Name: バイオフィルム関連をターゲット黄色ブドウ球菌レサズリン基づく薬剤感受性アッセイを使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学ぶバイオフィルム関連の黄色ブドウ球菌に対する薬剤感受性アッセイ法。レサズリンを用いた96ウェルプレート形式の検定により、バイオフィム関連細菌に対する抗菌化合物の効果を評価し、抗生物質開発に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

技術支援を提供してくださったSaran Kupulに感謝します。この作業は、NIHのFWへのR01-AI104952助成金によって部分的に支援されました。さらに、アラバマ大学バーミンガム校(UAB)のエイズ研究センター(CFAR)は、NIHが資金提供するプログラム(P30 AI027767)で、NIHのNIAID、NIMH、NIDA、NICHD、NHLDI、NIAのNIH研究所によって可能になりました。

1.バイオフィルム開始<ol><li>栄養豊富な培地中でバイオフィルム産生生物の文化を育てます。グリセロールストックからミューラーヒントン培地10mlに黄色ブドウ球菌株ニューマンを接種します。 S.の取り扱いに関わるすべての作業を実行します手袋と安全キャビネット内球菌 。 </li><li>ロータリーシェーカー（100〜200回転）に37℃で16時間インキュベートします。 </li><li>分光光度計と標準キュベット（：1センチメートル経路長）を用いて培養のOD 600を決定します 。 </li><li>式を使用してchelexedロズウェルパーク記念研究所培地（cRPMI中）9で0.1のOD 600（接種材料）で接種物の20ミリリットルを準備するために必要な培養液量（V）を計算します。[V = 20ミリリットル* 0.1 / OD 600（文化）] 注：リファレンス9のcRPMIの準備の詳細を提供します。 <ol><li>万×gで1分間回転させることによって遠心分離管、ペレット細胞に（上から）計算培養容量を加えます。 prepaへバイオフィルム接種再、20ミリリットルのcRPMIで過ごした成長培地を再懸濁細胞ペレットを吸引。 </li></ol></li><li> 25ミリリットルのリザーバーに接種材料を注ぎます。 </li><li>慎重にそれをまっすぐに引き上げて、滅菌96ウェルペグプレートからふたを外します。 注意：注意は、蓋から垂下ペグを汚染しないように注意する必要があります。蓋は安全キャビネット内の清浄表面上に逆さまに配置することができます。 </li><li> 200μlのマルチチャンネルピペットを用いて、底板のGへの行の各ウェルに125μlの接種材料を追加します。 </li><li>無菌性制御などの行Hの各ウェル中の125μlの無菌のcRPMI培地を記入してください。 </li><li>ペグ蓋を取り、下に向けペグ付きプレート底部の上にそれを保持します。慎重に、それ​​ぞれのウェルを有する個々のペグの位置を合わせます。プレートとペグの間の物理的接触を避けてください。整列した後、慎重にダウン蓋を下げます。ペグの後に行われる再調整が底板は続きがあり触れてきたようにミスアライメントを避けます行Hのアミ無菌コントロール</li><li>しっかりとシール、密封可能なビニール袋に蒸発し、場所を防止するために、パラフィンフィルムでプレートに蓋をシール。蒸発を最小限に抑えるために、できるだけ低くバッグ内の空気量を保ちます。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター中で48時間37℃で振盪せずにインキュベートします。 注：成長の48時間は、Sのために最適となっています黄色ブドウ球菌が、使用する生物に基づいて異なります。 注：静的なインキュベーションは、アッセイを最適化するための良い出発点ですが、静かにマイクロプレートシェーカー上で150 rpmで振とうすると、一部のS.のバイオフィルムの形成を促進する可能性のある変動であります黄色ブドウ球菌が分離します。 </li></ol>バイオフィルムチャレンジプレートの調製<ol><li>バイオフィルムチャレンジの日に新鮮な96ウェルプレートを取ると、一貫性のない結果を回避するために、行の各ウェルBにHに、RTに平衡化のcRPMIの100μLを、追加、200μLを保持することができ、96ウェルプレートを利用メディアのペグが内側であり、バイオフィルム開始プレートのものと同一の寸法でウェルを備えていたとき。 </li><li>ステップ2.7での最終希釈を考慮するために、所望の最終濃度を2倍のcRPMI中の1.0ミリリットルで別々に4試験化合物まで希釈します。 注：良い出発点は、浮遊細胞の阻害濃度以上の8倍です。 </li><li> A3、ウェルA12にA10のA9にウェルA7におけるA6にウェルA4中の化合物2、化合物3および化合物4に、ウェルA1に化合物1の200μLを加えます。 </li><li>シリアルマルチチャンネルピペットを用いて、試験化合物を希釈し、B行と混合するためにA列から100μlのを転送します。 </li><li>そのようにして、ウェルによく100μlのを転送し続けます。各転送後に混合し、行Fに停止</li><li>混合した後、廃棄物容器に行Fから100μLを追放します。行GとHに液体を転送しないでください</li><li>にマルチチャンネルピペットを用いてプレートの各ウェルにcRPMI中の100μlのを追加します。200μlにボリュームをもたらします。最終的なプレートレイアウトについては、 図1を参照してください。 </li></ol> 3.バイオフィルムチャレンジ<ol><li>バイオフィルム開始プレートのものと同一の寸法を有するウェルを備え、新鮮な滅菌96ウェルプレートにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の200μlのを追加します。 </li><li>インキュベートバイオフィルム開始プレートからプラスチックの袋とパラフィン膜を除去。 </li><li>まっすぐふたを持ち上げます。バイオフィルムを損傷する恐れがあり、このようペグとプレート底部との接触を避けてください。 （3.8を参照）、その後のOD 600の分析のために底部を保管してください。 </li><li> （ステップ3.1から）PBSを含むプレート上にペグ蓋を配置することにより、浮遊細胞を洗い流します。 PBSの外に持ち上げ、5秒間ペグ水没し、ウェル側面に対するペグをヒットしないように注意して、もう一度水没。 </li><li>チャレンジプレートにすすぎペグ蓋を置きます。これはにつながるバイオフィルムにダメージを与えますようにペグと底板との間に不必要な接触を避けます一貫性のない結果。 </li><li>シールパラフィンフィルムでプレートし、ステップ1.10で説明したように密封可能なビニール袋に入れます。 </li><li> 5％CO 2インキュベーター内で37℃で24時間振盪せずにプレートをインキュベートします。 </li><li> 3.3からバイオフィルム開始プレートの底を取ります。各ウェルにマルチチャンネルピ ​​ペットを使用して細菌を再懸濁し、全てのウェルに生じる成長を確認するために、適切なマイクロプレートリーダーでOD 600を測定するが、行Hの無菌コントロール</li></ol> 4.バイオフィルムの決意<ol><li>インキュベーションチャンバーとレサズリン変換を検出するための運動蛍光測定値をとることができる装備プレートリーダーを使用してください。 530nmの励起および590nmの発光を用いて24時間の運動蛍光測定を設定します。 </li><li> 37℃に室内温度を設定し、プレートを20分ごとを読んでいます。メーカーのinstrucに係るプレートの底から測定するために、プレートリーダーを設定します。ション。 </li><li>滅菌96ウェルプレートにマルチチャンネルピペットを用いて200μlのPBSを添加することにより、洗浄プレートを準備します。 </li><li> 0.8ミリグラムの400μLを添加することによって、バイオフィルムの回復培地を調製/ 16 / mlのレザズリンの最終濃度までのcRPMI培地20mlのストック溶液をレサズリンmLです。 注：レサズリンは、既知の皮膚刺激性です。処理中に白衣、スプラッシュゴーグル、手袋を使用してください。バイオフィルムの回復メディアとしてのcRPMIは、最低のバックグラウンド信号を提供するために使用したが、適切な場合には、ミューラーヒントン培地に置き換えることができます。 </li><li>新鮮な96ウェルプレートの各ウェルにマルチチャンネルピペットを用いてバイオフィルムの回復培地150μlを添加します。 </li><li>安全キャビネットに移すインキュベーターからチャレンジプレートと慎重にビニール袋を取り外し、封止膜。 </li><li>チャレンジプレートからペグ蓋を外し、3.4で説明したようにPBSに浮遊細胞を洗い流してください。その後のOD 600 ANAための挑戦プレートの底を保ちます溶解（4.10を参照）。 </li><li>すすいだ後、バイオフィルムの回復培地を含むプレート底部にペグ蓋を置きます。 </li><li>周囲のウェルの底を妨げないように注意しながら、パラフィンフィルムでプレートの側面を包みます。すぐにプレートをラップした後、プレートリーダーの上に置き、ステップ4.1から以前に運動プロトコルリザズリン製を開始することにより、24時間の期間にわたって運動の読み取りを開始します。 </li><li>または挑戦中に発生してもしなくてもよい浮遊細胞の成長を定量化するために、マイクロプレートリーダーを使用して、全体チャレンジプレート底部のOD 600を読み取ります。ステップ3.8で与えられた指示に従ってください。 注：バイオフィルムをオフに流して細胞がウェルの底に塊に成長する傾向があるとして慎重に各ウェルの内容を再懸濁します。ウェル内の気泡を強くOD 600の読みを妨害する、回避または読み取りの前に除去されなければなりません。 </li></ol>

