バイオフィルム関連をターゲット黄色ブドウ球菌レサズリン基づく薬剤感受性アッセイを使用して

この手順の全体的な目標は、生存率色素を使用した抗生物質感受性試験のために、蓋に取り付けられたペグ上に96ウェルプレート形式で細菌バイオフィルムを簡単かつ再現性よく成長させることです。この方法は、invivo感染状態をより代表することが多いバイオフィルム関連細胞の活性を探索することにより、抗生物質の発見および開発分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、培地の3部構成アッセイで事前に形成されたバイオフィルムに容易にチャレンジし、一般的な生存率色素を使用して阻害を決定できることです。

まず、栄養豊富な培地でバイオフィルムを生成する生物の培養物を育てます。グリセロール茎から黄色ブドウ球菌ニューマン株を10ミリリットルのMuller-Hinton培地に接種します。.黄色ブドウ球菌の取り扱いを含むすべての作業は、手袋を着用し、バイオセーフティキャビネット内で行ってください。

ロータリーシェーカーで摂氏37度で16時間インキュベートします。計算された培養量を遠心分離機のチューブに加え、バイオフィルム接種物を調製するために1 Gs.To 分間回転して細胞をペレット化し、バイオフィルム接種物を準備し、使用済み成長培地を吸引し、20ミリリットルのCRPMIで細胞ペレットを再懸濁します。200マイクロリットルのマルチチャンネルピペットを使用して、25ミリリットルのリザーバーから125マイクロリットルの接種物を底板の列AからGの各ウェルに加えます。

無菌制御として、列Hの各ウェルに125マイクロリットルの滅菌CRPMI培地を充填します。ペグの蓋を取り、ペグを下に向けてプレートの底の上に持ちます。個々のペグをそれぞれのウェルに慎重に位置合わせします。

プレートとペグの間の物理的な接触を避けてください。位置が合ったら、蓋を慎重に下げます。プレートに蓋をパラフィンフィルムで密封して蒸発を防ぎ、密封可能なビニール袋に入れてしっかりと密封します。

蒸発を最小限に抑えるために、バッグ内の空気量をできるだけ低く保ちます。プレートを摂氏37度で振とうせずに、5%二酸化炭素インキュベーターで48時間インキュベートします。バイオフィルムチャレンジの日には、新鮮な96ウェルプレートを取り、室温に平衡化した100マイクロリットルのCRPMIを、列BからHの各ウェルに加えます。

ウェルA1〜A3.200の化合物1をウェルA1〜A3.200マイクロリットル、ウェルA4〜A6.200のコンパウンド2をウェルA7〜A9の化合物3マイクロリットルに加えます。そして、井戸A10-A12中の化合物4の200マイクロリットル。マルチチャンネルピペットを使用して試験化合物を段階希釈します。

まず、100マイクロリットルをA列からB列に移し、混合します。そのようにして、100マイクロリットルをウェルツーウェルに移し続けます。各移送後に混合し、列Fで停止します.混合後、列Fから100マイクロリットルを廃棄物容器に排出します。

最後に、マルチチャンネルピペットを使用してプレートの各ウェルに100マイクロリットルのCRPMIを追加し、最終容量を200マイクロリットルにします。200マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水を、バイオフィルム開始プレートと同じ寸法のウェルを備えた新鮮で無菌の96ウェルプレートに加えます。次に、インキュベートしたバイオフィルム開始プレートからビニール袋とパラフィンフィルムを取り出します。

ペグとプレートの底が接触しないように、バイオフィルムを損傷する可能性があるため、蓋をまっすぐ持ち上げます。底部は、その後のOD600解析のために保管しておいてください。PBSの入ったプレートにペグの蓋を載せて、浮遊細胞を洗い流します。

ペグを5秒間沈めます。それらをPBSから持ち上げ、ペグが井戸の側面に当たらないように注意しながら、もう一度沈めます。すすいだペグの蓋をチャレンジプレートに入れます。

ペグと底板の間に不必要な接触をすると、バイオフィルムが損傷し、一貫性のない結果につながるため、避けてください。プレートをパラフィンフィルムで密封し、以前と同様に密封可能なビニール袋に入れます。プレートを振とうせずに、摂氏37度で5%二酸化炭素インキュベーターで24時間インキュベートします。

バイオフィルム開始プレートの底を取り、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェル内の細菌を再懸濁します。適切なマイクロプレートリーダーでOD600を測定し、すべてのウェルで発生している成長を確認しますが、列H.インキュベーションチャンバーを装備し、レサズリン変換を検出するための動的蛍光測定値を取ることができるプレートリーダーを使用します。530ナノメートルの励起と590ナノメートルの発光を使用して、24時間の動的蛍光測定を設定します。

チャンバーの温度を摂氏37度に設定し、プレートを20分ごとに読み取ります。プレートリーダーを、製造元の指示に従ってプレートの底から測定するように設定します。滅菌済みの96ウェルプレートの各ウェルに200マイクロリットルのPBSをマルチチャンネルピペットで追加して、プレートを洗浄する準備をします。

次に、20ミリリットルのCRPMI培地に400マイクロリットルの0.8ミリグラム/ミリグラムのレサズリンストック溶液を添加することにより、バイオフィルム回収培地を調製し、最終濃度が1ミリリットルあたり16マイクログラムのレサズリンになります。次に、150マイクロリットルのバイオフィルム回収培地とマルチチャンネルピペットを、新鮮な96ウェルプレートの各ウェルに加えます。チャレンジプレートをインキュベーターからバイオセーフティキャビネットに移し、ビニール袋とシーリングフィルムを慎重に取り除きます。

チャレンジプレートからペグの蓋を取り外し、以前と同様にPBSでプランクトン細胞を洗い流し、その後のOD600分析のためにチャレンジプレートの底を保持します。すすぎ後、バイオフィルム回収培地が入ったプレート底にペグ蓋を置きます。プレートの側面をパラフィンフィルムで包み、周囲のウェルの底を遮らないように注意してください。

プレートを包んだ直後に、プレートリーダーに置き、以前に作成したレサズリンキネティックプロトコルを開始して、24時間にわたってキネティックリードを開始します。チャレンジ中に発生する場合と起こらない場合のプランクトン細胞の増殖を定量化するには、マイクロプレートリーダーを使用してチャレンジプレート底部全体のOD600を読み取ります。ここに示されているのは、2つの完全希釈液を使用して化合物濃度を滴定するチャレンジプレートのレイアウトの例です。

成長したバイオフィルムは、ネオクプロインまたはその銅錯体で処理されました。24時間後のチャレンジプレート底部のOD600読み取りにより、ネオクプロイン銅錯体(ネオクプロイン単独ではなく)が、1.25マイクロモル以上の濃度で処理されたバイオフィルムからの生細胞の脱落とその後の増殖を防止したことが明らかになりました。次に、対応するバイオフィルムをレサズリンアッセイによって試験しました。

24時間後の目視検査により、複数のプレートが並行して実行されている場合、迅速な「はい」または「いいえ」の答えが可能になります。レサズリンは、生存可能なバイオフィルムのある井戸ではピンク色に変わりますが、バイオフィルムが根絶されると青色のままです。レサズリン変換の速度論的読み取りにより、ゲンタマイシンで示されているように、バイオフィルムの生存率に対する濃度依存性の影響を明らかにすることができます。

色素変換の開始における濃度依存性の遅延は、バイオフィルムの生存率の低下を示しています。この手順を試みるときは、ペグをウェルの側面にぶつけないように覚えておくことが重要です。