Name: BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ、BMPアンタゴニストGrem2を用いて多能性幹細胞から心房心筋細胞を分化させる方法。均一な細胞集団を効率的に生成し、心臓発生や不整脈の研究に応用できます。

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この作品は、NIHでサポートされていた「循環器病のメカニズムにプログラム：調査研修」HL083958とHL100398（AKH）と2T32HL007411-33を付与（JB）。

<ol><li>Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+differentiation+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hepatic differentiation of pluripotent stem cells.</a> Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).</li>
<li>Narazaki, G., Uosaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+and+systematic+differentiation+of+cardiovascular+cells+from+mouse+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from mouse induced pluripotent stem cells.</a> Circulation. 118 (5), 498-506 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., Pak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Golos, T. G., Giakoumopoulos, M., Garthwaite, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+as+models+of+trophoblast+differentiation%3A+progress%2C+opportunities%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells as models of trophoblast differentiation: progress, opportunities, and limitations.</a> Reproduction. 140 (1), 3-9 (2010).</li>
<li>Boheler, K. R., Czyz, J., Tweedie, D., Yang, H. T., Anisimov, S. V., Wobus, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+Into+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells Into cardiomyocytes.</a> Circulation Research. 91 (3), 189-201 (2002).</li>
<li>Burridge, P. W., Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).</li>
<li>Cai, C. L., Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isl1+Identifies+a+cardiac+progenitor+population+that+proliferates+prior+to+differentiation+and+contributes+a+majority+of+cells+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Isl1 Identifies a cardiac progenitor population that proliferates prior to differentiation and contributes a majority of cells to the heart.</a> Developmental Cell. 5 (6), 877-889 (2003).</li>
<li>Fujiwara, M., Yan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+enhancement+of+cardiac+cell+differentiation+from+mouse+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+Cyclosporin-A%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Induction and enhancement of cardiac cell differentiation from mouse and human induced pluripotent stem cells with Cyclosporin-A.</a> PLoS ONE. 6 (2), e16734(2011).</li>
<li>Rai, M., Walthall, J. M., Hu, J., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+antagonism+by+Dkk1+counter+activates+canonical+wnt+signaling+and+promotes+cardiomyocyte+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Continuous antagonism by Dkk1 counter activates canonical wnt signaling and promotes cardiomyocyte differentiation of embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. (1), 54-66 (2012).</li>
<li>Burridge, P. W., Matsa, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+generation+of+human+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined generation of human cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
<li>Lian, X., Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+by+modulating+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+under+fully+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions.</a> Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Klos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+promotes+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+the+matrix+sandwich+method%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: the matrix sandwich method.</a> Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).</li>
<li>Tanwar, V., Bylund, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gremlin+2+promotes+differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+atrial+fate+by+activation+of+the+JNK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Gremlin 2 promotes differentiation of embryonic stem cells to atrial fate by activation of the JNK signaling pathway.</a> Stem Cells. 32 (7), 1774-1788 (2014).</li>
<li>Kattman, S. J., Witty, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+optimization+of+activin%2Fnodal+and+BMP+signaling+promotes+cardiac+differentiation+of+mouse+and+human+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).</li>
<li>Müller, I. I., Melville, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+in+zebrafish+demonstrates+that+the+atrial-fibrillation-associated+gene+GREM2+regulates+cardiac+laterality%2C+cardiomyocyte+differentiation+and+atrial+rhythm%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Functional modeling in zebrafish demonstrates that the atrial-fibrillation-associated gene GREM2 regulates cardiac laterality, cardiomyocyte differentiation and atrial rhythm.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 332-341 (2013).</li>
<li>Kattamuri, C., Luedeke, D. M., Thompson, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+protein+related+to+DAN+and+cerberus+%28PRDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant protein related to DAN and cerberus (PRDC).</a> Protein Expression and Purification. 82 (2), 389-395 (2012).</li>
<li>Schulz, H., Kolde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FunGenES+Database%3A+A+genomics+resource+for+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The FunGenES Database: A genomics resource for mouse embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS ONE. 4 (9), e6804(2009).</li>
<li>Phosphate-buffered saline (PBS). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. , (2006).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+Real-Time+quantitative+PCR+and+the+2%E2%88%92%CE%94%CE%94CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using Real-Time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Beck, H., Semisch, M., Culmsee, C., Plesnila, N., Hatzopoulos, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+expression+of+the+glial+scar+component+phosphacan+in+astrocytes+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates expression of the glial scar component phosphacan in astrocytes after experimental stroke.</a> American Journal of Pathology. 173 (1), 77-92 (2008).</li>
<li>Graham, E. L., Balla, C., Franchino, H., Melman, Y., del Monte, F., Das, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+characterization+of+adult+mouse+cardiomyoctyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes.</a> Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+recording+of+ion+channels+expressed+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Patch clamp recording of ion channels expressed in Xenopus oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Sachinidis, A., Fleischmann, B. K., Kolossov, E., Wartenberg, M., Sauer, H., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (6), 862-869 (1995).</li>
<li>Höpfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Volume 2: molecular embryo analysis, live imaging, transgenesis, and cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%B6pfl%2C+G+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. , 254-279 (2004).</li>
<li>Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mouse+embryonic+stem+cell+based+assay+for+quantifying+cardiogenic+Induction+Efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified mouse embryonic stem cell based assay for quantifying cardiogenic Induction Efficiency.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).</li>
<li>Antonchuk, J., Gassmann, M., Desbaillets, I. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWell™ plates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAntonchuk%2C+J+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. 946, 523-533 (2013).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
</ol>