<ol><li>Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+insights+from+biofilm+biology+to+drug+development+-+can+a+new+approach+be+developed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed.</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).</li>
<li>Song, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prosthesis+infections+after+orthopedic+joint+replacement%3A+the+possible+role+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Rev+%28Pavia%29%22%5BJournal%5D)">Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms.</a> Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+from+the+natural+environment+to+infectious+diseases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases).</a> Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).</li>
<li>Bordi, C., de Bentzmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hacking+into+bacterial+biofilms%3A+a+new+therapeutic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intensive+Care%22%5BJournal%5D)">Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge.</a> Ann Intensive Care. 1, 19(2011).</li>
<li>Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+laboratory+reference+strains+mirror+%27real-world%27+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis?</a> Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).</li>
<li>Kwasny, S. M., Opperman, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+biofilm+cultures+of+Gram-positive+pathogens+grown+in+a+microtiter+format+used+for+anti-biofilm+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery.</a> Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18(2010).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MBEC+Assay+System%3A+multiple+equivalent+biofilms+for+antibiotic+and+biocide+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing.</a> Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinical+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Baker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+stress+induces+a+global+stress+response+in+Staphylococcus+aureus+and+represses+sae+and+agr+expression+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation.</a> Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).</li>
<li>Haeili, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper+complexation+screen+reveals+compounds+with+potent+antibiotic+properties+against+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).</li>
<li>O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+Alamar+Blue+%28resazurin%29+fluorescent+dye+for+the+assessment+of+mammalian+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity.</a> Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).</li>
<li>Mah, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+minimal+bactericidal+concentration+of+an+antimicrobial+agent+for+planktonic+cells+%28MBC-P%29+and+biofilm+cells+%28MBC-B%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B).</a> J Vis Exp. (83), e50854(2014).</li>
<li>Junker, L. M., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screens+for+small-molecule+inhibitors+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).</li>
<li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persisters%3A+a+distinct+physiological+state+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persisters: a distinct physiological state of E. coli.</a> BMC Microbiol. 6, 53(2006).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riddle+of+biofilm+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Riddle of biofilm resistance.</a> Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、Sでテストした阻害剤の活性を測定するために修飾バイオフィルムアッセイを記載していますバイオフィルム関連する細胞の代謝状態に焦点を当て球菌バイオフィルム。記載のバイオフィルムの開始とチャレンジ手順主に模倣メーカーの推奨事項が、24時間の阻害剤の挑戦を生き残るバイオフィルム関連細胞を検出し、定量化するための色素をレサズリンの使用は劇的に細胞（水浴の超音波処理を介して）回復とそれに続く列挙の推奨手順を簡素化CFUの計数を経由しての生細胞。このメーカー推奨の手順は、それらの各エラーを起こしやすい、労働集約、および自動化することは非現実的に少なくとも5つの追加操作ステップを伴います。ペグプレートアッセイの読み出し手順を簡素化することの利点は、高スループット動作及びアプリケーションのための魅力を増加させます。 ステップ数によって長いプロトコル、このprocedurけれどもeは、いくつかの重要なステップで、かなり概念的には簡単です。最も決定的に、繰り返し同じ品質のバイオフィルムを増殖する能力は、再現性のある結果を得るために必須です。ペグ蓋を取り外しま...

