Name: タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 47 s
Description: 学ぶタンデムアフィニティー精製と質量分析を用いたMyoDインタラクトーム同定法。HeLa S3細胞を使用し、低存在量のMyoD結合タンパク質を特定し、骨格筋分化の分子機構解明に貢献します。

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Ait-Si-Ali研究室での作業は、Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon)の支援を受けました。国立がん研究所(INCa);Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC);Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC);CNRSの;パリ・ディドロ大学と「私は誰ですか?」Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071は、助成金 #ANR-11-IDEX-0005-01の下でANRが運営する「Investments for the Future」プログラムを通じてフランス政府から資金提供を受けています。EBはINCaの助成金によって支援されました。

<ol><li>Ait-Si-Ali, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Suv39h-dependent+mechanism+for+silencing+S-phase+genes+in+differentiating+but+not+in+cycling+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells.</a> Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+development+and+the+role+of+the+myogenic+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors.</a> Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Winter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+differentiation%3A+more+complexity+to+the+network+of+myogenic+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators.</a> Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+formation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle formation in vertebrates.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).</li>
<li>Yun, K., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+determination+and+differentiation%3A+story+of+a+core+regulatory+network+and+its+context%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context.</a> Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).</li>
<li>Molkentin, J. D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+regulatory+networks+for+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Defining the regulatory networks for muscle development.</a> Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).</li>
<li>Arnold, H. H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+inactivation+of+myogenic+factor+genes+reveals+their+role+during+mouse+myogenesis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review.</a> Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).</li>
<li>Puri, P. L., Sartorelli, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+muscle+regulatory+factors+by+DNA-binding%2C+interacting+proteins%2C+and+post-transcriptional+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications.</a> J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).</li>
<li>Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circuitry+of+a+master+switch%3A+Myod+and+the+regulation+of+skeletal+muscle+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription.</a> Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).</li>
<li>Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+a+DNA+locus+that+mediates+the+conversion+of+10T1%2F2+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 47 (5), 649-656 (1986).</li>
<li>Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+single+transfected+cDNA+converts+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts.</a> Cell. 51, 987-1000 (1987).</li>
<li>Tapscott, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD1%3A+a+nuclear+phosphoprotein+requiring+a+myc+homology+region+to+convert+fibroblasts+to+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts.</a> Science. 242, 405-411 (1988).</li>
<li>Weintraub, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+muscle-specific+genes+in+pigment%2C+nerve%2C+fat%2C+liver%2C+and+fibroblast+cell+lines+by+forced+expression+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).</li>
<li>Mal, A., Harter, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MyoD+is+functionally+linked+to+the+silencing+of+a+muscle-specific+regulatory+gene+prior+to+skeletal+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).</li>
<li>Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+specification+by+myogenin+and+Mef2D+via+the+SWI%2FSNF+ATPase+Brg1%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1.</a> Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).</li>
<li>Ling, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methyltransferase+G9a+methylates+the+transcription+factor+MyoD+and+regulates+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).</li>
<li>Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+class+II+histone+deacetylases+with+heterochromatin+protein+1%3A+potential+role+for+histone+methylation+in+control+of+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation.</a> Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).</li>
<li>Forcales, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal-dependent+incorporation+of+MyoD-BAF60c+into+Brg1-based+SWI%2FSNF+chromatin-remodelling+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex.</a> The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).</li>
<li>Nakatani, Y., Ogryzko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+purification+of+mammalian+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes.</a> Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).</li>
<li>Ouararhni, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+variant+mH2A1.1+interferes+with+transcription+by+down-regulating+PARP-1+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity.</a> Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).</li>
<li>Fritsch, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+the+histone+H3+lysine+9+methyltransferases+Suv39h1%2C+G9a%2C+GLP%2C+and+SETDB1+participate+in+a+multimeric+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex.</a> Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).</li>
<li>Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+histones+H3+and+H4+associated+with+the+histone+methyltransferases+Suv39h1+and+G9a%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a.</a> Genome Biol. 8 (12), R270(2007).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+enrichment+tools%3A+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Ohta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+composition+of+mitotic+chromosomes+determined+using+multiclassifier+combinatorial+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics.</a> Cell. 142 (5), 810-821 (2010).</li>
<li>Yahi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cooperation+between+heterochromatin+protein+HP1+isoforms+and+MyoD+in+myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
<li>Philipot, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+core+binding+factor+CBF+negatively+regulates+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 5 (2), (2010).</li>
<li>Joliot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SWI%2FSNF+subunit%2Ftumor+suppressor+BAF47%2FINI1+is+essential+in+cell+cycle+arrest+upon+skeletal+muscle+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation.</a> PloS one. 9 (10), e108858(2014).</li>
<li>Tanese, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+density+gradient+sedimentation+to+separate+and+analyze+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes.</a> Methods. 12 (3), 224-234 (1997).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+KAP1+phosphorylation+switch+controls+MyoD+function+during+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation.</a> Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Ther+Targets%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification and muscle differentiation.</a> Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).</li>
<li>Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+binds+prohibitin+2+and+relieves+its+repression+of+MyoD+and+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+117%22%5BJournal%5D)">Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation.</a> J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).</li>
<li>Caretti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicases+p68%2Fp72+and+the+noncoding+RNA+SRA+are+coregulators+of+MyoD+and+skeletal+muscle+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation.</a> Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).</li>
<li>Knoepfler, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+motif+N-terminal+to+the+DNA-binding+domains+of+myogenic+bHLH+transcription+factors+mediates+cooperative+DNA+binding+with+pbx-Meis1%2FPrep1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1.</a> Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).</li>
<li>Albini, S., Puri, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+complexes%2C+chromatin+remodeling+and+skeletal+myogenesis%3A+it%27s+time+to+exchange%21%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange!</a> Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).</li>
<li>Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Cooperation+between+Heterochromatin+Protein+HP1+Isoforms+and+MyoD+in+Myoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts.</a> J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

