Name: Marginating-肝白血球の選択的ハーベスティング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶ マージネーティング肝白血球の選択的ハーベスティング法。マウスまたはラットの肝臓から強制灌流により肝洞に付着する免疫細胞を単離し、他の白血球集団とは異なる独自の免疫学的機能を研究する。この技術は肝疾患や転移の理解に貢献する。

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著者とこの研究は、NIH/NCI助成金#R01CA172138（SBEへ）の支援を受けました。

倫理文：動物を対象とする手順は、テルアビブ大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 1.ラットプロトコル<ol><li>準備<ol><li>ヘパリン化PBS（30単位/ ml）溶液を調製し、リン酸1ml当たり防腐剤フリーのヘパリン30単位を添加することにより、室温（RT）で使用されるように、生理食塩水（PBS）1×緩衝溶液。動物当たり35ミリリットルを計算します。 </li><li>気泡を除去するために蠕動ポンプラインと蝶の針を介して、ヘパリン化PBSを渡します。 </li><li> （重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブ）はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、2止血、および歯組織鉗子 - 手術器具を滅菌します。 </li></ol></li><li> MH-白血球の肝臓とコレクションの灌流<ol><li> 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。念のため、イソフルランを含む50 mlチューブを配置その胸腔を開くまで、ラットの頭の周り-soakedパッド。 </li><li>呼吸の停止直後に肝臓や心肺複合体を露出させるために腹膜と胸の空洞を開きます。このプロセスを通じて出血は避けてください。 <ol><li>具体的には、内臓に損傷を与えることなく、下腹部正中ポイントで切開を開始し、斜めリブに向かって両側に進展、上胸部キャビティレベルにそれらを切断します。 </li></ol></li><li>約分以内に、注射器に右心室から（250グラムの動物から〜6ミリリットル）できるだけ多くの血液を採取。 </li><li>灌流液の収集を可能にするために、心臓にできるだけ近い止血剤と尾部大静脈をクランプします。 </li><li>門脈を露出させるために、実験者の権利に動物の外腸と場所を引き出します。 </li><li> 、できるだけ尾側として、門脈に、蠕動ポンプに接続された25 G IVカテーテルを挿入しかし、脾静脈の吻側。 </li><li>止血剤の尾、下大静脈に、5ミリリットルの注射器に接続された25 Gの翼状針を挿入します。 </li><li>約3ミリリットル/分の速度で蠕動ポンプの電源を入れ、ゆっくりとシリンジに血液で汚染された灌流液の最初のミリリットルを集めます。灌流液の色はターンが赤色（約3〜5 ml）を淡いなるまで続けます。肝臓の色は淡褐色に向かって変化していることに注意してください。 </li><li>蠕動ポンプを停止させることなく、20ミリリットル収穫シリンジで5ミリリットルの収穫シリンジを交換し、灌流の高速（最大4 ml /分）を用いた肝灌流液の少なくとも20ミリリットルを集めます。継続的に収集シリンジに灌流液の流れを監視し、（大静脈壁を崩壊を通して針を詰まらせる可能性がある）強すぎる真空を避けます。 </li><li>肝臓の色は淡褐色になると灌流を終了します。 </li></ol></li><li>白血球の抽出<oL&gt; <li> 、24 400×gで10分間の灌流液を遠心 °C。 </li><li>上清を吸引</li><li> 10 mlのPBS、10分間、400×gで遠心分離器を追加し、上清を吸引除去します。研究の目標に基づいて、あるとして準備を使用するか、または追加の精製（ 例えば 、密度勾配分離）を実施しています。 <ol><li>具体的には、層50 ccのポリプロピレン遠心分離管中の密度勾配分離の質量の4ミリリットルを超える灌流液の4ミリリットル。ブレークオフで30分間、754×gで、室温でチューブをスピン。 </li><li> 、手動ピペッティングにより密度勾配分離上清界面での単核層を得るPBSで洗浄し、5ミリリットルチューブに挿入します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.マウスプロトコル<ol><li>準備<ol><li>調製ヘパリン化PBS（30単位/ ml）リン酸1ml当たり防腐剤フリーのヘパリン30単位を添加することにより、室温（RT）で使用する溶液は、緩衝生理食塩水（PBS）1X solution個。動物当たり20ミリリットルを計算します。 </li><li>気泡を除去するために蠕動ポンプラインと蝶の針を介して、ヘパリン化PBSを渡します。 </li><li> （重力（ドライ）設定で少なくとも30分間、121℃でオートクレーブ）はさみの2ペア、平滑化エッジの鉗子、2止血、および歯組織鉗子 - 手術器具を滅菌します。 </li></ol></li><li> MH-白血球の肝臓とコレクションの灌流<ol><li> 8％のイソフルランの過剰投与により動物を安楽死させます。念のため、その胸腔を開くまで、マウスの頭の周りイソフルランに浸したパッドを含む15mlチューブを配置します。 </li><li>ベッドにマウスの四肢を修正しました。 </li><li>無傷の横隔膜の下側面を維持し、肝臓や呼吸の停止時にすぐに心肺複合体を露出させるために腹膜と胸の空洞を開きます（排水胸腔プールを作成します）。このプロセスを通じて出血は避けてください。 <ol><li>具体的には、下で切開を開始腹部正中内臓に損傷を与えることなく、ポイント、および斜めリブに向かって両側に進展、上胸部キャビティレベルにそれらを切断します。 </li></ol></li><li>門脈を露出させるために、実験者の権利に動物の外腸と場所を撤退。 </li><li>脾静脈への門脈吻側に蠕動ポンプに接続された30グラムの針を挿入します。 </li><li>胸腔からの灌流液の排液および回収を可能にするために、振動板の上に下大静脈をカット。 </li><li>約3ミリリットル/分の速度で蠕動ポンプの電源を入れ、軽く胸腔プールからの血液で汚染された灌流液の最初の3ミリリットルを集めます。 </li><li>この灌流液を捨てます。