Name: 人間の強膜の共焦点顕微鏡法を実行するために積層技術を用いて、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 学ぶ人間強膜の共焦点顕微鏡法。積層技術を用いて密集結合組織を詳細に観察し、免疫細胞分布と血管状態を評価する方法です。眼科学研究に有用です。

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ドイツ研究財団 (FOR2240 "(Lymph) Angiogenesis and Cellular Immunity in Inflammatory Diseases of the Eye" to CC and LMH;HE 6743/2-1 および HE 7643/3-1 から LMH へ。CU47/6-1からCC)、German Cancer Aid(LMHおよびCCへ)、GEROKプログラムUniversity of Cologne(SLSおよびLMHへ)、EU COST BM1302「Joining Forces to Corneal Regeneration」(CCへ)など、さまざまな意見が寄せられています。

ヒト組織の使用を見直し、施設内倫理委員会または同等の承認を得なければなりません。ここで説明する作業は、地元の倫理委員会によって承認され、科学的審査の承認を持っていました。この作品は、ヘルシンキ宣言に従って実施しました。人間の強膜標本は、眼科学科のアイバンク、ケルン大学、ドイツで（最大死後時間24時間）、地球ドナーの目から得ました。 1.実験の準備<ol><li> 96％エタノールを調製し、別のチューブ中で緩衝化生理食塩水（PBS）をリン酸。 2％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSの推奨希釈率で一次抗体を調製し、氷上で全ての溶液を保持します。サンプルあたり100μlのを準備します。 </li><li>すべての楽器をきれいにし、鋭いメスを使用しています。同じメスで切断を繰り返した後、メスを変更します。 </li><li> 1-2コリブリ鉗子、ストレートマイクロ解剖ハサミ、＃10メスを取得または眼科用メスマイクロ羽、および4 26 G針。 </li><li>ポリスチレン板の周りにアルミホイルを巻きまたは組織を固定するためにコルク板を使用しています。双眼実体顕微鏡の下に働きます。必要に応じて層流の下に滅菌作業。 </li></ol> 2.強膜を準備<ol><li>静かに電球を保持し、強角膜部分に穿孔穿孔を行い、その後、トレパンを回転させます。均等にラウンドカットを実行するために表面に慎重かつ均等にトレパンを回転させます。 15.5ミリメートルサイズのトレパンを使用してください。湾曲したハサミで残りの添付ファイルをカットします。強角膜穿孔を削除します。これは、前方に開いた電球になります。 <ol><li>上向きに開口部を持つ綿棒に強膜を置きます。強膜からの両方の層（網膜およびブドウ膜）をやってのけるコリブリ鉗子を使用して、網膜およびブドウ膜を削除します。内側の強膜に色素性ブドウ膜を放置しないでください。乳頭から網膜およびブドウ膜を除去するために、湾曲したハサミを使用してください。レムを削除しますaining結膜、外眼筋、および表面的な強膜からのテノン嚢。 </li></ol></li><li>ストレート型はさみとコリブリ鉗子を使用して、必要なサイズの強膜サンプルを削除してください。約2cmに別の場所から2サイズ強膜サンプルを取ります。そのため、小さなサイズで、優しく強膜を保持し、ストレート型のはさみを使用して、正方形として必要なサイズを切り出します。強角膜穿孔は強膜サンプルの前縁を定義します。 <ol><li>繰り返しつかまれた組織は、共焦点顕微鏡分析のために適していない領域として鉗子でつかんでは避けてください。実験の種類に応じて、サンプルの必要な数を用意（ 例えば、前方対後方、 図1と比較）及び使用される抗体の量は。 </li></ol></li><li>後で使用するために、1.5ミリリットルチューブにサンプルを置きます。 15分間1.5ミリリットル96％エタノール中のサンプルを修正し、その後、5分間、それらを各3回を洗いますシェーカー上で1.5ミリリットルのPBSインチ凍結組織で作業する場合は、スナップ凍結する前にこの手順を実行します。 </li><li>新鮮な組織を使用してください。これが不可能な場合には、液体窒素中で強膜を凍結し、後で使用するために-20℃でそれを維持スナップ。凍結組織で作業する場合は、使用前に解凍。解凍と凍結の繰り返し繰り返しは避けてください。 </li><li> 2時間室温で1.5ミリリットルの5％BSAを含むPBS中で各サンプルを保管してください。このステップでは、積層するのに役立つサンプルの膨潤を誘発し、また、非特異的結合を防ぐことができます。 </li><li>サンプルが膨潤した後、積層に強膜の正方形を準備します。 例えば 、双眼実体顕微鏡顕微鏡の下に働きます。 26 G針を使用して、アルミ箔やコルク板に包まれたポリスチレン膜に後部強膜のサンプルを貼り付けます。 </li><li>彼らは、顕微鏡下に視野を妨げることはありませんので、針の端を曲げます。 </li><li>全層強膜SAMPを積層レ。 <ol><li>まず、コリブリ鉗子を使用して、前方の強膜のエッジを保持します。その後、慎重に＃10メス、眼科用メスマイクロ羽、またはへらの刃を用いて表面的な強膜の薄い層をカット。水平にメスを持ち、下地層からできるだけ薄く表層を切りました。 </li><li>強膜広場から薄い強膜層を分析。この方法は、線維柱帯切除術の際にフラップを準備する標準的な外科技術に匹敵し、30-80μmの厚い層（ 図2を比較）をもたらすべきです。 </li></ol></li><li> 例えば 、50μlのPBSをピペットを用いて組織にPBSを少量添加することにより、強膜の乾燥を防ぎます。 </li><li>防水色で例えばと層（表面的で深遠な）（はexternとインターンの方に）96ウェルプレートに100μlのPBSにカット層を入れて、両方の向きにラベルを付けます。 </li><li>組織が完全に積層されて繰り返して、2.7から2.9を繰り返します。&lt;/李&gt; </ol> 3.免疫組織化学を実行します<ol><li>推奨希釈に必要な一次抗体を100μlを追加します。ここでは、 例えば、使用CD 31（モノクローナルマウス抗ヒト）およびLYVE1抗体（ウサギ抗ヒト）、1の希釈の両方において（2％BSAを含む）PBS 100と一晩4℃でインキュベートします。 96ウェルプレート中の培地を変更するには、ウェルの壁にピペットを保持し、流体を除去。 </li><li>翌日、シェーカー上で200から300μlのPBSで5分間のサンプルを3回ずつ洗浄します。対応する二次抗体を100μlを追加します。ここでヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（FITC）およびヤギ抗ウサギシアニン染料3（Cy3の）を使用し、1-2時間室温でサンプルをインキュベートします。 2％ヤギ血清を含むPBS中で300：二次抗体1を希釈。 </li><li>シェーカー上で200から300μlのPBS中で5分間、再び3回ずつサンプルをすすいでください。 </li><li>核染色を行い、 例えば </em&gt;の。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）（希釈1：2,000、100μlの各ウェル中で、室温で10分間インキュベートする）、次いで、シェーカー上で200〜300μlのPBSで再度2回洗浄します。 </li><li> 、顕微鏡スライド上にサンプルを転送し、蛍光封入剤の1〜2滴でそれらを埋め込む、カバースリップを追加し、透明ニスでエッジを覆うことにより、それをシールし、4℃で保存し、後で使用するために、または直接共焦点でスライドを調べます顕微鏡。 </li><li>サンプルを分析するために、共焦点顕微鏡（または同等）を使用します。所望の倍率、 例えば 10-40X倍率を使用してください。 </li><li>サンプルの厚さを確認するには、Z-スタックを用いた共焦点顕微鏡で測定します。厚さは赤道と後方（導入を比較）異なるので可能な強膜の部分の量は、強膜の場所によって異なります。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、財務上の開示を行わないことを宣言している。この記事の内容は著者の責任です。