提示された方法は、転写因子、のMyoDのパートナーの網羅的同定を可能にします。これは、MyoDの誘導性の分化、すなわちのHeLa-S3細胞に耐性異種システムでのMyoDパートナーを明らかにしました。したがって、定義により、識別されたのMyoDのパートナーは、遍在的に発現されています。これらは一般的かつ配列特異的な転写因子、クロマチン修飾酵素、RNA処理タンパク質キナーゼ（ 表1および2）が挙げられます。 HeLa-S3細胞はMyoDの誘導性のトランス分化に耐性があるので、MyoDの活性は、主に抑圧され、識別されたパートナーは、MyoDのコリプレッサーである可能性が高いです。これは、MyoDのトランス能力8を阻害することが知られているのIdタンパク質（ 表1および表 2、図2）の存在によって強調されています。重要なことは、このような抑圧的な状態は、筋芽細胞増殖にMyoDの状況に対応しています。確かに、我々はCBFβ、のMyoDとそのMyoDの相互作用...

真核生物の多細胞生物は、異なる器官及び組織で構成されています。それぞれの機能的な組織は、各分化段階で決定される特定の遺伝子パターンの発現を有します。細胞分化は、特定の遺伝子の活性化、一般的にそれらの発現の維持、遺伝子、細胞増殖に関与するものなどの組のサイレンシングを含みます。骨格筋分化、または筋形成、すなわち筋芽細胞に中胚葉幹細胞の決意から始まり、従って、多段階のプロセスであり、最初の単核、その後多核、筋管へのこれらの筋芽細胞の分化をもたらします。このように、筋芽細胞はまだ増殖することが可能である細胞を、「決定」されているが、それらは、骨格筋系統にコミットしている、したがって、胚発生中または成体の筋再生のいずれかで、骨格筋細胞にのみ分化することができます。骨格筋端末の処理が異なりますentiationは、E2F標的遺伝子1のような増殖関連遺伝子の明確なサイレンシングを導く筋芽細胞前駆細胞の細胞周期から永久出口から始まる特定の遺伝的プログラムによって調整されます。実際、最終分化のプロセスの間に、筋芽細胞の増殖停止は、骨格筋特異的遺伝子の発現と筋管2への筋芽細胞の融合の前に重要なステップです。このようなプログラムは、衛星細胞と呼ばれる成体筋幹細胞は、骨格筋損傷後の再生処理中に分化することが可能になります。 哺乳動物の筋形成は、筋原性塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスの家族に決定的に依存している（のbHLH）転写があるMyoD、Myf5の、MRF4とミオゲニン因子、頻繁に骨格筋決意因子またはのMRFの家族と呼ばれる（筋肉の調節因子）3。それらの各々は、本明細書及びDIFにおいて重要な役割を果たしています骨格筋細胞のferentiationと特異的発現パターン4 5-7ました。 Myf5のとのMyoDの活性化は、筋原系統に細胞をコミットする決定的なステップを構成し、ミオゲニンのその後の発現は、MCK（筋クレアチンキナーゼ）などの骨格筋特異的遺伝子の活性化と筋形成を誘発します。筋原性のbHLH転写因子は、以前にサイレント遺伝子座8から筋遺伝子の活性化におけるMEF2ファミリーのメンバーと協力します。彼らはまた、様々な遺伝子調節領域8に、いわゆるE-ボックスに結合するEタンパク質として知られているユビキタスのbHLHタンパク質とヘテロダイマー、E12とE47、などの骨格筋遺伝子の転写を刺激します。