必要に応じて生理食塩水を使用することにより、再びこのような洗浄を繰り返し、その後にのみ肝灌流液の収集を開始。 </li><li>再起動するまで4ミリリットル/分の速度で灌流し、そして使用して胸腔から灌流液の10ミリリットルを集めます注射器に接続されている蝶。 </li><li>肝臓の色は淡褐色になると灌流を終了します。 </li></ol></li><li>白血球の抽出<ol><li>遠心分離機400×gで10分間の灌流液。 </li><li>上清を吸引除去します。 </li><li> 10 mlのPBS、10分間、400×gで遠心分離器を追加し、学習目標に基づいて上清を吸引、あるとして準備を使用するか、または追加の精製（ 例えば 、密度勾配分離）を実施しています。 <ol><li>具体的には、層50 ccのポリプロピレン遠心分離管中の密度勾配分離の質量の4ミリリットルを超える灌流液のすべての4ミリリットル。ブレークオフで30分間、754×gで、室温でチューブをスピン。 </li><li> 、手動ピペッティングにより密度勾配分離上清界面での単核層を得るPBSで洗浄し、5ミリリットルチューブに挿入します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Melamed, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+marginating-pulmonary+immune+compartment+in+rats%3A+characteristics+of+continuous+inflammation+and+activated+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells.</a> J Immunother. 33, 16-29 (2010).</li>
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<li>Wiltrout, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentation+of+organ-associated+natural+killer+activity+by+biological+response+modifiers.+Isolation+and+characterization+of+large+granular+lymphocytes+from+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Augmentation of organ-associated natural killer activity by biological response modifiers. Isolation and characterization of large granular lymphocytes from the liver.</a> J Exp Med. 160, 1431-1449 (1984).</li>
<li>Winnock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+liver-associated+lymphocytes+in+patients+with+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of liver-associated lymphocytes in patients with liver metastasis.</a> Gastroenterology. 105, 1152-1158 (1993).</li>
<li>Hata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+phenotyping%2C+and+functional+analysis+of+lymphocytes+from+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation, phenotyping, and functional analysis of lymphocytes from human liver.</a> Clin Immunol Immunopathol. 56, 401-419 (1990).</li>
<li>Vanderkerken, K., Bouwens, L., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phenotypically+and+functionally+distinct+subset+of+large+granular+lymphocytes+%28pit+cells%29+in+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phenotypically and functionally distinct subset of large granular lymphocytes (pit cells) in rat liver sinusoids.</a> Hepatology. 12, 70-75 (1990).</li>
<li>Sorski, L., Melamed, R., Lavon, H., Matzner, P., Rosenne, E., Ben-Eliyahu, S. PNIRS Annual Scientific meeting, Seattle, , (2015).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本明細書に提示肝灌流法は、肝白血球をmarginatingのユニークな人口の選択的ハーベスティングと勉強を可能にします。またピットセル3と呼ばれる肝臓のNK細胞は、肝臓の類洞に存在する独特のNK細胞集団を構成しています。それらは、ラット、マウス17およびヒト18,19に見出されます。単離された末梢NK細胞と比較して、ピット細胞は、LFA-1の12のように、より小さな細胞質顆粒のより高い番号20、および表面抗原の高い発現を有することが示された、YAC-1およびCC531s標的細胞株に対して高い細胞毒性20を示し。さらに、単離された血液NK細胞とは異なり、ピット細胞はNK耐性P815細胞を溶解することができます。ラットと同様のピット細胞、ヒト肝NK細胞は、NK細胞18,19の循環に比べNK感受性K562標的細胞に対して高い細胞毒性を有し、そして溶解するNK耐性標的細胞18に示されました。 Overal肝臓が具体的かつユニークに様々な疾患に関与するようにlは、免疫がこの...

