タンデムアフィニティー精製を使用してのMyoDインタラクトームの同定は、質量分析に結合します

この実験の全体的な目標は、MyoDタンパク質パートナーを網羅的に特徴づけることです。この手法は、主要な筋転写因子であるMyoDによる骨格筋の緊張変形の分子制御など、骨格筋生物学分野の重要な疑問に答えることができます。この技術の主な利点は、選択的に存在量が少ないMyoDパートナー、つまり1つの特定の亜核コンパートメントに局在するMyoDパートナーを解明できることです。

この方法は、筋肉分化の調節に関する洞察を提供することができますが、他の組織、特に核分化などの他のシステムにも適用できます。その手順を実演するのは、当研究室の研究助手であるLauriane Fritsch博士です。このプロトコルでは、MyoD複合体は、FLAGグルテニンタグでMyoDを安定して発現するHeLa S3細胞から精製されます。

エンプティベクターで形質導入したHeLa S3細胞をコントロールとして使用します。両方の細胞株は、プロトコルのテキストに記載されているように、以前に摂氏マイナス80度で増殖、収集、保存されていました。細胞ペレットを摂氏37度の水浴ですばやく解凍します。

すべてのバッファーとホモジナイザーは事前に冷却し、この手順全体を冷蔵室で実行する必要があります。通常、各実験ポイントには20グラムの細胞が使用されますが、このデモンストレーションの目的では、10グラム、つまり約10mLの細胞のみが処理されます。最初に5 mLの緩衝液を使用して、10 mLの低張緩衝液Aに細胞を再懸濁します。

次に、2.5 mLを加え、続いてさらに2.5 mLを加えます。ピペットを新鮮なバッファーでよく洗って、細胞を最大限に引き出します。細胞懸濁液20 mLを、しっかりとフィットする乳棒で予冷したホモジナイザーに移します。

細胞を20回のストロークで均質化します。細胞懸濁液を50ミリリットルのチューブに移します。細胞の回収率を最大限に高めるには、ホモジナイザーを3.5 mLのショ糖緩衝液で洗浄します。

この懸濁液を50 mLチューブにすばやく移して、核を保護し、漏れを制限します。細胞懸濁液の30マイクロリットルのアリコートを30マイクロリットルの4%トリパンブルーで染色し、顕微鏡で分析して溶解効率を決定します。溶解が成功した場合、すべての原子核は青色になります。

必要に応じて、均質化を繰り返します。10, 000 x gおよび4の摂氏温度で7分間遠心分離し、核をペレット化します。上清を細胞質画分として保存します。

核塩抽出可能画分の調製手順を開始するには、核ペレットを4mLのショ糖緩衝液に再懸濁します。次に、渦中で十分に混合しながら、4 mLの高塩緩衝液を一滴ずつ加えて、最終濃度300 mMの塩化ナトリウムを得ます。氷上で30分間インキュベートし、5分ごとに混合します。

次に、ショ糖緩衝液8mLを添加して、塩化ナトリウム濃度を150mMに下げます。13, 000 x gおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。塩抽出可能な画分である上清を集め、氷の上に置きます。

クロマチン結合画分を調製するには、ペレットを3.5 mLのショ糖緩衝液に細心の注意を払って再懸濁します。塩化カルシウムを最終濃度1 mMまで加えて混合します。塩化カルシウムは、後で追加されるミクロコッカスヌクレアーゼを活性化します。

懸濁液を摂氏37度で1分間予熱します。マイクロリットルあたり5単位マイクロコッカスヌクレアーゼストックの35マイクロリットルを添加して、マイクロリットルあたり25 10000単位の最終濃度を得る。摂氏37度でちょうど12分間インキュベートします。

4分ごとに混ぜます。12分後、すぐに反応を氷の上に置きます。ミクロコッカスヌクレアーゼ活性を停止するには、56マイクロリットルの5モルEDTA pH 8.0を最終濃度4 mMおよびボルテックスに加えます。

氷上で5分間インキュベートします。高振幅で毎回1分間5回超音波処理し、超音波処理の間に1分間の休憩を空けます。抽出可能な塩とヌクレオソームが豊富な画分の両方を、摂氏4度で85,000 x gで30分間遠心分離機に交換します。

上清を集めます。塩抽出可能な画分は約13mLである必要があります。そして、ヌクレアソームが濃縮された画分は約6mLであるべきです。

MyoDタンパク質複合体は、ダブルアフィニティー精製によって精製されます。FLAGベースの精製とHAベースの精製の手順は類似しているため、FLAGベースの精製のみを示します。TECNを添加した後、50mLのチューブに適量のFLAG樹脂を移し替えます。

