人間の強膜の共焦点顕微鏡法を実行するために積層技術を用いて、
May 6th, 2016
ヒト強膜組織は主にコラーゲンであるため、免疫組織化学には容易に使用できません。強膜組織の共焦点顕微鏡検査のための免疫組織化学を実施するという目標を達成するために、ラミネート技術が使用されました。
この方法論の全体的な目標は、人間の強膜の共焦点顕微鏡検査を行うことです。この方法は、眼科領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。健康な人の免疫細胞の分布や血管の状態、強膜の病理学的状態など。
この技術の主な利点は、緻密な結合組織の共焦点イメージングを可能にすることです。その手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるStefan Kremersです。まず、96%エタノールとPBSを個々のチューブで調製します。
次に、2%のBSAを含むPBSの推奨希釈液で一次抗体のサンプルあたり100マイクロリットルを調製し、すべての溶液を氷上に保ちます。1〜2本のColibri鉗子、ストレートマイクロディスセッションハサミ、湾曲ハサミ、10番メス、または眼科メスマイクロフェザー、4本の26ゲージ針、綿棒などの清潔な器具を配置します。ポリスチレンプレートにアルミホイルを巻き付けるか、ティッシュを貼り付けるためのコルクプレートを準備します。
テキストプロトコルに従って前方に開いた球根を作成した後、開いた部分を上に向けてスワブにScleraを置きます。次に、大腸鉗子を使用して網膜を切除し、強膜がこれらの層から自由になるまで、内側の強膜から色素沈着したブドウ膜層を取り除きます。次に、必要に応じて湾曲したはさみを使用して、乳頭から網膜とブドウ膜を取り除きます。
次に、残りの結膜、卵管外筋、およびほぞ嚢を表在性強膜から取り出します。現在、大腸菌鉗子を使用して組織を優しく保持し、まっすぐなハサミで組織のさまざまな場所から約2平方センチメートルサイズの強膜サンプルを切断し、鉗子で繰り返しつかむと共焦点顕微鏡に適さない領域になります。サンプルを1.5ミリリットルのチューブに入れ、1.5ミリリットルの96パーセントエタノールを加え、15分間インキュベートして組織を固定します。
次に、エタノールを取り除いた後、1.5ミリリットルのPBSを使用して、サンプルを振とうしながら5分間ずつ3回洗浄します。次に、サンプルを5%BSAを含む1.5ミリリットルのPBSに移し、室温で2時間インキュベートすると、サンプルの膨潤が誘発され、ラミネートを助け、非特異的結合を防ぎます。サンプルが膨らんだら、実体双眼顕微鏡で、端で曲げられた26ゲージの針を使用して、後部強膜サンプルをホイルで包まれたポリスチレン膜またはコルクプレートに貼り付けます。
次に、全層サンプルをラミネートするために、大腸菌鉗子を使用して強膜組織の前端を水平に保持します。10番のメスで、下にある層から表在性強膜のできるだけ薄い層を慎重に切り取ります。組織が乾燥するのを防ぐために、50マイクロリットルのPBSを層にピペットで
取り付けます。次に、層を切断した後、96ウェルプレートの100マイクロリットルのPBSにそれらを配置し、防水マーカーを使用して向きと層の両方にラベルを付けます。組織が完全にラミネートされるまで、層を分離し、96ウェルプレートに移します。免疫組織化学を行うには、ピペットを各ウェルの壁に当てて液体を吸引することにより、96ウェルプレートから培地を取り出します。
次に、PBSで1〜100に希釈した一次抗体100μLを2%BSA含有の適切なウェルに加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、200〜300マイクロリットルのPBSを使用して、シェーカーでサンプルを3回、それぞれ5分間洗浄します。必要に応じて、別の一次抗体を使用し、再度4°Cで一晩インキュベートします。
次に、対応する二次抗体を100マイクロリットル加え、PBSで1〜300に希釈し、2%ヤギ血清で、室温で1〜2時間暗所でインキュベートします。インキュベーション後、200〜300マイクロリットルのPBSを使用して、サンプルをシェーカーで3回、それぞれ5分間すすぎます。次に、1〜2000希釈のDAPIを100マイクロリットル各ウェルに加え、室温で暗所でインキュベートします。
200〜300マイクロリットルのPBSを使用してサンプルを2回洗浄する前に。実体双眼顕微鏡で顕微鏡スライド上にサンプルを移し、サンプルがスライド上に平らに横たわっていることを確認し、蛍光封入剤を1〜2滴加えます。次に、カバースリップを上に置き、透明なマニキュアを使用して端をシールします。
後で使用するために摂氏4度の暗所で保管するか、共焦点顕微鏡で直接検査してください。サンプルの厚さを確認するには、強膜の位置によって赤道と後方で厚さが異なるため、zスタックを取ります。これらの画像は、前部および後部上膜に由来する積層されたヒト強膜における血管叢の多様なネットワークを示しています。
血管は緑色で示されているようにCD31に対して陽性です。この図では、上強膜のLYVE1陽性免疫細胞とCD31陽性血管との関係が示されています。z-stackシリーズは、血管と免疫細胞の3次元関係を調べるために、10倍の倍率で撮影されました。
ここに示すように、強膜内に含まれる眼外筋は、それぞれマーカーCD31とLYVE1を使用して、血管または免疫細胞の存在についても分析できます。一度習得すると、ラミネート技術は適切に実行されれば1時間未満で行うことができます。この手順を試みるときは、組織が乾燥するのを防ぐことを覚えておくことが重要です。
人間の組織を扱う作業は感染する可能性があり、微生物学的およびウイルス学的診断などの予防策を常に事前に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、主にコラーゲンで構成され、免疫組織化学に課題をもたらすヒト強膜組織の共焦点顕微鏡検査の方法論を紹介しています。この技術は、健常および病理学的状態の強膜における免疫細胞の分布と血管の状態を調査することを目的としています。
主要な研究要素
科学の分野
- 眼科学
- 組織学
- 顕微鏡学
背景
- ヒトの強膜は主にコラーゲンからなる密結合組織です。
- 免疫組織化学は強膜の組成により難しいです。
- 共焦点顕微鏡は強膜の詳細な画像を提供できます。
- 強膜における免疫反応の理解は眼科学研究にとって重要です。
研究目的
- ヒト強膜組織の共焦点顕微鏡検査の方法を開発する。
- 健常および病理学的強膜における免疫細胞の分布を評価する。
- 高度な画像技術を用いて強膜の血管状態を評価する。
使用された方法
- 個別のチューブで96パーセントエタノールとPBSを調製する。
- 組織の準備のためのラミネーション技術。
- 密結合組織の画像化のための共焦点顕微鏡。
- 大学院生のデモンストレーションによる手順。
主要な結果
- 強膜組織に共焦点顕微鏡の適用に成功。
- 異なる強膜条件における免疫細胞の分布に関する洞察。
- 健常および病理学的強膜における血管状態の評価。
- ラミネーション技術の効果の実証。
結論
- 開発された方法論は強膜組織の研究能力を向上させます。
- 共焦点顕微鏡は眼の健康に関する貴重な洞察を提供します。