人間の強膜を積層することは、この組織の共焦点顕微鏡検査を行う方法です。このプロセスにおける重要なステップは、組織を固定するための代わりホルマリンエタノールの使用です。代わりに、固定のためにホルマリンのエタノールを使用する場合に我々の経験では、より良好な結果が得られます。ブラントメスは、プロシージャを悪化させるし、避けるべきです。同様に、強膜の乾燥まで、それは手順を複雑にし、画像の品質を低下させるように、避けるべきです。 免疫組織化学的染色に関しては、ここで適用されるもの以外の抗体を使用することができます。一般的に、コラーゲンは緑チャネルでより多くの自己蛍光およびバックグラウンドを示し、したがって、赤、青、遠赤チャンネルが少ない背景とのより良い結果を示しています。 しかし、技術のいくつかの制限があります。それはmicrosc下で行う顕微手順であるとして強膜を積層することは、たくさんの練習が必要ですOPE。この技術は手動で実行されるため、単一の積層スライスは正確に同じ大きさではなく、組織の一枚以内にその厚さが異なります。層の厚さは...

強膜は、密性結合組織で構成されている、目を覆う硬質の外側の層です。それは、眼内の構造を保護し、眼内圧を維持するのに役立ちます。このように、強膜は、明確なビジョンのために不可欠です。これは、リンパ管1,2を欠いており、それによって、それとリンパのない眼の内部3-7との間に、外リンパのない境界線を形成しています。また、それによって腱と解剖学的類似性を共有し、外眼筋のための結合部位を提供します。 強膜は、主にI型コラーゲンの密な束で構成され、コラーゲンタイプIII、IV、V、VI、VIII 8,9及びエラスチン10,11のより小さい数を有するため、この組織は、免疫組織化学のために使用することは容易ではありません。 （1）表在血管新生した上強膜、結膜およびテノン嚢の下に発見され、側面と目に向けて：解剖学的に、強膜は、3つの主要な層に分離することができます電子バック軌道に直面して、目の。 （2）強膜間質、強膜の主要部分を、 （3）直接ブドウ膜の上に位置する薄い着色層であるラミナフスカ、。強膜に関する当社の解剖学的知識は、20 世紀の前半から主茎。当時、研究者は、主にインドのインク注入12と血管キャスティング13-15を使用して、血管系の解剖学を研究しました。その後、それは血管造影の研究16-19で調査しました。 その時以来、古い技術が改善されていると新しいものは、私たちは前の解剖学的知識を補完することができましたが開発されています。我々はリンパ血管内皮特異的なヒアルロン酸受容体1（LYVE1）20またはポドプラニン21のような信頼性のリンパマーカーを持っていたので、例えば、それは約10年となっています。共焦点顕微鏡は、異なるTIの解剖学的特徴を研究するための新たな可能性を提供しています目のssues。複数の汚れが細胞のマーカーを区別するための又は血管及び他の解剖学的構造に関連する細胞の局在のために使用されることが可能になります。サンプルはより大きなサイズのものであり、ときに特定の細胞型の検索では、私たちはサンプルをスキャンすることを可能にするとき、それは概要を説明します。 Zスタック技術を、共焦点顕微鏡は、100〜200マイクロメートルまでのサンプルのために使用することができます。強膜は、筋肉の挿入および後部磁極11で1ミリメートルの背後に0.3ミリメートルの厚さが異なります。その厚さと不透明さの両方のために、強膜は、伝統的な方法を用いた共焦点顕微鏡観察には適していません。 これを解決するには、強膜組織は、共焦点顕微鏡との分析を可能にするために積層しました。この技術は、人間の強膜の両方の生理学的および病理学的状況のより良い理解を得るために有用です。

<table><tbody><tr><td>96%エタノール</td><td>メルクケミカルズ、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>P075.4</td><td></td></tr><tr><td>双眼実体顕微鏡&nbsp;</td><td>Motic、香港、中国</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>26 G針&nbsp;</td><td>テルモ、ルーヴェン、ベルギー</td><td>303800</td><td></td></tr><tr><td>15.5 mm トレパン</td><td>ゲイダー、ハイデルベルク、ドイツ</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>no.10 メス&nbsp;</td><td>フェザー、pfmメディカル、大阪、日本</td><td>2E + 08</td><td></td></tr><tr><td>眼科メスマイクロフェザー&nbsp;</td><td>Feather, pfm medical, Osaka, Japan</td><td>no. 7657BR</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 抗体 (モノクローナルマウス抗ヒト)</td><td>Dako, USA</td><td>IR610</td><td></td></tr><tr><td>LYVE1 抗体&nbsp;(ポリクローナルウサギ 抗ヒト)</td><td>Zytomed, Germany</td><td>RBK014-05</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス FITC 抗体</td><td>Sigma Aldrich, Steinheim, Germany</td><td>F0257</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ Cy3 抗体</td><td>Dianova, Germany</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清正常</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>X090710-8</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany</td><td>6335.1</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド&nbsp;</td><td>エンゲルブレヒト、Ederm&uuml;nde, Germany</td><td>WC7695002</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 mm x 24 mm</td><td>Th. Gayer, Lohmar, Germany</td><td>7695026</td><td></td></tr><tr><td>DAKO蛍光封止具&nbsp;</td><td>DAKO, USA</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>LSM Meta 510 共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>Carl Zeiss AG, Jena, ドイツ</td><td>n.a</td><td></td></tr></tbody></table>