肝臓の正弦波は、生物にとって重要な種々の免疫活動の多数の白血球サブタイプが含まれています。例えば、また、ピット細胞として知られている肝をmarginating（MH）ナチュラルキラー（NK）細胞は、特徴づけされているとして形態学的に大顆粒リンパ球（LGLS）と機能的に血液の確立に対する肝臓の抵抗を可能に自発的な細胞傷害能を有する白血球、など負担腫瘍転移。本明細書に提示された方法の目標は、この重要かつユニークな細胞集団（および免疫コンパートメント）を研究するため、およびこれらの特定の細胞上の各種操作（ 例えば免疫活性化）の影響を解明するために、MHの白血球の選択的ハーベスティングを可能にすることです。 現像原発腫瘍を除去する免疫不全にもかかわらず、癌患者および動物モデルにおける証拠は、免疫系が腫瘍細胞、微小転移、およびthrou残存疾患、循環制御できることを示していますGH細胞性免疫（CMI）。しかし、これらのインビボでの機能の間の証明ヒトおよび動物のin vitro研究で明らかな矛盾があるほとんどの自己腫瘍細胞は、1,2-循環または脾臓白血球による細胞毒性に対して耐性があること。この矛盾は、別個の白血球亜集団、すなわちmarginating、肝臓（正弦波）白血球および活性化NK細胞、すなわちピットセル3のそれらの亜集団のin vivoで存在する、少なくとも部分的に帰することができます。実際、我々の研究室からの未発表データは、F344ラットに同系腫瘍細胞循環および脾臓白血球に耐性が認められた（MADB106）は、MH-NK細胞4によって溶解させたことを示しました。したがって、循環白血球に伝えられるところでは、「NK抵抗性」である腫瘍細胞をMH-NK細胞によって制御されてもよいです。注目すべきは、マウスにおいて、MH-NK活性の増強は、免疫in vivoで次明らかです刺激（ 例えば 、ポリIの使用により：CまたはCpG-C）5。 肝臓特異的NK細胞（MH-NK）は、内皮細胞およびクッパー細胞に付着し、正弦波の内腔の内側に位置しています。 MH-NK細胞はもっぱら生理活性物質7,8としてリソソーム酵素、およびパーフォリン及びグランザイムなどの酸性ホスファターゼを含む球状密顆粒およびロッド芯小胞6、によって特徴付けられます。 NK細胞の循環と比較して、MH-NK細胞は、顆粒及び小胞9-11のより高い数と大きさを示します。 NK細胞の循環と比較して、炎症状態下で、MH-NK細胞は、LFA-1 12のより高い発現を示すことが示されました。この増強された発現は、MH-NK細胞はNK細胞13,14を循環するよりも、特定の腫瘍細胞に対してより細胞傷害性であることにより、機構を構成している可能性があります。 nterestingly、インターロイキン（IL）-2 でビトロインキュベーション後、MH-NK細胞が肥大、およびプロFiのルリンホカイ ​​ン活性化キラー（LAK）細胞15のと一致しているすべてのそれらの顆粒の増加の彼らの数とサイズ、。 アクティブMH白血球は、排他的に粉砕し、組織の生物学的分解に基づいており、標準的な肝白血球の収穫方法、を介して取得することはできません。本明細書中に記載の当社の灌流アプローチは、標準的なアプローチと比較して、2つの大きな利点があります。まず、灌流アプローチは、選択的に他の肝臓の区画から他の白血球による汚染を防止し、MHの白血球を収穫します。第二に、灌流技術は、より良い組織処理は、その損傷細胞に接近またはその形態を変化させるとは異なり、完全性、活性、およびMH白血球の生理的な環境を維持し、組織の損傷に起因する、著しく免疫調節種々の因子の放出を誘発しますアクティビティ。 肝臓は、癌転移aの主要な標的器官でありますさまざまな感染症の16回目。 MH電池は、ユニークな特徴を示すように、これらの病変に対して様々な条件の下で、この特定の集団を研究することが重要です。例えば、それは様々なのBRMによって、その全身の免疫活性化に注意することは価値がある（ 例えば、ポリI：CまたはCpG-C）は、白血球5を循環させるよりもMH-白血球より多くを活性化することが示されています。