病原性微生物は、非急性慢性感染1に導くインビボでバイオフィルムを形成することができます。バイオフィルム関連感染は、異物（ 例えば、人工骨置換、乳房インプラント）、または気管チューブまたは尿道カテーテル2のインストールの注入を伴う医療処置の重大な危険因子です。バイオフィルムベースの感染はめったに自分でクリアされないように、これらの状況では、抗感染療法も免疫応答性個体では、ほとんど常に必要である。 黄色ブドウ球菌は、の使用中に発生するバイオフィルム関連の合併症に関与し、最も頻繁に観察された病原体の一つであります侵襲性医療機器3。 残念ながら、保護バリアとしてのバイオフィルムの本質は、浮遊細胞1,4より治療に対してより耐性になり、予測臨床的有効性の評価は、両方の初期の重要な部分です医薬品開発だけでなく、薬剤耐性サーベイランス。プランクトンの文化に焦点を当てた実験室条件は、忠実に実世界の疾病5を表していない可能性があること増加肯定応答があります。さらに問題を配合、バイオフィルムの表現型の複製は困難であり、既存のバイオフィルムモデルは面倒であり、高間およびアッセイ内変動6苦しみます。このように、多くの研究者は、必要を通じて、それによって潜在的に細菌毒性および疾患の重要な側面を無視し、薬剤感受性の浮遊性細胞アッセイをデフォルトに。 ここでは、具体的には、S、細菌をアッセイするためのプロトコルを記述します96ウェルベースのバイオフィルムシステム7,8を利用して事前に成長したバイオフィルム中の黄色ブドウ球菌 、。バイオフィルム形成と挑戦のためのプロトコルは、本質的に製造業者の勧告に従っているが、我々はbioF遺伝子の生存率を定量化するための代替情報が豊富な方法論を提示しますチャレンジ後ILM。簡単に説明すると、細菌がバイオフィルムは、プレートの蓋に取り付けられた突出ペグに形成ペグプレートで培養されます。バイオフィルム形成後、ペグは穏やかに浮遊細胞を除去するためにPBSで満たされた新鮮なプレートのウェル中に浸漬されています。ペグ蓋は、添付のバイオフィルムで、アッセイされる抗生物質の種々の濃度を含む、新規のチャレンジプレートに移します。第二のインキュベーションの後、蓋を再び取り出し、洗浄し、そしてそれらが最終インキュベーションを受けるレサズリン色素を含有する回収プレートに移します。レサズリン変換を動力学的に記録された、または定義された回復期間の後、エンドポイントの読み取りとすることができます。独自プロトコル7に記載され、このバイオフィルムの生存率を定量化するの染料ベースの方法は退屈CFU（コロニー形成単位）かなり異なるカウントベースの方法論。 OD薬物挑戦板とレサズリン変換速度の600の測定値は、生存率のリードとして働きますそれぞれプランクトンとバイオフィルム細胞のアウト、バイオフィルムの生存のための高速で信頼性の高い、情報が豊富で技術的に簡単な分析を提供しています。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;Mueller-Hinton Medium</td><td>Oxoid</td><td>CM0405</td><td></td></tr><tr><td>メーカーRPMI-medium</td><td>Corning&nbspの</td>推奨に従ってください。<td>17-105-CV</td><td></td></tr><tr><td>CRPMI</td><td>Ref 9</td><td></td><td>RPMI-1640 ミディアム Chelex 100 樹脂で 1 時間チェレックス 1640 充填後、10% アンチェレックス RPMI-1640</td></tr><tr><td>Chelex 100 樹脂</td><td>バイオ ラッド</td><td>142-2822</td><td></td></tr><tr><td>MBEC プレート</td><td>Innovotech</td><td>19111</td><td></td></tr><tr><td>レサズリン ナトリウム塩</td><td>Σ</td><td>R7017</td><td>800 & マイクロ;脱イオン水中のg/ml&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;フィルター滅菌</td></tr><tr><td>マイクロプレート振とうプラットフォーム&nbsp;</td><td>ハイドルフ タイトラマックス 1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 プレート リーダー</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gen5 ソフトウェア</td><td>Biotek</td><td></td><td>レサズリン変換の記録と分析</td></tr><tr><td>ネオクプロイン</td><td>シグマ</td><td>N1501&nbsp;</td><td>100%エタノールで10 mMストックを調製し、-80 & ordmで保存します。C</td></tr><tr><td>硫酸銅</td><td>Acros Organics</td><td>7758-99-8</td>は<td>、水で100 mMのストック溶液を準備し、4 & ordmで保存します。C</td></tr><tr><td>Cu-ネオクプロイン</td><td>自作</td><td></td><td>ネオクプロインと硫酸銅の等しいモル濃度を混合して生成します。混合物をCRPMI培地で所望の濃度に希釈した。</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>シグマ</td><td>G3632-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

