BMPアンタゴニストGrem2を使用した多能性幹細胞から心房心筋細胞の分化

この分化プロトコルの全体的な目標は、培養中の心房心筋細胞の均質な集団を生成することです。したがって、この方法は、心臓の発達や心房性不整脈などの心疾患の研究における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、in vitroで心房心筋細胞の均質な培養物を生成することと、最小限のトレーニングで実行できることです。

マウス胚性幹細胞(mESC)培養液を調製する最大4日前に、滅菌した組織培養フードに1ウェルあたり1ミリリットルのゼラチンが入った6ウェルプレートに、それぞれ5ミリリットルの0.2%ゼラチン溶液を含む10センチメートルの組織皿をコード化します。培養当日に、余分なゼラチン溶液を取り除き、ゼラチンでコーティングされた10センチメートルの皿の1つに10ミリリットルの培地を追加します。次に、クライオトングを使用して、バイアルの中央に小さな氷の結晶だけが残るまで、摂氏37度の水浴中で6 mESCに対して1×10のバイアルを静かに渦

バイアルを使い捨ての糸くずの出ないワイプで乾燥させ、70%エタノールで滅菌します。次に、バイアルを組織培養フードに入れ、P1000ピペットを使用してESCを皿に追加します。細胞を5%の二酸化炭素を含む摂氏37度の加湿細胞培養インキュベーターに置き、プレートを前後左右にゆっくりと動かして、細胞を均等に分散させます。

インキュベーションの終了時に、明視野顕微鏡を使用して細胞の付着を確認します。一部残骸や死細胞が観察されます。培地を10ミリリットルの新鮮なmESC培地と交換し、細胞をインキュベーターに戻します。

培養物が60〜70%コンフルエントになったら、マグネシウムとカルシウムを含まない5ミリリットルの滅菌DPBSでプレートをすすぎ、細胞を2ミリリットルのトリプシンEDTAで摂氏37度で5分間インキュベートします。細胞をインキュベートしている間に、継代培養ごとに1つの新しい10cmディッシュから余分なゼラチン溶液を吸引し、各プレートに10ミリリットルの培地を追加します。次に、分離した細胞を遠心分離して15ミリリットルのチューブに回収し、ペレットを10ミリリットルのmESC培地に再懸濁します。

所望の分割比率に応じて、各10cm皿に0.5〜1ミリリットルの細胞懸濁液を加え、細胞をインキュベーターに戻し、示したように各皿に細胞を穏やかに分配します。継代した細胞が70%コンフルエントになったら、今示したようにトリプシンEDTAでそれらを分離し、次いで5ミリリットルの胚様体またはEB培地に単一細胞懸濁液を再懸濁する。mESCを数え、適切な量のEB培地で最終濃度を10の2.5倍、10〜3細胞/ミリリットルに希釈します。

次に、吊り下げ式培養液1個につき10cmの無菌細菌性ペトリ皿の底に2ミリリットルのPBSを加え、EB懸濁液を無菌溶液槽に移します。次に、準備した皿の1つから蓋を取り外し、6つのチップを備えたマルチチャンネルピペットを使用して、60滴の20マイクロリットルのEB懸濁液を内面に慎重に堆積させます。ぶら下がっている液滴が外れないように注意しながら、蓋をそっと皿に戻し、皿を細胞培養インキュベーターに2日間入れます。

EBを洗い流すには、吊り下げ式ドロップカルチャーから蓋を慎重に取り外し、45度の角度で傾けます。次に、室温のEB培地が入った5ミリリットルの血清ピペットを使用して、EBを蓋の底にあるプールに優しく洗います。蓋の表面に付着しているEBがないか注意深く検査し、EBをコーティングされていない6cmのシャーレに移します。

EBをさらに2日間組織培養インキュベーターに戻し、EBの凝集と付着についてプレートを毎日チェックします。EBをめっきする前に、調製した6ウェルプレートの各ウェルの余分なゼラチンコーティング溶液を、新たに調製した室温のGrem2処理培地2ミリリットルと交換します。次に、100マイクロリットルに設定されたP1000ピペットを使用して、各ウェルに30個のEBを移し、プレートをインキュベーターに一晩戻し、示されているように穏やかな動きで細胞を均一に分散させます。

EBがウェルの底に付着した後、10日目まで2日ごとにGrem2培地を交換します。その後、2日ごとに新鮮なEB培地を細胞に供給し、健康な細胞培養を維持します。吊り下げ式培養に先立ち、多能性幹細胞はコンパクトで自然分化が起こらない必要があります。

自発的な分化が観察される場合、その細胞は吊り下げ式培養物に使用しないでください。高品質のEBは、一般的に、等間隔で丸みを帯びた吊り下げ液滴内で最適に形成されます。分化2日目までに、EBは、ぶら下がっている滴の先端に分化した幹細胞の球形の配列として、肉眼で見えるはずです。

4日目には、整形式のEBは自由に浮遊し、サイズと形状が均質である必要があります。一旦プレーティングされると、EBは、細胞がEBから組織培養プレートの表面に移動するときに平らになります(これは、分化8日目と10日目に観察されます)。未処理のコントロールウェルでは、小さくてゆっくりと収縮するパッチが6日目から9日目に観察されます。

一方、Grem2処理された井戸では、比較的速い収縮率の大きなパッチが一般的です。分化した細胞における遺伝子発現のRT-QPCR解析では、通常、Grem2処理培養物に高濃度の心臓構造遺伝子と制御遺伝子が明らかになります。α-MHC DsRed核細胞株を使用すると、Grem2処理ウェル中のDsRed標識核の数が増えるため、心筋細胞の収量の増加が観察されます。

Grem2治療はまた、細胞活動電位持続時間のRT-QPCRおよびパッチクランプ測定によって確認されるように、分化を心房様表現型に偏らせます。一度習得すると、分化幹細胞はわずか60分でGrem2で処理でき、ビーズ細胞は通常7日目から観察されます。この手順を試行する際には、原腸陥入マーカーなどの原腸陥入マーカーのピーク発現後4日目にGrem2を一貫して追加することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、電気生理学やQPCRなどの他の方法を実行して、生成された細胞の機能的および分子的特性を理解することができます。このビデオを見れば、Grem2を使用してマウスESCから心房心筋細胞を生成する方法についてよく理解できるはずです。