ねじれは、ID（分化の阻害剤）、および他の要因は、負8結合 Eタンパク質についてのMyoDと競合することによって、このプロセスを調節します。 MyoDのは、筋肉分化を誘発するの主要なプレーヤーとして考えられている9 </sそれは、多くの完全に分化した非筋肉系10-13に筋原決意/分化（トランス分化）プログラムを誘導する能力を有しているので&gt;アップ。確かに、のMyoDの強制発現は、異なる細胞型のトランス分化を誘導する別の発生学的起源12から誘導されるものです。例えば、MyoDのは、筋様細胞に肝細胞、線維芽細胞、メラノサイト、神経芽細胞、および脂肪細胞に変換することができます。 MyoDのトランス分化作用は、元の遺伝的プログラム（特に、増殖遺伝子）のサイレンシングに付随する非筋肉環境での筋原性遺伝的プログラム（特にその標的遺伝子）の異常な活性化を伴います。 筋芽細胞の増殖では、MyoDのは発現するが、それはそれらのプロモーター14-16に結合する場合でも、その標的遺伝子を活性化することができませんされています。したがって、連続的に未分化の筋芽細胞で発現されるのMyoDの要件は非常にELUままSIVE。 MyoDのは、酵素14,17を改造クロマチンを活性化のロード前に増殖する筋芽細胞における抑圧的なクロマチン修飾酵素の補充のためにその標的遺伝子を抑制することができます。例えば、筋芽細胞増殖に、MyoDのは、ヒストンH3のリジン9またはH3K9とH3K27 KMTsなどの転写コリプレッサーKAP-1、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）と抑圧的なリジンメチルトランスフェラーゼ（KMTs）、関連付けられている、と積極的にその標的遺伝子の発現を抑制され、局所的に抑圧的なクロマチン構造14,17を確立することもできます。重要なことは、最近の報告では、MyoDのは、直接そのトランス活性16の阻害をもたらすH3K9 KMT G9Aによってメチル化自体であることが示されました。 MyoDによる非筋細胞のこのトランス分化に関与するエピジェネティックなメカニズムは不明な点が多いです。特に、いくつかの細胞株は、MyoDの誘導性のトランス分化に耐性です。このように、HeLa細胞では、MyoDのは、非アクティブかのいずれかでありますでもによる複雑なSWI / SNF 18クロマチン再構築のBAF60Cサブユニットの発現の欠如にリプレッサーではなく、転写活性化因子として機能する可能性があります。このモデルは、より良好MyoDの誘導性の遺伝子抑制機構を特徴づけるために選択されることができます。それに関連するパートナーとその標的遺伝子座で抑圧的なクロマチン環境を誘導し、したがって、最終分化を微調整する筋芽細胞の増殖でのMyoD依存抑圧的なメカニズムを明らかにするのMyoDの能力を検定することも好適です。 ここでは、質量分析（MS）特性評価に結合されたタンデムアフィニティー精製（TAP-タグ）を使用してのMyoDパートナーを識別するためのプロトコルについて説明します。安定フラグ-HA-のMyoDを発現するHeLa-S3細胞の使用は、分別核抽出物からのMyoD複合体を精製するために十分な材料を入手することを許可しました。異種システムでのMyoDパートナーの同定はvalidatiが続きました関連するシステムで上。