バイオフィルム関連をターゲット<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;レサズリン基づく薬剤感受性アッセイを使用して

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

ほとんどの病原菌は感染中にバイオフィルムを形成することができますが、バイオフィルムの操作と評価が難しいため、実験室での作業の大部分はプランクトン細胞で行われています。ここでは、黄色ブドウ球菌を用いて実施されるペグプレートバイオフィルムアッセイについて説明します。細菌バイオフィルムは、96ウェルマイクロタイタープレートの蓋に取り付けられたペグで増殖し、バッファーに穏やかに浸して洗浄し、薬物チャレンジプレートに入れます。その後のインキュベーション後、それらを再び洗浄し、蛍光色素レサズリンが生存率の指標として機能する最終回収プレートに移します。このアッセイは、使いやすさ、信頼性、再現性が大幅に向上し、キネティックリードとして実施した場合に豊富なデータを提供します。さらに、このアッセイは、エンドポイントの蛍光読み出しを代わりに行うミディアムスループットの薬物スクリーニングアプローチに適合させることができ、創薬努力の道筋を提供します。

レサズリンアッセイは確実に挑戦した後、薬剤を含まない培地中で複製することができる非常に少数の生存可能な細胞を検出するのに十分な感度です。この方法論では、我々は何のレサズリン変換は24時間以内に見られない最低の濃度として最小のバイオフィルム根絶濃度を定義します。レサズリンアッセイは、青からピンクへの染料の色を変換する代謝的に活性な細胞に見られる酸化的分子に依存しています。染料の変換は、このように、細胞増殖の指標であり、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて定量することができます。本論文では、ネオクプロインとCu-ネオクプロイン（銅と複合体を形成ネオクプロイン）はS.関連するバイオフィルムに向かってそれらの活性について試験しました黄色ブドウ球菌は、 図1に基づいてレイアウトを適用する。プロトコルの実行中に得られたデータは、品質管理として機能するバイオフィルムの開始プレートのOD 600読み取りである（データは示していません）プレート底部の、OD 600</su...