<table><tbody><tr><td>オートクルード蠕動ポンプ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>バタフライニードル</td><td>OMG</td><td></td><td>26 G</td></tr><tr><td>バタフライニードル</td><td>OMG</td><td></td><td>21 G*3/4インチ</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Pic 溶液</td><td></td><td>1 ml</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Pic 溶液</td><td></td><td>2.5 ml</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Pic 溶液</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ピック溶液</td><td></td><td>10 ml</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>ピク溶液</td><td></td><td>25 ml</td></tr><tr><td>鈍いエッジの鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr> は<tr><td>さみ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>止血</td><td></td><td></td><td></td></tr>剤 <tr><td>組織鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 W 蛍光デイライト拡大鏡ランプ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

marginating-肝白血球の選択的ハーベスティング

Selective Harvesting of Marginating-hepatic Leukocytes

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (肝臓の正弦波に付着した白血球) は、他の免疫区画の白血球と比較してユニークな組成と特性を示すことが示されました。具体的には、マウスとラットの両方で、MH白血球集団の明確な炎症誘発性および抗炎症性プロファイルと、肝臓特異的NK細胞(すなわち、ピット細胞)の細胞毒性が高いことを示唆する証拠があります。本明細書に提示する方法は、マウスおよびラットにおける肝臓の強制灌流によるMH白血球の選択的捕捉を可能にする。組織の粉砕や生物学的分解など、肝臓白血球の抽出に使用される他の方法とは対照的に、この方法は、他の肝臓コンパートメントの細胞によって汚染されていない、肝臓の正弦波から白血球のみを生成します。さらに、灌流技術は、MH白血球の完全性と生理学的環境をよりよく保存し、組織処理に対する既知の生理学的応答を控えめにします。多くの循環悪性細胞と感染細胞が肝臓の正弦波を通過する間に保持され、内皮細胞や常在白血球と物理的に相互作用するため、ユニークなMH白血球集団は、異常な循環細胞と相互作用し、識別し、反応するために戦略的に配置されています。したがって、MH白血球の選択的捕捉とさまざまな条件下での研究は、特に循環異常細胞や肝臓関連疾患、がん転移に関して、MH白血球の生物学的および臨床的意義についての理解を前進させる可能性があります。

F344ラットでは、肝組織の機械的粉砕以下全体の肝細胞集団の細胞毒性に（強制的な肝臓灌流による肝臓類洞から収集）MH-NK細胞の細胞毒性を比較して、循環白血球の細胞毒性です。すべての細胞調製物は、免疫学的アッセイにおけるルーチンとして、少なくとも3回洗浄し、そして標的細胞株として、我々は、同種異系YAC-1または同系MADB106標的細胞株を使用しました。 図1に示されるように- MH-NK細胞は、（それぞれ〜80％ ​​及び100％まで）MADB106およびYAC-1標的細胞株に対する深刻な細胞毒性を示したのに対し、図4に示すように 、両方の全体の肝細胞集団（ 図1）と循環白血球（ 図2及び3）は、細胞毒性の深く低いレベルを示さず、そして同系MADB106標的細胞株に対してほとんど殺害。同じrelati機械的に処理された肝臓はまた、洗浄及び密度勾配分離（ 図4）、文献...

Marginating-hepatic lepatic leukkocytesは、他の白血球集団と比較して、独特の特徴と明確な免疫学的機能を示します。ここでは、ラットまたはマウスの肝臓の強制灌流を通じて、この特定の肝細胞集団を選択的に捕捉する方法について説明します。辺縁性肝白血球は、肝関連疾患および転移に対する感受性を決定する上で重要であると考えられる。

Marginating-肝白血球の選択的ハーベスティング

Marginating-hepatic (MH) leukocytes (leukocytes adhering to the sinusoids of the liver), were shown to exhibit unique composition and characteristics ...