人間の強膜の共焦点顕微鏡法を実行するために積層技術を用いて、

Using a Laminating Technique to Perform Confocal Microscopy of the Human Sclera

強膜はカバーし、目を保護する密な結合組織です。これは、主に高密度のコラーゲン束（タイプI、III、IV、V、VI、及びVII）からなります。 、その自己蛍光、不透明さ、及び厚さは、共焦点顕微鏡法のために適切であることが見出されていません。免疫組織化学のためにパラフィンに包埋ホルマリン固定強膜を使用して、ここに提示されている1つの代替アプローチは、抗原回復のための組織を予熱する場合は特に、技術的な課題があります。強膜は、細胞及び血管の両方において比較的悪いため、大きな組織サンプルを使用することは、望む細胞を防ぎ、血管および他の解剖学的部位に関連し、その局在化を理解するのに役立つように調べました。共焦点顕微鏡下でより大きな組織サンプルの分析を可能にするために、積層技術は、強膜の薄層を作成するために行きました。 CD31血管およびリンパ管の内皮hyaluの結果の分析を以下のローナン受容体1（LYVE1）科学的な審査の承認が得られたために陽性細胞は、この方法の利点と限界が議論されています。

ここで行う代表的な実験では、この特定の積層技術の使用に由来する明白な利点があります。最初の実験は、3つの代表的な写真（ 図3）内の強膜上の血管叢の多様なネットワークを示す図です。血管はCD31陽性です。 第二の実験は、特定のLYVE1 +上強膜の細胞とCD31陽性の血管との関係では、免疫細胞を示しています。ここで、Zスタック技術は、組織をスキャンし、血管及び免疫細胞（ 図4）の三次元関係を理解するために10倍の倍率で使用しました。 強膜、並びに囲まれた外眼筋は、血管または免疫細胞の存在について分析することができる。図5図LYVE1陽性細胞とCD31陽性の血管。 <p class="jove_content" fo:keep-...

ヒト強膜組織は主にコラーゲンであるため、免疫組織化学には容易に使用できません。強膜組織の共焦点顕微鏡検査のための免疫組織化学を実施するという目標を達成するために、ラミネート技術が使用されました。


The sclera is a dense connective tissue that covers and protects the eye. It mainly consists of dense collagen bundles (types I, III, IV, V, VI, and ...

