バイオフィルム関連をターゲット

本手順の全体的な目的は、生存率染料を用いた薬剤感受性試験のために、96ウェルプレート形式で蓋に取り付けられたペグ上に、細菌バイオフィルムを簡便かつ再現性高く育成することです。この手法は、in vivoの感染状態をより適切に反映していることが多いバイオフィルム関連細胞への活性を探索することにより、抗菌薬の探索および開発分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、3部構成のアッセイにおいて、あらかじめ形成されたバイオフィルムに容易に薬剤を投与し、一般的な生存率染料を用いて抑制効果を判定できる点にあります。

まず、栄養豊富な培地でバイオフィルム形成能を持つ生物を培養します。グリセロールストックからStaphylococcus aureus strain Newmanを10 millilitersのMuller-Hinton培地に接種します。S.aureusの取り扱いを伴うすべての操作は、手袋を着用し、バイオセーフティキャビネット内で行ってください。

ロータリーシェーカーを用いて、37 °Cで16時間インキュベートする。算出された培養液量を遠心チューブに加え、10,000 Gで1分間遠心して細胞をペレット化する。バイオフィルム接種液を調製するため、使用済みの増殖培地を吸引し、細胞ペレットを20 mLのCRPMIで再懸濁する。200 µLマルチチャンネルピペットを使用し、25 mLリザーバーから125 µLの接種液をボトムプレートのA行からG行の各ウェルに分注する。

無菌性のコントロールとして、H列の各ウェルに125 µLの滅菌CRPMI培地を満たします。ペグ付き蓋を取り、ペグを下に向けてプレート底面の上に保持します。個々のペグを対応するウェルに慎重に合わせます。

プレートとペグが物理的に接触しないようにしてください。位置を合わせた後、蓋をゆっくりと下ろします。蒸発を防ぐため、パラフィンフィルムで蓋をプレートに密閉し、密閉可能なプラスチック袋に入れてしっかりと封をしてください。

蒸発を最小限に抑えるため、バッグ内の空気量はできるだけ少なくしてください。プレートを5% Carbon Dioxideインキュベーターに入れ、37 degrees Celsiusで48時間、振盪せずにインキュベートします。バイオフィルムチャレンジの当日、新しい96ウェルプレートを用意し、室温に平衡化したCRPMIを100 microlitersずつ、B列からH列の各ウェルに加えます。最大4種類の試験化合物を、それぞれ1.0 milliliterのCRPMIで、最終希望濃度の2倍になるよう希釈します。

ウェルA1-A3に化合物1を200 µL、ウェルA4-A6に化合物2を200 µL、ウェルA7-A9に化合物3を200 µL、そしてウェルA10-A12に化合物4を200 µLずつ加えます。マルチチャンネルピペットを用いて、試験化合物を段階希釈します。

まず、行Aから行Bへ100 µLを移し、混合します。同様に、ウェルからウェルへ100 µLずつの移注を繰り返します。移注ごとに混合を行い、行Fで停止します。混合後、行Fから100 µLを廃棄容器に排出します。

G列およびH列には液体を移さないでください。最後に、マルチチャンネルピペットを使用してプレートの各ウェルにCRPMIを100 microliters加え、最終容量を200 microlitersにします。バイオフィルム形成開始プレートと同じ寸法のウェルを持つ、新しい滅菌済みの96ウェルプレートに、リン酸緩衝生理食塩水を200 microliters加えます。次に、インキュベートしたバイオフィルム形成開始プレートからプラスチックバッグとパラフィンフィルムを取り除きます。

ペグとプレート底面が接触するとバイオフィルムが損傷する可能性があるため、蓋を真っ直ぐ上に持ち上げます。その後のOD600解析のために、底面部分を保管しておきます。ペグ付きの蓋をPBSを含むプレートに入れ、浮遊細胞を洗い流します。

ペグを5秒間浸します。PBSから引き上げ、もう一度浸しますが、その際、ペグがウェルの側壁に当たらないように注意してください。洗浄したペグ蓋をチャレンジプレートに設置します。

ペグと底面のプレートが不必要に接触しないようにしてください。接触するとバイオフィルムが損傷し、結果にばらつきが生じます。プレートをパラフィンフィルムで密封し、前述と同様に密封可能なプラスチック袋に入れます。プレートを振盪させず、5% Carbon Dioxide インキュベーター内で37 degrees Celsiusで24時間培養します。

バイオフィルム形成開始プレートの底部を用い、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルの細菌を再懸濁させます。適切なマイクロプレートリーダーでOD600を測定し、H行の無菌コントロール以外のすべてのウェルで増殖が起こっていることを確認します。レサズリンの変換を検出するため、インキュベーションチャンバーを備え、キネティック蛍光測定が可能なプレートリーダーを使用してください。励起波長530 nanometer、蛍光波長590 nanometerに設定し、24時間のキネティック蛍光測定を行います。

チャンバー温度を37 °Cに設定し、20分ごとにプレートを読み取るように設定します。メーカーの指示に従い、プレートリーダーをプレートの底面から測定するように設定してください。マルチチャンネルピペットを使用して、滅菌済みの96ウェルプレートの各ウェルに200 µLのPBSを加え、プレートの洗浄準備を行います。

次に、0.8 mg/mLのレサズリンストック溶液400 µLを20 mLのCRPMI培地に加え、最終濃度が16 µg/mLとなるようにバイオフィルム回復培地を調製します。続いて、マルチチャンネルピペットを用いて、新しい96ウェルプレートの各ウェルにバイオフィルム回復培地を150 µLずつ分注します。チャレンジプレートをインキュベーターからバイオセーフティーキャビネットへ移動させ、プラスチック袋とシーリングフィルムを慎重に取り除きます。

チャレンジプレートからペグリッドを取り外し、前述と同様にPBSでプランクトン細胞を洗い流します。この際、後のOD600解析に使用するため、チャレンジプレートの底部は保管しておきます。洗浄後、ペグリッドをバイオフィルム回収培地が入ったプレート底部に設置します。プレートの側面をパラフィンフィルムで包みますが、外周ウェルの底部を塞がないように注意してください。

プレートをラップした直後にプレートリーダーにセットし、あらかじめ作成したレサズリン速度論プロトコルを開始して、24時間にわたるキネティック測定を行います。チャレンジ期間中にプランクトン細胞の増殖が起こったかどうかを定量するため、マイクロプレートリーダーを用いてチャレンジプレート底面のOD600を測定します。ここでは、化合物の濃度を滴定するために2段階の全希釈を用いたチャレンジプレートのレイアウト例を示します。

形成されたバイオフィルムを、ネオクプロインまたはその銅錯体で処理した。24時間後のチャレンジプレート底面のOD600測定値から、1.25 micromolar以上の濃度において、ネオクプロイン単独ではなく、ネオクプロイン銅錯体が処理済みバイオフィルムからの生存細胞の脱落およびその後の増殖を抑制することが明らかになった。続いて、対応するバイオフィルムをレサズリンアッセイで評価した。

24時間後の目視検査により、複数のプレートを並行して処理している場合に、陽性か陰性かを迅速に判断できます。生存しているバイオフィルムが存在するウェルではレサズリンがピンク色に変化しますが、バイオフィルムが除去された場合は青色のままです。レサズリン変換のキネティック測定を行うことで、ここでゲンタマイシンを用いて示しているように、バイオフィルムの生存率に対する濃度依存的な影響を明らかにできます。

色素変換の開始における濃度依存的な遅延は、バイオフィルムの生存率の低下を示しています。この操作を行う際は、ペグをウェルの壁面にぶつけないように注意することが重要です。