ほとんどの細菌感染症はバイオフィルムを生成します。その環境のおかげで、バイオフィルム関連細菌はしばしば表現型的に薬剤耐性があります。したがって、バイオフィルム中の細菌を殺す新しい抗菌分子は、高い優先順位です。バイオフィルムの根絶に有効な抗菌化合物を迅速にスクリーニングするためのアッセイを確立します。

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

本手順の全体的な目的は、生存率染料を用いた薬剤感受性試験のために、96ウェルプレート形式で蓋に取り付けられたペグ上に、細菌バイオフィルムを簡便かつ再現性高く育成することです。この手法は、in vivoの感染状態をより適切に反映していることが多いバイオフィルム関連細胞への活性を探索することにより、抗菌薬の探索および開発分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、3部構成のアッセイにおいて、あらかじめ形成されたバイオフィルムに容易に薬剤を投与し、一般的な生存率染料を用いて抑制効果を判定できる点にあります。まず、栄養豊富な培地でバイオフィルム形成能を持つ生物を培養します。グリセロールストックからStaphylococcus aureus strain Newmanを10 millilitersのMuller-Hinton培地に接種します。S.aureusの取り扱いを伴うすべての操作は、手袋を着用し、バイオセーフティキャビネット内で行ってください。ロータリーシェーカーを用いて、37 °Cで16時間インキュベートする。算出された培養液量を遠心チューブに加え、10,000 Gで1分間遠心して細胞をペレット化する。バイオフィルム接種液を調製するため、使用済みの増殖培地を吸引し、細胞ペレットを20 mLのCRPMIで再懸濁する。200 µLマルチチャンネルピペットを使用し、25 mLリザーバーから125 µLの接種液をボトムプレートのA行からG行の各ウェルに分注する。無菌性のコントロールとして、H列の各ウェルに125 µLの滅菌CRPMI培地を満たします。ペグ付き蓋を取り、ペグを下に向けてプレート底面の上に保持します。個々のペグを対応するウェルに慎重に合わせます。プレートとペグが物理的に接触しないようにしてください。位置を合わせた後、蓋をゆっくりと下ろします。蒸発を防ぐため、パラフィンフィルムで蓋をプレートに密閉し、密閉可能なプラスチック袋に入れてしっかりと封をしてください。蒸発を最小限に抑えるため、バッグ内の空気量はできるだけ少なくしてください。プレートを5% Carbon Dioxideインキュベーターに入れ、37 degrees Celsiusで48時間、振盪せずにインキュベートします。バイオフィルムチャレンジの当日、新しい96ウェルプレートを用意し、室温に平衡化したCRPMIを100 microlitersずつ、B列からH列の各ウェルに加えます。最大4種類の試験化合物を、それぞれ1.0 milliliterのCRPMIで、最終希望濃度の2倍になるよう希釈します。ウェルA1-A3に化合物1を200 µL、ウェルA4-A6に化合物2を200 µL、ウェルA7-A9に化合物3を200 µL、そしてウェルA10-A12に化合物4を200 µLずつ加えます。マルチチャンネルピペットを用いて、試験化合物を段階希釈します。まず、行Aから行Bへ100 µLを移し、混合します。同様に、ウェルからウェルへ100 µLずつの移注を繰り返します。移注ごとに混合を行い、行Fで停止します。混合後、行Fから100 µLを廃棄容器に排出します。G列およびH列には液体を移さないでください。最後に、マルチチャンネルピペットを使用してプレートの各ウェルにCRPMIを100 microliters加え、最終容量を200 microlitersにします。バイオフィルム形成開始プレートと同じ寸法のウェルを持つ、新しい滅菌済みの96ウェルプレートに、リン酸緩衝生理食塩水を200 microliters加えます。次に、インキュベートしたバイオフィルム形成開始プレートからプラスチックバッグとパラフィンフィルムを取り除きます。ペグとプレート底面が接触するとバイオフィルムが損傷する可能性があるため、蓋を真っ直ぐ上に持ち上げます。その後のOD600解析のために、底面部分を保管しておきます。ペグ付きの蓋をPBSを含むプレートに入れ、浮遊細胞を洗い流します。ペグを5秒間浸します。