<table><tbody><tr><td><ストロング>細胞株</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa-S3</td><td>ATCC</td><td>CCL-2.2</td><td></td></tr><tr><td>C2C12</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピナー</td><td>コーニング</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー:&nbsp;ダウンスホモジナイザー&nbsp;</td><td>ウィートン</td><td>432-1273および432-1271</td><td></td></tr><tr><td>スピナー用攪拌装置ベル</td><td>コ</td><td>778531</td><td></td></tr><tr><td>ソニケー</td><td>ターDiagenodeUCD200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>マリエンフェルドスーペリア&nbsp;</td><td>640610</td><td></td></tr><tr><td>低結合チューブ</td><td>Sorenson</td><td>27210</td><td></td></tr><tr><td>空のスピンカラム</td><td>Bio-Rad</td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide 4-12%&nbsp; gel</td><td>Life technologies</td><td>NP0336BOX</td><td></td></tr><tr><td>4x loading buffer&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>10倍還元剤</td><td>ライフテクノロジー</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>銀染色キット</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A8592</td><td></td></tr><tr><td>遠心フィルターユニット、10K</td><td>ミリポア</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>プロテイン G アガロース ビーズ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4691</td><td></td></tr><tr><td>プロテイン A/G&nbsp;樹脂</td><td>Thermo Scientific</td><td>53132</td><td></td></tr><tr><td>フラッグ樹脂(抗フラッグ M2-アガロースアフィニティーゲル)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>HA 樹脂(モノクローナル抗 HA アガロース)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2095</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3755</td><td></td></tr><tr><td>フラッグフリーペプチド (DYKDDDDK)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>カスタム合成</td><td>50 mM で最大 4 mg/ml を再懸濁Tris-HCl、pH 7.8</td></tr><tr><td>HAフリーペプチド(YPYDVPDYA)</td><td>Ansynth Service BV</td><td>カスタム合成</td><td>50 mM Tris-HCl、pH 7.8</td></tr><tr><td>ビシンコニン酸ベースのタンパク質アッセイキット:BCAキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td></tr><tr><td>ルミノールベースの強化化学発光(ECL)HRP基質</td><td>生命技術</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>剪断されたサケ精子 DNA (サケ精巣由来のデオキシリボ核酸ナトリウム塩)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>スペルミン四塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141</td><td></td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>MOPS ランニングバッファー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (高グルコース)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0822</td><td>予温&nbsp; at 37 &deg;C使用前に</td></tr><tr><td>トリプシンEDTA(0.05%フェノールレッド</td>ライフ<td>テクノロジー25300-054</td><td></td><td></td></tr>血清<tr><td></td><td>GEヘルスケアライフサイエンス&nbsp;</td><td>PAA A15-102</td><td>血清の各ロットは、最初に細胞についてテストする必要があります。</td></tr><tr><td>ペニシリンとストレプトマイシン&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 15250-061</td><td></td></tr><tr><td>水(滅菌ろ過)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td><ストロング>抗体</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HA ラット(12CA5)</td><td>ロシュ</td><td>・11583816001</td><td></td></tr><tr><td>・フラッグ</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32758</td><td>ウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>MyoD</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-760</td><td>免疫沈降およびウェスタンブロッティングに使用</td></tr><tr><td>CBFbeta</td><td>Santa Cruz</td><td>FL-182&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HP1alpha</td><td>Euromedex</td><td>2HP2G9</td><td></td></tr><tr><td>HP1beta</td><td>Euromedex</td><td>1MOD1A9AS</td><td></td></tr><tr><td>HP1gamma</td><td>Euromedex</td><td>2MOD1GC</td><td></td></tr><tr><td>Suv39h1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8729</td><td></td></tr><tr><td>BAF47</td><td>BD Biosciences</td><td>612111</td><td></td></tr><tr><td>Myf5</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-302</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td></td></tr><tr><td>Actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>IgG マウス</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2025</td><td></td></tr><tr><td>IgG Rabbit</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-2027</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ反ラット -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9037</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ反ウサギ -HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス-HRP</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A4416</td><td></td></tr></tbody></table>