本手法の全体的な目的は、ヒト強膜の共焦点顕微鏡観察を行うことです。この手法は、健康な状態および病理学的状態における強膜内の免疫細胞の分布や血管の状態など、眼科分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、密な結合組織の共焦点イメージングが可能になることです。本手順の実演は、当研究室の大学院生であるStefan Kremersが行います。まず、96% EthanolとPBSを個別のチューブに準備します。次に、2% BSA含有PBSで推奨希釈した一次抗体を、サンプルあたり100 µLずつ調製し、すべての溶液を氷上で保持します。1〜2本のColibri鉗子、直線型マイクロ解剖用鋏、曲型鋏、10番メスまたは眼科用メス（マイクロフェザー）、26ゲージの針4本、および綿棒を含む清潔な器具を準備します。ポリスチレンプレートにアルミホイルを巻くか、組織を固定するためのコルクプレートを準備します。テキストプロトコルに従って前方に開口した球体を製作した後、開口部を上にして強膜を綿棒の上に置きます。次に、コリブリ鉗子を用いて、強膜がこれらの層から完全に分離するまで、内側の強膜から網膜および色素性のぶどう膜層を除去します。必要に応じて、曲剪を用いて乳頭から網膜とぶどう膜を除去します。次に、表層強膜から残りの結膜、外眼筋、およびテノン嚢を除去します。コロブリ鉗子で組織を優しく保持し、直線鋏を用いて、組織上の異なる部位から約2平方センチメートルの強膜サンプルを切り出します。この際、鉗子で繰り返し掴むと共焦点顕微鏡観察に適さない部位が生じるため、注意してください。サンプルを1.5 milliliterチューブに入れ、96 %エタノールを1.5 milliliters加え、組織を固定するために15分間インキュベートします。その後、エタノールを除去し、1.5 mLのPBSを用いて、振盪しながら5分間ずつ3回サンプルを洗浄します。次に、サンプルを5% BSAを含む1.5 mLのPBSに移し、室温で2時間インキュベートします。これによりサンプルの膨潤が誘導され、ラミネートしやすくなるほか、非特異的結合を防ぐことができます。サンプルが膨潤したら、実体顕微鏡下で、先端を曲げた26Gの針を使用し、後眼球強膜サンプルをアルミ箔を巻いたポリスチレンメンブレンまたはコルク板に固定します。次に、全層サンプルのラミネートを行うため、コプリ forceps を使用して強膜組織の前縁を水平に保持します。10番メスを用い、浅層強膜を下の層から可能な限り薄く慎重に切り出します。組織の乾燥を防ぐため、50 µL の PBS を各層にピペットで滴下します。層を切り出した後、96ウェルプレート内の100 µLのPBSに配置し、防水マーカーを用いて方向と層の両方をラベル付けします。組織が完全にラミネーションされるまで、層の単離と96ウェルプレートへの転送を繰り返します。免疫組織化学染色を行うには、ピペットを各ウェルの壁に沿わせて液体を吸引し、96ウェルプレートから培地を除去します。次に、2% BSA含有PBSで1/100に希釈した一次抗体100 µLを適切なウェルに添加し、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、200〜300 µLのPBSを用いて、シェーカー上で5分間ずつ3回サンプルを洗浄します。必要に応じて、別の一次抗体を用いて、再度4 °Cで一晩インキュベートします。次に、2%ヤギ血清含有PBSで1:300に希釈した対応する二次抗体100 µLを加え、室温の暗所で1〜2時間インキュベートします。インキュベート後、200〜300 µLのPBSを用いて、シェーカー上でサンプルを再度5分間ずつ3回洗浄します。その後、1:2000に希釈したDAPI 100 µLを各ウェルに加え、室温の暗所でインキュベートします。200～300 µLのPBSを使用してサンプルを2回洗浄します。ステレオ双眼顕微鏡下でサンプルを顕微鏡スライドに移動させ、サンプルがスライド上に平らに置かれていることを確認し、蛍光封入剤を1～2滴滴下します。その後、カバーガラスを上に被せ、透明のマニキュアで端を封止します。後で使用するために4°Cの暗所に保存するか、共焦点顕微鏡で直接観察します。強膜の部位によって赤道側と後極側で厚みが異なるため、zスタック撮影を行いサンプルの厚さを確認してください。これらの画像は、前上強膜および後上強膜由来の層状ヒト強膜における、血管叢の多様なネットワークを示しています。血管は緑色で示されるようにCD31陽性です。この図では、上強膜のLYVE1陽性免疫細胞と、CD31陽性血管との関係が示されています。血管と免疫細胞の三次元的な関係を調べるため、z-stack連続写真は10倍の倍率で撮影されました。ここに示すように、強膜内に包まれた外眼筋についても、それぞれCD31およびLYVE1のマーカーを用いて、血管や免疫細胞の存在を解析することができます。ラミネート技術を習得すれば、適切に実施することで1時間以内に完了させることが可能です。この手順を行う際は、組織を乾燥させないように注意することが重要です。ヒト組織の取り扱いは感染のリスクがあるため、事前に微生物学的およびウイルス学的診断などの予防措置を必ず講じてください。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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