PBSから引き上げ、もう一度浸しますが、その際、ペグがウェルの側壁に当たらないように注意してください。洗浄したペグ蓋をチャレンジプレートに設置します。ペグと底面のプレートが不必要に接触しないようにしてください。接触するとバイオフィルムが損傷し、結果にばらつきが生じます。プレートをパラフィンフィルムで密封し、前述と同様に密封可能なプラスチック袋に入れます。プレートを振盪させず、5% Carbon Dioxide インキュベーター内で37 degrees Celsiusで24時間培養します。バイオフィルム形成開始プレートの底部を用い、マルチチャンネルピペットを使用して各ウェルの細菌を再懸濁させます。適切なマイクロプレートリーダーでOD600を測定し、H行の無菌コントロール以外のすべてのウェルで増殖が起こっていることを確認します。レサズリンの変換を検出するため、インキュベーションチャンバーを備え、キネティック蛍光測定が可能なプレートリーダーを使用してください。励起波長530 nanometer、蛍光波長590 nanometerに設定し、24時間のキネティック蛍光測定を行います。チャンバー温度を37 °Cに設定し、20分ごとにプレートを読み取るように設定します。メーカーの指示に従い、プレートリーダーをプレートの底面から測定するように設定してください。マルチチャンネルピペットを使用して、滅菌済みの96ウェルプレートの各ウェルに200 µLのPBSを加え、プレートの洗浄準備を行います。次に、0.8 mg/mLのレサズリンストック溶液400 µLを20 mLのCRPMI培地に加え、最終濃度が16 µg/mLとなるようにバイオフィルム回復培地を調製します。続いて、マルチチャンネルピペットを用いて、新しい96ウェルプレートの各ウェルにバイオフィルム回復培地を150 µLずつ分注します。チャレンジプレートをインキュベーターからバイオセーフティーキャビネットへ移動させ、プラスチック袋とシーリングフィルムを慎重に取り除きます。チャレンジプレートからペグリッドを取り外し、前述と同様にPBSでプランクトン細胞を洗い流します。この際、後のOD600解析に使用するため、チャレンジプレートの底部は保管しておきます。洗浄後、ペグリッドをバイオフィルム回収培地が入ったプレート底部に設置します。プレートの側面をパラフィンフィルムで包みますが、外周ウェルの底部を塞がないように注意してください。プレートをラップした直後にプレートリーダーにセットし、あらかじめ作成したレサズリン速度論プロトコルを開始して、24時間にわたるキネティック測定を行います。チャレンジ期間中にプランクトン細胞の増殖が起こったかどうかを定量するため、マイクロプレートリーダーを用いてチャレンジプレート底面のOD600を測定します。ここでは、化合物の濃度を滴定するために2段階の全希釈を用いたチャレンジプレートのレイアウト例を示します。形成されたバイオフィルムを、ネオクプロインまたはその銅錯体で処理した。24時間後のチャレンジプレート底面のOD600測定値から、1.25 micromolar以上の濃度において、ネオクプロイン単独ではなく、ネオクプロイン銅錯体が処理済みバイオフィルムからの生存細胞の脱落およびその後の増殖を抑制することが明らかになった。続いて、対応するバイオフィルムをレサズリンアッセイで評価した。24時間後の目視検査により、複数のプレートを並行して処理している場合に、陽性か陰性かを迅速に判断できます。生存しているバイオフィルムが存在するウェルではレサズリンがピンク色に変化しますが、バイオフィルムが除去された場合は青色のままです。レサズリン変換のキネティック測定を行うことで、ここでゲンタマイシンを用いて示しているように、バイオフィルムの生存率に対する濃度依存的な影響を明らかにできます。色素変換の開始における濃度依存的な遅延は、バイオフィルムの生存率の低下を示しています。この操作を行う際は、ペグをウェルの壁面にぶつけないように注意することが重要です。

targeting-biofilm-associated-staphylococcus-aureus-using-resazurin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

現在の診断抗菌薬感受性試験では、栄養豊富な、好気的条件下での分離株のプランクトンの成長に依存しています。ここでは、嚢胞性線維症の肺のより代表的な好気性および微好気性条件の両方の下で緑膿菌バイオフィルムの抗菌薬感受性を検討する別の人工痰媒体を採用しています。...