タンデムアフィニティー精製を使用してのmyodインタラクトームの同定は、質量分析に結合します

Identification of MyoD Interactome Using Tandem Affinity Purification Coupled to Mass Spectrometry

骨格筋分化は、筋芽細胞への多能性中胚葉前駆細胞のコミットメントから始まります。これらの細胞はまだ増殖する能力を持っているか、彼らは筋線維を形成するために、さらに成熟さ多核筋管に分化するとヒューズができます。骨格筋分化は、様々な転写因子の協調作用によって編成され、特に筋肉調節因子またはMRFは（のMyoD、ミオゲニン、Myf5の、およびMRF4）のメンバーは、また、筋原性のbHLH転写因子ファミリーと呼ばれます。これらの要因は、骨格筋形成を達成するために精巧な転写制御ネットワーク内のクロマチンリモデリング複合体と協力しています。この中で、MyoDのは、筋分化を誘発におけるマスター筋原性転写因子であると考えられます。この概念は、骨格筋細胞への非筋細胞に変換するのMyoDの能力によって強化されます。ここでは、MyoDのを識別するために使用される方法を説明します骨格筋分化に関与するさまざまな要因を解明するために、徹底的な方法でタンパク質パートナー。長期的な目的は、骨格筋遺伝子の制御、 すなわち 。、MyoDの標的に関与するエピジェネティックなメカニズムを理解することです。 MyoDのパートナーは骨格筋分化の間に、関連するパートナーの役割の検証に続いて、質量分析（MS）特性評価、に結合された異種システムからタンデムアフィニティー精製（TAP-タグ）を使用して識別されます。筋再生における先天性筋無力症、筋緊張性ジストロフィー、横紋筋肉腫および欠陥：筋原性因子、またはそれらの異常調節の異常な形態は、筋障害の数と関連しています。このように、筋原性の要因は、両方の病気自体を引き起こすメカニズムおよび疾患の治療を改善することができ、回生機構に関しては、筋疾患における潜在的な治療標的のプールを提供しています。したがって、詳細なunderstan筋原性の要因によって制御分子間相互作用や遺伝的プログラムの鼎は、効率的な治療法の合理的な設計のために不可欠です。

MyoDの活性の調節を理解するために、我々は、質量分析（MS）、続いてのMyoDの二重タグ付けされた形の免疫精製に基づいて、生化学的精製を用いてのMyoD複合体の網羅的特徴付けを行いました。フラグ-HAタグ付きのMyoDとフラグ-HA-のMyoDの二アフィニティー精製を行うことにより、MyoDの複合体を精製するための十分な材料を得るためにフラグ-HA許可を発​​現する対照細胞株を発現するHeLa-S3細胞株の使用。 私たちは、その後、さらに塩抽出（核塩抽出性、SE）に核画分を分画し、ヌクレオソーム（ヌクレオソームに富む、NE）の画分について濃縮、細胞質および核画分に細胞抽出物を分画しました。これらの分離した核画分（ 図1、表1および2）からのTAPタグの精製は、比較的低いABを持つパートナーを解明許可しました一つの特定の核内コンパートメントに局在undance。さらに、このような戦略...