市販の50%ストックのプレウォッシュFLAG樹脂から300μリットルのFLAG樹脂が実験ポイントごとに必要です。1, 000 x gで2分間遠心分離します。上清を取り除き、冷たいTECNを加え、再度遠心分離します。

FLAG樹脂を冷たいTECNで合計5回洗います。最後の洗浄後、FLAGレジンを等量のTECNに再懸濁します。各実験ポイントについて、300マイクロリットルの洗浄したFLAG樹脂と対応するタンパク質抽出物を混合します。

ヌクレアソーム濃縮画分には15 mLチューブを、塩抽出可能画分には50 mLチューブを使用します。回転するホイールでチューブを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、すべてのチューブを摂氏4度で1, 000 x gで2分間遠心分離します。

上清を採取し、精製効率試験の結果が得られるまで摂氏4度に保ちます。塩抽出可能なサンプルについては、FLAGレジンを4 mLのTECNに再懸濁し、15 mLチューブに移します。このステップを3回繰り返し、ビーズの損失を防ぐために、毎回同じ15mLに移します。

摂氏4度で1, 000 x gで2分間遠心分離します。上清を取り除いた後、FLAG樹脂に13 mLのTEGNを加え、摂氏4度で1, 000 x gで2分間遠心分離します。この方法でレジンを7回洗います。

最後の洗浄後、レジンを1 mLのTECNに再懸濁し、1.5 mLの低結合チューブに移します。2分間遠心分離し、上清を取り除きます。pH 7.8で4 mg / mLの100マイクロリットルのFLAGペプチド溶液に各実験ポイントの樹脂を再懸濁し、よく混ぜて100マイクロリットルのTAGNバッファーを加えます。

4°Cで少なくとも4時間インキュベートして、結合タンパク質を溶出します。2分間遠心分離し、樹脂と上清を2 mLチューブに入れた空のスピンカラムに移します。カラムを6, 000 x gで1分間遠心分離します。

残った上清を2mLのチューブに集めます。次に、HAベースの精製に進む前に、プロトコルテキストに記載されているように精製効率をテストします。ここに示されているのは、安定して発現する FLAG HA MyoD の HeLa S3 細胞株の核塩抽出可能画分またはヌクレアソーム濃縮画分から得られた二重親和性精製 MyoD 複合体の代表的な結果です。

銀染色により同定されたFLAG HA MyoDは、模擬細胞株には存在しない矢印で示されています。二重親和性精製MyoD複合体をグリセロールグラジエント上で分画しました。抗FLAG抗体を用いた画分のウェスタンブロッティングにより、2つの核内コンパートメントのMyoDサブコンプレックスが明らかになりました。

特に、塩抽出可能なMyoDは3つのサブ複合体に分布しているのに対し、クロマチン結合型MyoDは主に1つの複合体に属しています。核塩抽出可能画分およびヌクレオソーム濃縮画分から単離されたMyoD相互作用因子の質量分析により、MyoDの一連の既知のパートナーと新しいパートナーが同定されました。ここでは、両方のフラクションに見られるMyoDインタラクター、または特にフラクションの1つに見られるMyoDインタラクターは、それらの機能アノテーションに基づいてグループ化されています。

質量分析の一部では、MyoD複合体のウェスタンブロットによって相互作用が確認されたことが明らかになりました。これらには、転写因子CBF、SWI/SNFサブユニットBAF47およびHP1タンパク質が含まれます。HeLa細胞は筋細胞ではなく、通常はMyoDを発現しないため、新たに同定された相互作用者とMyoDおよび筋芽細胞との相互作用を確認する必要があります。

増殖および分化中のマウス筋芽細胞からの核総抽出物を、示された抗体を用いた免疫沈降およびウェスタン分析に使用しました。このテクニックは、一度習得すれば、適切に実行すれば2日半で完了します。この手順を試みる際には、筋芽細胞で得られた結果を精緻化することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、筋芽細胞のような関連性システムにおける特定のパートナーのノックダウンなどの他の方法を実行して、相互作用の機能的意味などの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は、発生生物学的エピジェネティクスの分野の研究者が、ほとんどの身体系における5つの転写因子の制御ネットワークを探求する道を開きます。このビデオを見れば、細胞分画とタンデムアフィニティー精製、質量分析を組み合わせて転写因子のパートナーを特定する方法についてよく理解できるはずです。