- この技術は眼科学のさらなる研究を促進できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Studying immune cell distribution and vascular status in dense connective tissues like the human sclera presents challenges for target validation in ophthalmic drug development. This laminating technique enables confocal microscopy of otherwise opaque tissues, supporting mechanistic de-risking by providing quantitative spatial data on biomarker expression. The method enhances predictive confidence in preclinical models by allowing analysis of larger tissue samples to reduce sampling bias in target engagement studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding immune cell localization relative to vascular structures in dense tissues.
- Operational Value: Supports functional target validation by clarifying spatial relationships between CD31-positive vessels and LYVE1-positive cells.
- Predictive Value: Improves portfolio triage through quantitative 3D imaging of target engagement in pathological versus healthy sclera.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates standardized, thin tissue layers suitable for reproducible immunohistochemical staining and confocal imaging.
- Quantitative Outputs: Enables z-stack acquisition for thickness-adjusted measurements of biomarker-positive structures across scleral regions.
- Scalability: Facilitates preparation of multiple samples from different anatomical locations for comparative screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by preserving native tissue architecture for analysis of immune-vascular interactions.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides data on vascular and immune biomarkers to inform go/no-go criteria in preclinical advancement.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target validation by directly visualizing co-localization of therapeutic targets in human tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by enabling detailed phenotypic screening of immune and vascular targets in dense connective tissues prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through spatial mapping of biomarker expression in human sclera.
- Screening: Delivers assay-ready laminates with standardized thickness for reliable compound evaluation in ophthalmic target validation.
- Analytics: Generates quantitative confocal readouts (e.g., z-stacks, co-localization metrics) for comparing conditions across samples.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation by preserving human tissue relevance in immune-vascular studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for confocal analysis of other dense connective tissues beyond the sclera.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in dense tissue analysis.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of tissue preparation for confocal microscopy across laboratories.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier go/no-go decisions based on human tissue target engagement data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantitative assessment of biomarker distribution in pathological models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, confocal microscopy, and immunohistochemical staining techniques.
- Dependent on instrumentation including stereo-binocular microscopes, scalpels, and confocal imaging systems.
- Necessitates standardization of laminating thickness and antibody incubation protocols across users.
- Involves adaptation considerations for varying tissue density and anatomical location within the sclera.
- Includes practical limitations such as preventing tissue drying during lamination and managing autofluorescence in dense collagen.