MyoDは、多くの完全に分化した非筋肉細胞株の筋原性分化転換を誘導する強力な能力を持つ筋原性転写因子です。この分化転換に関与するエピジェネティックなメカニズムは、ほとんどわかっていません。ここでは、MyoDパートナーを網羅的に特性評価するためのダブルアフィニティー精製法とそれに続く質量分析法について説明します。

タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します

Skeletal muscle terminal differentiation starts with the commitment of pluripotent mesodermal precursor cells to myoblasts. These cells have still the ...

この実験の全体的な目標は、MyoDタンパク質パートナーを網羅的に特徴づけることです。この手法は、主要な筋転写因子であるMyoDによる骨格筋の緊張変形の分子制御など、骨格筋生物学分野の重要な疑問に答えることができます。この技術の主な利点は、選択的に存在量が少ないMyoDパートナー、つまり1つの特定の亜核コンパートメントに局在するMyoDパートナーを解明できることです。この方法は、筋肉分化の調節に関する洞察を提供することができますが、他の組織、特に核分化などの他のシステムにも適用できます。その手順を実演するのは、当研究室の研究助手であるLauriane Fritsch博士です。このプロトコルでは、MyoD複合体は、FLAGグルテニンタグでMyoDを安定して発現するHeLa S3細胞から精製されます。エンプティベクターで形質導入したHeLa S3細胞をコントロールとして使用します。両方の細胞株は、プロトコルのテキストに記載されているように、以前に摂氏マイナス80度で増殖、収集、保存されていました。細胞ペレットを摂氏37度の水浴ですばやく解凍します。すべてのバッファーとホモジナイザーは事前に冷却し、この手順全体を冷蔵室で実行する必要があります。通常、各実験ポイントには20グラムの細胞が使用されますが、このデモンストレーションの目的では、10グラム、つまり約10mLの細胞のみが処理されます。最初に5 mLの緩衝液を使用して、10 mLの低張緩衝液Aに細胞を再懸濁します。次に、2.5 mLを加え、続いてさらに2.5 mLを加えます。ピペットを新鮮なバッファーでよく洗って、細胞を最大限に引き出します。細胞懸濁液20 mLを、しっかりとフィットする乳棒で予冷したホモジナイザーに移します。細胞を20回のストロークで均質化します。細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。細胞の回収率を最大限に高めるには、ホモジナイザーを3.5 mLのショ糖緩衝液で洗浄します。この懸濁液を50 mLチューブにすばやく移して、核を保護し、漏れを制限します。細胞懸濁液の30マイクロリットルのアリコートを30マイクロリットルの4%トリパンブルーで染色し、顕微鏡で分析して溶解効率を決定します。溶解が成功した場合、すべての原子核は青色になります。必要に応じて、均質化を繰り返します。10, 000 x gおよび4の摂氏温度で7分間遠心分離し、核をペレット化します。上清を細胞質画分として保存します。核塩抽出可能画分の調製手順を開始するには、核ペレットを4mLのショ糖緩衝液に再懸濁します。次に、渦中で十分に混合しながら、4 mLの高塩緩衝液を一滴ずつ加えて、最終濃度300 mMの塩化ナトリウムを得ます。氷上で30分間インキュベートし、5分ごとに混合します。次に、ショ糖緩衝液8mLを添加して、塩化ナトリウム濃度を150mMに下げます。13, 000 x gおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。塩抽出可能な画分である上清を集め、氷の上に置きます。クロマチン結合画分を調製するには、ペレットを3.5 mLのショ糖緩衝液に細心の注意を払って再懸濁します。塩化カルシウムを最終濃度1 mMまで加えて混合します。塩化カルシウムは、後で追加されるミクロコッカスヌクレアーゼを活性化します。懸濁液を摂氏37度で1分間予熱します。マイクロリットルあたり5単位マイクロコッカスヌクレアーゼストックの35マイクロリットルを添加して、マイクロリットルあたり25 10000単位の最終濃度を得る。摂氏37度でちょうど12分間インキュベートします。4分ごとに混ぜます。12分後、すぐに反応を氷の上に置きます。ミクロコッカスヌクレアーゼ活性を停止するには、56マイクロリットルの5モルEDTA pH 8.0を最終濃度4 mMおよびボルテックスに加えます。氷上で5分間インキュベートします。高振幅で毎回1分間5回超音波処理し、超音波処理の間に1分間の休憩を空けます。抽出可能な塩とヌクレオソームが豊富な画分の両方を、摂氏4度で85,000 x gで30分間遠心分離機に交換します。上清を集めます。塩抽出可能な画分は約13mLである必要があります。