方法は、標的とマウスにおけるアイソ気道-神経支配感覚ニューロンへ

この実験の全体的な目的は、迷走神経の気道神経支配ノードースニューロンを標識し、単離することです。この手法は、気道支配ニューロンがどのような識別特性を持つかなど、末梢神経生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。

本手法の主な利点は、特定の神経細胞集団を標的として単離するための、堅牢かつハイスループットな方法を提供することです。感覚神経節を回収した後、神経節を乱さないように、各チューブから500 µLの神経節解離溶液を吸引します。次に、各サンプルに1 mLのPBSを加え、神経節がチューブの底に沈殿するまで待ちます。

次に、PBSを除去し、消化酵素を添加した神経節解離液を1 mLニューロンに加えます。続いて、ポジティブコントロールチューブにFast Blueを20 µL添加します。消化酵素の有効期間に応じた適切な時間、チューブを37 °Cでインキュベートします。その際、神経節が消化液に完全に浸っていることを確認するため、15分ごとに短時間チューブを振ったり、軽く叩いたりします。

神経細胞を消化させている間に、サンプルごとに1本の1.5 mLチューブへ、あらかじめ調製した12%密度溶液400 µLを、28%密度溶液400 µLの上にゆっくりと慎重に加えます。これにより、濃淡の異なる2つの層が明確に確認できるはずです。次に、ソーティング用の1.5 mL回収チューブにラベルを貼ります。ソーティングサンプルごとに、Fast Blue陽性用とFast Blue陰性用のチューブを1本ずつ用意してください。

消化期間の終了後、消化酵素を廃棄し、先ほど示したように1 mLのPBSで神経節を2回洗浄します。2回目の洗浄後、各チューブに200 µLの新鮮な神経節解離溶液を加えます。次に、200 µLピペットを100 µLに設定し、気泡が入らないように注意しながら、神経節を数回ピペッティングして細胞を単一細胞懸濁液に解離させます。

無傷の組織片が見えなくなったら、70 micronのセルストレーナーを片手でしっかりと保持し、解離させた細胞溶液をストレーナーの中央にピペットで滴下します。次に、解離チューブを100 µLの新鮮な神経節解離溶液で洗浄し、残っている細胞を回収します。洗浄液をストレーナーでろ過し、新しいピペットチップを使用してストレーナーの下面に残っている細胞を含む溶液を吸引し、細胞懸濁液に加えます。

次に、300 µLの細胞を、あらかじめ調製しておいた密度勾配の上に慎重に重層します。そして、遠心分離によって神経節細胞を回収します。遠心分離の間に、ソート時のシース液によって溶解バッファーが大幅に希釈されないように、Fast Blue陽性回収チューブに調製直後の溶解バッファーを300 µL、陰性回収チューブに600 µL加えます。

遠心分離の終了後、細胞残渣の大部分を含む上層の 700 microliters の溶液を慎重に取り除きます。次に、残った細胞に 700 microliters の新鮮な神経節解離溶液を加えて混合します。遠心分離により細胞をペレット化し、上清を慎重に捨てます。

次に、1,000 µLピペットを200 µLに設定し、200～300 µLの神経節解離ソート用溶液で細胞を再懸濁します。そして、ソートの準備が整うまで細胞を氷上に置きます。FACSで神経節細胞を精製した後、溶解バッファー中でニューロンを1分間ボルテックスして均質化します。

次に、細胞を等量の70% ethanolで数回混合し、サンプルの最大700 microlitersをスピンカラムに転移させます。マイクロ遠心機を用いて、カラムを8, 000 x gで15秒間遠心分離し、ろ液を廃棄します。サンプル全体がスピンカラムを通過した後、標準的なRNA精製プロトコルに従ってRNAを抽出します。

次に、製造元の規定に従って、マイクロ流体電気泳動システムを用いてRNAの品質を試験します。これらのグラフには、ソーティングゲートの設定に使用されたFast Blueの陰性および陽性コントロールが示されています。これにより、解離させたFast Blue標識Nodose細胞を、Fast Blue陽性群とFast Blue陰性群に分取することができます。

この手法の分取効率は73〜85%であり、平均してFast Blue陽性細胞が約1,500個以下、Fast Blue陰性細胞が約60,000個回収されます。この代表的なサンプルで観察されたように、マイクロ流体電気泳動で得られた18Sおよび28Sのピークを用いてRNAインテグリティナンバーを算出し、抽出したRNAの品質を判定できます。習熟し、適切に実施すれば、この技術は4時間半で完了させることが可能です。

この手順を行う際は、各ステップを迅速に進めること、およびRNA抽出には調製直後の新鮮な溶液を使用することが重要です。本手順の後、神経細胞培養などの他の手法を組み合わせることで、「気道神経支配ニューロンに特有の機能的特性は何か」といった追加の疑問を明らかにすることができます。この技術の開発により、末梢神経生物学分野の研究者は、迷走神経の結節神経節における特定の気道神経支配ニューロン集団の固有の特性を探索することが可能となりました。

このビデオを視聴することで、nodose ganglia（結節神経節）の特定のニューロンを標識および解離させ、RNAシーケンシングに使用したり、機能研究のために播種したりする方法について十分に理解できるはずです。2-Mercaptoethanolを取り扱う際は極めて危険であるため、この化合物をh使用するときは常に手袋の着用や化学薬品用フード内での作業などの予防措置を講じることを忘れないでください。