この原稿の著者には、競合する金銭的利益はありません。

このプロトコルは、日常的に心房系統の特徴であるのCMの割合が高いと文化を生成します。任意の分化プロトコルと同様に、分化に先立ったmESCの品質は、特に注意を与えられるべきです。たmESCは、日常的に適切な形態（ 図1A）を監視する必要があります。前EBの形成に発生した自発的な分化が厳しく心臓の効率を制限すると（ 図1B）を継代する前に削除する必要があります。 EBサイズも心臓に影響を与えます。 200とEBあたり1,000〜出発細胞数は、テストされているとEBあたり500個の細胞は、日常のCMの最高の数字を生成します。前日EB形成に継代された細胞はまた、より効率的に差別化する傾向があります。 「ハンギングドロップ」法は、このプロトコル25にEBSを生成するために使用されます。心臓分化ヘクタールのために使用したEBを作製するための他の方法26-29を報告されまし。 「ハンギングドロップ」の方法は、簡単で安価、容易に共通の細胞培養装置・材料と任意の実験室で採用され、細胞培養...

多能性幹細胞は、特にヒト1-5に、基礎研究および前臨床研究のための組織にアクセスすることは困難での宿主から細胞を生成し、研究するための強力なツールです。発達シグナル伝達経路の適切な調節は、所望の表現型の運命への多能性幹細胞の分化を指示することができます。多くのプロトコルは、多能性幹細胞から心筋6-14（CMS）を生成するために開発されています。これらのプロトコルは、一般的にTFGβスーパーファミリー（アクチビン、BMP、およびTGFβ）およびWnt外因性の成長因子および/ ​​または小分子10,12-15の時限添加による経路の調節を伴います。これらのプロトコルは、一般のCMとなる細胞の割合を増加させるのに有効であるが、心房、心室、及び結節/伝導系の系統を示す細胞の混合集団を生成し、特異性を欠きます。特定の心臓を研究するために、より導か分化アプロサブタイプACHが必要です。 Gremlin2（ダンと短いためケルベロスまたはPRDCに関連Grem2、とも呼ばれるタンパク質）は、ゼブラフィッシュ16で心臓発生時に適切な心臓分化および心房室形成するために必要な分泌BMPアンタゴニストです。ただ、中胚葉マーカーT-ブラキュリと1のようなケルベロスのピーク発現させた後、分化4日目にGrem2との差別化胚性幹細胞を処理する、のCMの歩留まりを向上させ、主に心房系統14の細胞のプールを生成します。 組換えGrem2は分化細胞を治療するために使用され、標準的なタンパク質生産技術17を用いて作製することができるか、または商業的に購入することができます。これは、水溶液中で高度に可溶性であり、所望の時点で培養物に外因的に添加されてもよいです。 分化マーカーの代表的な発現を定量するためにRT-定量PCRを使用して追跡することができます心臓血管前駆細胞、心臓前駆体、および確定のCM。免疫蛍光法は、心臓の細胞型の空間的な分布を特定し、可視化するために使用することができます。 CMを同定および単離するためのレポーター系を使用する場合、純粋な集団を必要とするアプリケーションは、より容易に行われます。この目的のために、我々はαMHC-DsRedNucはマウスCGR8 ES細胞株14内に構築し導入しています。 CGR8細胞が拡大および分化アッセイ18を容易に 、フィーダー細胞なしで成長し、多能性のままです。 ES細胞株は、遺伝子プロモーター（MHCまたはMYH6α）心臓特異的アルファミオシン重鎖の下で核局在化シグナルとDsRedの蛍光タンパク質をコードする配列が含まれています。これらの細胞を用いて、CMは容易に特定し、定量化、細胞選別、電気生理学、薬物スクリーニング、および心房分化のメカニズムを研究するため、単離することができます。