そして、ヌクレアソームが濃縮された画分は約6mLであるべきです。MyoDタンパク質複合体は、ダブルアフィニティー精製によって精製されます。FLAGベースの精製とHAベースの精製の手順は類似しているため、FLAGベースの精製のみを示します。TECNを添加した後、50mLのチューブに適量のFLAG樹脂を移し替えます。市販の50%ストックのプレウォッシュFLAG樹脂から300μリットルのFLAG樹脂が実験ポイントごとに必要です。1, 000 x gで2分間遠心分離します。上清を取り除き、冷たいTECNを加え、再度遠心分離します。FLAG樹脂を冷たいTECNで合計5回洗います。最後の洗浄後、FLAGレジンを等量のTECNに再懸濁します。各実験ポイントについて、300マイクロリットルの洗浄したFLAG樹脂と対応するタンパク質抽出物を混合します。ヌクレアソーム濃縮画分には15 mLチューブを、塩抽出可能画分には50 mLチューブを使用します。回転するホイールでチューブを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、すべてのチューブを摂氏4度で1, 000 x gで2分間遠心分離します。上清を採取し、精製効率試験の結果が得られるまで摂氏4度に保ちます。塩抽出可能なサンプルについては、FLAGレジンを4 mLのTECNに再懸濁し、15 mLチューブに移します。このステップを3回繰り返し、ビーズの損失を防ぐために、毎回同じ15mLに移します。摂氏4度で1, 000 x gで2分間遠心分離します。上清を取り除いた後、FLAG樹脂に13 mLのTEGNを加え、摂氏4度で1, 000 x gで2分間遠心分離します。この方法でレジンを7回洗います。最後の洗浄後、レジンを1 mLのTECNに再懸濁し、1.5 mLの低結合チューブに移します。2分間遠心分離し、上清を取り除きます。pH 7.8で4 mg / mLの100マイクロリットルのFLAGペプチド溶液に各実験ポイントの樹脂を再懸濁し、よく混ぜて100マイクロリットルのTAGNバッファーを加えます。4°Cで少なくとも4時間インキュベートして、結合タンパク質を溶出します。2分間遠心分離し、樹脂と上清を2 mLチューブに入れた空のスピンカラムに移します。カラムを6, 000 x gで1分間遠心分離します。残った上清を2mLのチューブに集めます。次に、HAベースの精製に進む前に、プロトコルテキストに記載されているように精製効率をテストします。ここに示されているのは、安定して発現する FLAG HA MyoD の HeLa S3 細胞株の核塩抽出可能画分またはヌクレアソーム濃縮画分から得られた二重親和性精製 MyoD 複合体の代表的な結果です。銀染色により同定されたFLAG HA MyoDは、模擬細胞株には存在しない矢印で示されています。二重親和性精製MyoD複合体をグリセロールグラジエント上で分画しました。抗FLAG抗体を用いた画分のウェスタンブロッティングにより、2つの核内コンパートメントのMyoDサブコンプレックスが明らかになりました。特に、塩抽出可能なMyoDは3つのサブ複合体に分布しているのに対し、クロマチン結合型MyoDは主に1つの複合体に属しています。核塩抽出可能画分およびヌクレオソーム濃縮画分から単離されたMyoD相互作用因子の質量分析により、MyoDの一連の既知のパートナーと新しいパートナーが同定されました。ここでは、両方のフラクションに見られるMyoDインタラクター、または特にフラクションの1つに見られるMyoDインタラクターは、それらの機能アノテーションに基づいてグループ化されています。質量分析の一部では、MyoD複合体のウェスタンブロットによって相互作用が確認されたことが明らかになりました。これらには、転写因子CBF、SWI/SNFサブユニットBAF47およびHP1タンパク質が含まれます。HeLa細胞は筋細胞ではなく、通常はMyoDを発現しないため、新たに同定された相互作用者とMyoDおよび筋芽細胞との相互作用を確認する必要があります。増殖および分化中のマウス筋芽細胞からの核総抽出物を、示された抗体を用いた免疫沈降およびウェスタン分析に使用しました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば2日半で完了します。この手順を試みる際には、筋芽細胞で得られた結果を精緻化することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、筋芽細胞のような関連性システムにおける特定のパートナーのノックダウンなどの他の方法を実行して、相互作用の機能的意味などの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、発生生物学的エピジェネティクスの分野の研究者が、ほとんどの身体系における5つの転写因子の制御ネットワークを探求する道を開きます。このビデオを見れば、細胞分画とタンデムアフィニティー精製、質量分析を組み合わせて転写因子のパートナーを特定する方法についてよく理解できるはずです。