この手順の全体的な目的は、マウスまたはラットの肝臓に強制灌流を行うことで、肝類洞に付着している免疫細胞である辺縁プール肝白血球を選択的に回収することです。この方法により、他の白血球集団とは異なる独自の特性と明確な免疫学的機能を持つ肝白血球の研究が可能になります。本手法の主な利点は、実質などの他の肝臓コンパートメント由来の細胞に汚染されることなく、肝類洞からのみ白血球を回収できる点にあります。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の優れた大学院生であるLiat SorskiとLee Shaashuaです。肝灌流の手順を開始する前に、ペリスタポンプのラインとバタフライ針にヘパリン処理したPBSを流し、気泡を完全に除去してください。その後、呼吸停止直後に、滅菌済みの剪刀と組織鉗子を用いて、安楽死させたラットの下腹部から剣状突起まで正中腹部切開を行い、内臓を損傷しないよう注意してください。次に、ピンセットで胸骨を持ち上げ、横隔膜と両側の肋骨を慎重に切断します。胸骨に止血鉗子を固定し、肋骨を吻側方向に折り曲げて、心肺複合体を露出させます。その後、10 mLシリンジに接続した21ゲージのバタフライ針を準備し、心臓の右心室に挿入します。次に、10 mL シリンジを使用して、可能な限り多くの血液を採取します。すべての血液を採取し終えたら、止血鉗子を用いて、心臓にできるだけ近い位置で後大静脈をクランプします。その後、門脈を露出させるため、腸管を腹腔内から動物の左側へと移動させます。次に、ペリスタルティックポンプの流出管に接続した25ゲージのIVカテーテルを用意し、脾静脈よりも吻側でありながら、可能な限り尾側の門脈に挿入します。その後、5 mLシリンジに接続した21ゲージのバタフライ針を用意し、止血鉗子の尾側の下大静脈に挿入します。ペリスタルティックポンプを約3 mL/minの速度で始動させ、血液で汚染された最初の数mLの灌流液をシリンジに回収します。灌流液が淡い赤色になったら、ポンプを停止させることなく、5 mLの回収用シリンジを20 mLの回収用シリンジに交換します。その後、肝灌流液を7 mL/minの速度で少なくとも20 mL回収します。肝臓全体が淡い褐色になったら、灌流を終了します。次に、灌流液を遠心分離し、上清を吸引します。マウスの辺縁化肝白血球を回収するため、呼吸が停止した直後に、滅菌したハサミと組織用ピンセットを用いて、剣状突起まで腹部正中切開を行います。続いて、ピンセットで胸骨を持ち上げ、横隔膜と肋骨を両側から慎重に切除します。止血鉗子で胸骨を固定し、肋骨を吻側へ折り曲げて心肺複合体を露出させます。腸管を腹腔外の動物の左側へ移動させ、門脈を露出させます。次に、30ゲージの針をペリスタルティックポンプに接続し、脾静脈の吻側の門脈に挿入します。胸腔から灌流液を排液および回収できるように、横隔膜の上方で下大静脈を切断します。次に、ペリスタルティックポンプを約3 mL/minの速度で稼働させ、胸腔内に溜まった血液で汚染された最初の数mLの灌流液を回収します。3 mLの回収が完了したら、ポンプの電源を切ります。次に、10 mLシリンジに接続した21ゲージのバタフライ針を挿入し、胸腔から10 mLの灌流液が回収されるまで、最大4 mL/minの速度で灌流を再開します。肝臓が薄褐色になったら、灌流を停止します。続いて、回収した灌流液を15 mLチューブに移します。遠心分離します。その後、上清を吸引します。辺縁化肝NK細胞は同種標的細胞株に対して強力な細胞毒性を示しますが、肝細胞集団全体および循環白血球は細胞毒性レベルが著しく低く、同系標的細胞株に対してはほとんど殺傷能を示しません。機械的に処理した肝臓に対して洗浄および密度勾配分離を行った場合でも、同様に相対的な細胞毒性レベルの低さが認められます。特定の白血球集団の FACS 解析により、血中および肝細胞コンパートメントにおける免疫細胞集団の組成に顕著な差があることが明らかになります。この手法を習得し、適切に実施すれば、わずか数分で完了させることができます。この手順に従うことで、細胞をフローサイトメトリー、PCR、またはこの重要な白血球集団を特性評価するためのその他の手法に使用することができます。この技術により、辺縁化肝白血球を選択的に回収することが可能となり、その生物学的および臨床的意義への理解を深めることができます。具体的には、循環する異常細胞や肝疾患の制御への応用が期待されます。このビデオを視聴することで、辺縁化肝白血球の回収方法について十分に理解することができます。

selective-harvesting-of-marginating-hepatic-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

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最近同定された頭蓋内細胞タイプである軟髄膜リンパ内皮細胞(LREC)は、機能が十分に理解されていません。この研究は、マウスからLLECを採取し、 in vitro...

軟髄膜リンパ管内皮細胞の採取と初代培養

学ぶ マージネーティング肝白血球の選択的ハーベスティング法。マウスまたはラットの肝臓から強制灌流により肝洞に付着する免疫細胞を単離し、他の白血球集団とは異なる独自の免疫学的機能を研究する。この技術は肝疾患や転移の理解に貢献する。

Marginating-肝白血球の選択的ハーベスティング

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