<table><tbody><tr><td>GMEM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ11710</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ10082</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMDミリポア</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-メルカプトエタノール</td><td>シグマ</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>シグマ</td><td>I3390</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Σ</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 組織培養プレート</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 細菌性ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 細菌性ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル組織培養プレート</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Gremlin 2 組換えタンパク質</td><td>R&アンプ;D Systems</td><td>2069-PR-050</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルターユニット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>09-741-02</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン (豚の皮から)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS, Sterile</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>BSA&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>0.05%トリプシンEDTA解決</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>Life Technologies</td><td>14200</td><td></td></tr></tbody></table>

bmpアンタゴニストgrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

Differentiation of Atrial Cardiomyocytes from Pluripotent Stem Cells Using the BMP Antagonist Grem2

多能性幹細胞からの心筋細胞の集団を生成するためのプロトコルが開発されてきたが、これらは一般に、混合表現型の細胞をもたらします。特定の筋細胞のサブタイプを含む研究を追求することに興味の研究者は、より多くの有向分化アプローチが必要。 Grem2、 インビボでの心房室形成するために必要な分泌BMPアンタゴニストによるマウス胚性幹（ES）細胞を処理することによって、心房表現型を有する心臓細胞の多数を生成することができます。操作MYH6-のDsRed-のNuc多能性幹細胞株の使用は、識別、選択、および心筋細胞の精製を可能にします。このプロトコルでは胚様体は、ハンギングドロップ法を用いて、MYH6-たDsRed-のNuc細胞から生成され、分化4日目（D4）まで懸濁状態に維持しました。 D4セルでGrem2で処理され、ゼラチンコーティングしたプレート上にプレーティング。 D8-D10大型契約エリア間の培養で観察し、拡大を続けるとメートルされていますD14を通してature。分子は、組織学的およびelectrophysiogical分析はGrem2処理細胞における細胞は、心房心筋細胞の生物学および様々な薬理学的薬剤に対するそれらの応答を研究するためのin vitroモデルを提供心房のような特徴を獲得示しています。

分化前に、多能性幹細胞は、コンパクトかつ自発的分化の自由であるべきです。 図1（a）に示す細胞が単数化およびプロトコルセクション5.1で説明したように液滴を掛けるために使用される準備ができています。 図1（b）に示す細胞が自然に分化していると懸滴の調製のために使用すべきではありません。 パネルは、図2に含ま分化2日目品質のEBでのショー正常に形成されたEBは、一般的に、図2に示すように最善内に均等に間隔をあけ、よく丸い吊り下がる形成している。分化2日目では、EBを球状の手配などの肉眼で見えるはずですハンギングドロップ（ 図2）の先端に幹細胞を分化させます。プロトコルセクション5.3で説明するように、これらのEBは、ウォッシュダウンの準備ができています。 <p class="jo...

多能性幹細胞から心筋細胞をin vitroで生成することで、基礎科学と臨床応用のための大量の心臓組織へのアクセスが可能になります。 このプロトコルでは、心房化因子Grem2を使用して、得られる心筋細胞の数を増やし、心房表現型を持つ心筋細胞を生成します。

BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

Protocols for generating populations of cardiomyocytes from pluripotent stem cells have been developed, but these generally yield cells of mixed ...