identification-myod-interactome-using-tandem-affinity-purification

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。...

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

マススペクトロメトリー（APMS）との組み合わせでタグ付けされたタンパク質のアフィニティー精製は、タンパク質相互作用ネットワークの体系的マッピングのため、生物学的プロセスの基本メカニズムを調査するための強力な方法です。ここでは、細菌のために開発最適化された順次ペプチドアフィニティー（SPA）をAPMSの手順を説明...

のタンパク質複合体の同定<em&gt;大腸菌</em&gt;タンデム質量分析との組み合わせでシーケンシャルペプチドアフィニティ精製を用いた

ショウジョウバエは、その強力な遺伝子操作のためではなく、詳細な生化学的解析のその適合性のために有名である。ここでは、ハエの脳から、目的の任意のタンパク質の相互作用パートナーを識別するために、TAPベースの手順を提示する。この手順では、潜在的な研究の新たな道につながることができます。...

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する<em&gt;ショウジョウバエ</emタンデムアフィニティー精製（TAP）による&gt;アダルトヘッド

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定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

記載されているプロテオミクスワークフローは、目的とするタンパク質の免疫親和性濃縮と標識フリー質量分析法を用いて核細胞内分画からタンパク質相互作用パートナーを同定するためのプロテオミクスワークフローである。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、フィルター支援サンプル調製、オフラインクリーンアップ、質量分析、下流バイオインフォマティクスパイプラインが含まれます。...

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

タンパク質抽出、定量、沈殿、消化、標識、プロテオミクス施設への提出、データ分析の各ステップの詳細情報を含む最適化されたタンデム質量タグ(TMT)標識プロトコルを提示します。...

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

ここでは、細胞および組織からの内因性リンタンパク質ホスファターゼおよびそれらの相互作用タンパク質の濃縮、ならびに質量分析ベースのプロテオミクスによるそれらの同定および定量のためのプロトコルを提示する。...

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MALDIサンプル調製：超薄層法

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クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

学ぶタンデムアフィニティー精製と質量分析を用いたMyoDインタラクトーム同定法。HeLa S3細胞を使用し、低存在量のMyoD結合タンパク質を特定し、骨格筋分化の分子機構解明に貢献します。

タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します

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