td><td></td></tr><tr><td>定位フレーム</td><td>成重</td><td>SR-6N</td><td>マウス用改造</td></tr><tr><td>マイクロイオン導入装置</td><td>ハーバード装置株式会社</td><td>ニューロフォア BH-2</td><td>IP-2イオントフォレーシスポンプ(薬物送達チャネルごとに1つ)とバランスモジュールを含む</td></tr><tr><td>マルチバレルガラスピペットプーラー</td><td>成茂</td><td>モデル PE-21</td><td></td></tr><tr><td>LEDランプ</td><td>テクノフラックス</td><td>CV-215</td><td>5 W、430-485 nm</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>フレキシブルプラスチックニードル、34 AWG</td></tr><tr><td>Imalgene</td><td>Merial</td><td></td><td>Ketamine、100 mg / mL</td></tr><tr><td>ロンプン</td><td>バイエル</td><td></td><td>キシラジン、20 mg/mL</td></tr><tr><td>ガバジン / SR-95531</td><td>シグマ</td><td>S106</td><td>準備 ~ 1000&micro;20 mMガバジンを蒸留水に溶かし、pHを4に調整します</td></tr></tbody></table>

覚醒マウスにおける神経活性物質のmicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

神経伝達物質および神経修飾物質、その結果、異なる神経応答の活性の違いは、麻酔をかけたと目を覚ました動物との間で見つけることができます。したがって、覚醒した動物におけるシナプスのシステムの操作を可能にする方法は、麻酔薬による影響を受けないニューロンの処理にシナプス入力の寄与を決定するために必要とされます。ここでは、同時に細胞外神経活動を記録し、覚醒マウスにおける記録部位の近傍に複数の神経活性物質を放出するための電極を構成するための方法を提示します。これらの手順を組み合わせることで、我々は選択的に頭拘束マウスの下丘のニューロンでGABA A受容体をブロックするgabazineのmicroiontophoretic注射を行いました。 Gabazineに成功し、このような周波数応答領域と刺激固有の適応などの神経応答のプロパティを変更しました。したがって、我々は我々の方法はrecordinに適していることを示していますグラムシングルユニット活動と聴覚処理中の特定の神経伝達物質受容体の役割を解剖するため。 記載された手順の主な制限は、レコーディング・セッションに動物の慣れのレベルによって決定され、比較的短い記録時間（〜3時間）、です。一方、複数の記録セッションは、同じ動物で行うことができます。 （例えば全身注射または光遺伝学モデルの使用など）、神経伝達や神経調節のレベルを操作するために使用される他の実験手順に対するこの技術の利点は、薬剤の効果は、ターゲットニューロンにローカルシナプス入力に限定されていることです。また、電極のカスタム製造は、（例えば、録画の信号対雑音比を改善するためのチップ抵抗等の）関心のニューロンの神経構造や種類に応じて、特定のパラメータの調整を可能にします。

私たちは、ICの4よく分離されたニューロンのシングルユニット活動を記録しました。覚醒マウスにおける細胞外記録中に得られた代表的な信号対雑音比は、 図3Bに示されている。 図4Aは、前及びGABA Aの遮断がgabazineで-受容体の間に各ニューロンの周波数応答領域（FRA）を示します。応答の強さ（スパイク/刺激）と同様に、スペクトルのチューニングの広がりの増加が観察されました。誘発反応の増加は、（ 図4B）提示されたすべての周波数および強度に神経応答から得られた累積周囲の刺激時間のヒストグラムにも明らかでした。 ニューロンのFRA（ 図4Aの×印）内の周波数のうちの1つまたは2ペアはsに、変わり者パラダイムにおける反復又は希音として提示されるために選択されましたそれらの応答におけるSSAのレベル...

覚醒マウスにおいて、細胞外神経活動を同時に記録し、記録部位付近で複数の神経活性物質を放出する電極の構築方法を提示します。この技術により、目的のニューロンへの推定される局所シナプス入力の詳細な分析が可能になります。

覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

この手順の全体的な目的は、覚醒状態の動物において、神経活性物質をマイクロイオントフォレーシス法で注入することにより、神経処理におけるシナプス入力の影響を操作することです。この手法は、神経伝達物質の役割や、それらが感覚刺激およびコーディングに及ぼす相互作用など、感覚系を用いた主要な機能の解明に役立ちます。この技術の最大の利点は、麻酔の影響を受けることなく、標的部位への局所的なシナプス入力を操作し、神経修飾系を研究できることです。この手法は拘束されたマウスを用いて行われましたが、コウモリ、ラット、モルモットなどの他の哺乳類にも適用可能です。この手順を開始するには、タングステン線を切断用に特製したアライメントツールに配置します。線の緩い端を粘着テープで慎重に固定し、目的の長さに切断します。次に、アライメントツールからタングステン線を剥がすために、テープをゆっくりと引き剥がします。この際、すべての線がテープに付着したままであることを確認してください。その後、テープを研磨済み真鍮製スピンドルに巻き付け、電気的接続が良好になるよう、線をスピンドルにしっかりと押し当てて固定します。その後、スピンドルをワークステーション内の5 RPMモーターに接続します。スピンドルのアクセス角度は、エッチング溶液の表面に対して45度に設定します。続いて、ワイヤーの3分の1を溶液に浸します。次に、カーボンロッド電極をエッチング液に浸し、回路を閉じます。ワークステーションの電源を入れ、スピンドルを回転させたら、電極とエッチング液に流れる電流を 250 milliamps に調整します。ワイヤーの先端を非常に鋭い点状にエッチングするため、電流が 200 milliamps まで低下した時点でチップのエッチングを停止してください。次に、下端をモデリングクレイで塞いだホウケイ酸ガラスキャピラリーにワイヤーを挿入します。加熱コイルと吊り下げプランジャーを使用してピペットを保持します。顕微鏡下に配置する前に、ガラスで覆われたワイヤーをスライドグラスに固定します。チップをセットし、ホウ酸ビーズの接点にピントを合わせます。次に、ビーズがわずかに溶けるまで加熱します。その後、ワイヤーチップを約 10 〜 15 µm 挿入し、加熱用ポテンショメータの電源を切ります。ビーズが冷却されたら、電極の先端からガラスを取り除き、タングステンを露出させます。先端を約15 mmにするため、ポーラーを適切なパラメータに設定します。キャピラリーを引いて、先端が隔離された2本のピペットを作成します。モデリングクレイを用いてポールピペットをスライドガラス上に固定し、細いハサミ、ピンセット、またはメスの平らな面を使用してその先端を折ります。電極とマルチバレル間の角度をわずかに調整し、より良好な接合とより細いアンサンブルを得られるようにします。顕微鏡下で、タングステン電極をマルチバレルの先端上に慎重に合わせます。位置合わせが完了したら、電極を下げてマルチバレルに接触させます。上の2つのバレルの間の溝にフィットさせ、電極の先端がマルチバレルの先端から15〜20 micrometers突出するまでスライドさせます。次に、タングステンとマルチバレルの複合体の先端から約5 millimeters離れた位置に、光硬化性接着剤を少量塗布します。マルチバレルチャネルの閉塞を防ぐため、接着剤がチップに到達しないようにし、青色LEDランプを用いて接着剤を硬化させます。次に、麻酔をかけた動物をヒートブランケットの上に置き、体温を38 °Cに維持します。その後、2本のイヤーバーとバイトバーを用いて、ステレオタキシックフレームで動物の頭部を固定します。続いて、眼球を保護するために眼科用ゲルを塗布します。次に、頭皮を剃毛し、ポビドンヨードを塗布して皮膚を消毒します。メスを用いて正中線に沿って切開し、頭蓋骨を露出させ、頭頂骨および後頭骨のより吻側部分を覆う骨膜を剥離します。次に、頭蓋骨とヘッドポストの底部に光硬化性接着剤を薄く塗布します。10秒間待機した後、正中線に沿って頭頂骨の吻側領域にヘッドポストを配置します。青色光源を用いて接着剤を20秒間硬化させ、十分な接合強度を確保します。次に、小さなドリルビットを使用して、ヘッドポストの基部の周囲と背後に2つの穴を開けます。ドリルで開けた穴に時計用ネジを挿入し、頭蓋骨とヘッドステージの間の追加の接点として機能させます。ネジを1回半回転させてしっかりと固定し、ピンセットで確認して緩んでいないかテストしてください。次に、銀色の接地線の先端を3番目の穴に挿入し、硬膜に接触していることを確認します。耐水性シアノアクリレート接着剤を少量塗布し、電線を頭蓋骨に固定します。その後、ヘッドポストの底部、銀線の下部、およびネジを覆うように光硬化コンポジットを塗布し、ヘッドポストと頭蓋骨の接合部を補強します。記録中のアクセスを確保するため、ラムダを超えて延長しないように注意し、青色光源を用いてコンポジットを硬化させます。次に、頭蓋骨への付着部近くにある後頸筋を牽引します。小型のトレパネーションドリルを用いて、ラムダ縫合の直下かつ正中線外側に円形の窓を開け、下丘を露出させます。