この分化プロトコルの全体的な目標は、培養中の心房心筋細胞の均質な集団を生成することです。したがって、この方法は、心臓の発達や心房性不整脈などの心疾患の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vitroで心房心筋細胞の均質な培養物を生成することと、最小限のトレーニングで実行できることです。マウス胚性幹細胞(mESC)培養液を調製する最大4日前に、滅菌した組織培養フードに1ウェルあたり1ミリリットルのゼラチンが入った6ウェルプレートに、それぞれ5ミリリットルの0.2%ゼラチン溶液を含む10センチメートルの組織皿をコード化します。培養当日に、余分なゼラチン溶液を取り除き、ゼラチンでコーティングされた10センチメートルの皿の1つに10ミリリットルの培地を追加します。次に、クライオトングを使用して、バイアルの中央に小さな氷の結晶だけが残るまで、摂氏37度の水浴中で6 mESCに対して1×10のバイアルを静かに渦巻かせます。バイアルを使い捨ての糸くずの出ないワイプで乾燥させ、70%エタノールで滅菌します。次に、バイアルを組織培養フードに入れ、P1000ピペットを使用してESCを皿に追加します。細胞を5%の二酸化炭素を含む摂氏37度の加湿細胞培養インキュベーターに置き、プレートを前後左右にゆっくりと動かして、細胞を均等に分散させます。インキュベーションの終了時に、明視野顕微鏡を使用して細胞の付着を確認します。一部残骸や死細胞が観察されます。培地を10ミリリットルの新鮮なmESC培地と交換し、細胞をインキュベーターに戻します。培養物が60〜70%コンフルエントになったら、マグネシウムとカルシウムを含まない5ミリリットルの滅菌DPBSでプレートをすすぎ、細胞を2ミリリットルのトリプシンEDTAで摂氏37度で5分間インキュベートします。細胞をインキュベートしている間に、継代培養ごとに1つの新しい10cmディッシュから余分なゼラチン溶液を吸引し、各プレートに10ミリリットルの培地を追加します。次に、分離した細胞を遠心分離して15ミリリットルのチューブに回収し、ペレットを10ミリリットルのmESC培地に再懸濁します。所望の分割比率に応じて、各10cm皿に0.5〜1ミリリットルの細胞懸濁液を加え、細胞をインキュベーターに戻し、示したように各皿に細胞を穏やかに分配します。継代した細胞が70%コンフルエントになったら、今示したようにトリプシンEDTAでそれらを分離し、次いで5ミリリットルの胚様体またはEB培地に単一細胞懸濁液を再懸濁する。mESCを数え、適切な量のEB培地で最終濃度を10の2.5倍、10〜3細胞/ミリリットルに希釈します。次に、吊り下げ式培養液1個につき10cmの無菌細菌性ペトリ皿の底に2ミリリットルのPBSを加え、EB懸濁液を無菌溶液槽に移します。次に、準備した皿の1つから蓋を取り外し、6つのチップを備えたマルチチャンネルピペットを使用して、60滴の20マイクロリットルのEB懸濁液を内面に慎重に堆積させます。ぶら下がっている液滴が外れないように注意しながら、蓋をそっと皿に戻し、皿を細胞培養インキュベーターに2日間入れます。EBを洗い流すには、吊り下げ式ドロップカルチャーから蓋を慎重に取り外し、45度の角度で傾けます。次に、室温のEB培地が入った5ミリリットルの血清ピペットを使用して、EBを蓋の底にあるプールに優しく洗います。蓋の表面に付着しているEBがないか注意深く検査し、EBをコーティングされていない6cmのシャーレに移します。EBをさらに2日間組織培養インキュベーターに戻し、EBの凝集と付着についてプレートを毎日チェックします。EBをめっきする前に、調製した6ウェルプレートの各ウェルの余分なゼラチンコーティング溶液を、新たに調製した室温のGrem2処理培地2ミリリットルと交換します。次に、100マイクロリットルに設定されたP1000ピペットを使用して、各ウェルに30個のEBを移し、プレートをインキュベーターに一晩戻し、示されているように穏やかな動きで細胞を均一に分散させます。EBがウェルの底に付着した後、10日目まで2日ごとにGrem2培地を交換します。その後、2日ごとに新鮮なEB培地を細胞に供給し、健康な細胞培養を維持します。吊り下げ式培養に先立ち、多能性幹細胞はコンパクトで自然分化が起こらない必要があります。自発的な分化が観察される場合、その細胞は吊り下げ式培養物に使用しないでください。高品質のEBは、一般的に、等間隔で丸みを帯びた吊り下げ液滴内で最適に形成されます。分化2日目までに、EBは、ぶら下がっている滴の先端に分化した幹細胞の球形の配列として、肉眼で見えるはずです。4日目には、整形式のEBは自由に浮遊し、サイズと形状が均質である必要があります。一旦プレーティングされると、EBは、細胞がEBから組織培養プレートの表面に移動するときに平らになります(これは、分化8日目と10日目に観察されます)。未処理のコントロールウェルでは、小さくてゆっくりと収縮するパッチが6日目から9日目に観察されます。一方、Grem2処理された井戸では、比較的速い収縮率の大きなパッチが一般的です。分化した細胞における遺伝子発現のRT-QPCR解析では、通常、Grem2処理培養物に高濃度の心臓構造遺伝子と制御遺伝子が明らかになります。α-MHC DsRed核細胞株を使用すると、Grem2処理ウェル中のDsRed標識核の数が増えるため、心筋細胞の収量の増加が観察されます。Grem2治療はまた、細胞活動電位持続時間のRT-QPCRおよびパッチクランプ測定によって確認されるように、分化を心房様表現型に偏らせます。一度習得すると、分化幹細胞はわずか60分でGrem2で処理でき、ビーズ細胞は通常7日目から観察されます。この手順を試行する際には、原腸陥入マーカーなどの原腸陥入マーカーのピーク発現後4日目にGrem2を一貫して追加することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、電気生理学やQPCRなどの他の方法を実行して、生成された細胞の機能的および分子的特性を理解することができます。このビデオを見れば、Grem2を使用してマウスESCから心房心筋細胞を生成する方法についてよく理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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マウス胚線維芽細胞の転写因子媒介リプログラミングに続いて心筋細胞のサブタイプを評価します

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体外ヒト間葉系幹細胞の心筋細胞のような細胞への分化

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マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成

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学ぶ、BMPアンタゴニストGrem2を用いて多能性幹細胞から心房心筋細胞を分化させる方法。均一な細胞集団を効率的に生成し、心臓発生や不整脈の研究に応用できます。

BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

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