この手順では、動物の体をカスタムメイドのフォームクッション付き固定装置に安置します。ヘッドポストをステレオタキシックフレームに取り付けられたホルダーに固定してください。このタイミングで、動物に液状の報酬を与えるのが適切です。次に、動物の体を綿のブランケットで覆い、プラスチック製の半円筒と粘着テープを用いて緩く固定します。柔軟なチップを備えたシリンジを使用して、選択した薬剤をバレルに充填します。マイクロマニピュレーターを用いて、マルチバレル電極をホルダーに設置します。次に、各バレルにコード化されていない銀線を配置し、片端が溶液に接触し、もう一方の端がアクセス可能な状態にします。その後、それらの端をマイクロイオントフォレーシス装置に接続します。続いて、正極をタングステン電極の端に、接地端を硬膜に接触している銀線に接続します。続いて、マルチバレル電極を移動させ、先端を脳表面に接触させます。脳組織の乾燥を防ぐため、加温した滅菌生理食塩水を投与してください。その時点で、シングルユニット活動を探索しながら、バレル先端からの薬剤漏出を避けるために保持電流を印加します。神経活動の記録とガバジンのイオン導入による投与。ここでは、下丘で記録された4つのニューロンについて、ガバジンのマイクロイオン導入注射の前と最中における周波数応答領域を示している。黒い十字は、稀な音および反復的な音として提示するために選択された周波数を示している。ここでは、ガバジン注入前および注入中に、応答領域を構築するために提示したすべての周波数および強度に対する神経応答の累積ペリスティミュラス時間ヒストグラムを示します。黒いバーは音の提示時間を表しています。また、ガバジン適用前および適用中に、稀に提示された周波数を赤色で、繰り返し提示された刺激を青色で示した、一対の周波数に対するスパイク応答のドットラスター図を示します。網掛け部分は刺激の持続時間を表しています。これらのドットラスタは、パラ周波数の相対的な確率を切り替えた際の応答を示しています。このグラフは、gabazine投与前および投与中に、稀な音と反復的な音として提示された7組の周波数に対する単一ニューロンの応答を示しています。このグラフは、ガバジン投与前および投与中の、希有音および反復音に対する神経反応のSSA指数を示しています。上述の手順を習得すれば、目的とする神経構造やニューロンの種類に応じて、特定のパラメータを調整することが可能です。頭部固定動物での記録を行う際は、記録時間は動物の慣化レベルによって決定され、制限されるという点に留意することが極めて重要です。しかし、重要な利点として、同一の動物を用いて数日間にわたり複数回の記録が可能であり、使用する動物数を最小限に抑えられることが挙げられます。ピギーバック電極を用いたマイクロイオン導入法を行うことで、ニューラルトランジスタの注入などの他の手法を組み合わせることができ、記録部位にあるニューロンの入力源や投射標的といった追加の疑問を解消することが可能です。覚醒動物を用いる際に極めて重要なのは動物の福祉であるため、プロトコルで承認された想起時間を決して超えないようにし、不快感の兆候がないか常にモニタリングしてください。もし兆候が見られた場合は、直ちに記録を停止しなければなりません。

extracellular-recording-neuronal-activity-combined-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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覚醒ラットの神経活動の精密マッピングのための傍細胞記録と染色

出典: Lai, J., et al. げっ歯類脳における電気生理学的記録と抑制剤のマイクロインジェクションの同時投与J. Vis.

ラットにおける神経活動の阻害とその電気生理学を用いた検出

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アラート、頭部拘束ラットの皮質下脳構造内の単一ニューロンのJuxtacellular監視とローカリゼーション

この方法では、マウスは顕微鏡イメージングや動物の頭をしっかり固定を必要とする単一セルの電気生理学的記録、中に移動し、探索するための具体的な、使い慣れた環境を作成します。...

フラットの床の空輸プラットフォーム：げっ歯類の移動自由アウェイクに顕微鏡または電気生理学と行動を組み合わせるための新しい方法

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自由に動くマウスにおけるマルチチャンネル細胞外記録

ミリサイズのコイルと組み合わせた低コスト脳波記録システムにより、マウス脳をin vivoで経頭的に刺激する

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覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

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