に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用<em&gt;緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）</em&gt;肺嚢胞性線維症へのより適切な条件で

出典: Bucher, T.ら 。 B. subtilisバイオフィルムを小分子バイオフィルム阻害剤の特性評価モデルとして研究する方法。 J. Vis. Exp.

バイオフィルムマトリックスの完全性を評価するためのエタノール耐性アッセイ

出典: Zhang, M. ら、 単一細菌における重水素取り込みの刺激ラマン散乱イメージングによる迅速抗菌薬感受性試験。J. Vis. Exp.

誘導ラマン散乱顕微鏡を用いた細菌抗生物質感受性の検出

このビデオでは、ペグプレートを使用してバイオフィルムを効率的に除去する抗菌化合物をスクリーニングするアッセイを示しています。この方法論は、抗菌化合物で処理した後のバイオフィルムの代謝状態をモニターし、バイオフィルムの最小根絶濃度の決定を容易にします。...

抗菌剤をスクリーニングするためのペグプレートバイオフィルムアッセイ

溶菌ファージバイオセンサーと抗体ビーズメチシリン耐性（MRSA）と敏感ブドウ球菌の細菌を区別することができます。ファージを水晶振動子マイクロバランスセンサーの表面上にラングミュア·ブロジェット法で固定し、広範囲のブドウ球菌プローブとして働いていた。抗体ビーズはMRSAを認識しています。...

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

バイオフィルム感染症は、化学療法に対して高い耐性を示します。バイオフィルムの複雑さを捉える単一のアッセイはありません。代わりに、補完的なアッセイが必要です。生存率、バイオマス、およびバイオフィルムマトリックスのアッセイを組み合わせたスクリーニングプラットフォーム(黄色ブドウ球菌用に開発された)を紹介します。これにより、長期的な化学療法効果の評価を含む、抗バイオフィルム創薬が可能になります。...

天然化合物ライブラリーの探査に適した抗バイオフィルムアッセイのプラットフォーム

このプロトコルは、 黄色ブドウ球菌...

黄色 ブドウ球菌 内在化と抗菌性化合物の細胞内有効性を研究するための酵素保護アッセイの改善

この方法論により、研究および臨床検査室での抗菌剤感受性試験のための嚢胞性線維症における多微生物バイオフィルムモデルの確立が可能になります。このモデルは、さまざまな出力に対して正確で信頼性の高い結果を提供します。...

嚢胞性線維症における抗菌薬試験のための多微生物コロニーバイオフィルムモデルの開発

アッセイは、細菌および真菌の早期のバイオフィルム形成を測定する迅速な手段を説明します。このメソッドは、微生物のバイオフィルム形成のための基層としてのマイクロタイタープレートを使用し、バイオフィルムは、クリスタルバイオレットの菌株を用いて可視化です。アッセイは、どちらかの初期のバイオフィルム形成のための定性的または定量的なアッセイを提供する。...

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

ドリップ流反応器と回転するディスクの原子炉とオープンシステムの流れのバイオフィルムを利用するためのプロトコルを詳細に表示されます。...

用ドリップ流れと回転円板の原子炉の使用黄色ブドウ球菌バイオフィルム分析

学ぶバイオフィルム関連の黄色ブドウ球菌に対する薬剤感受性アッセイ法。レサズリンを用いた96ウェルプレート形式の検定により、バイオフィム関連細菌に対する抗菌化合物の効果を評価し、抗生物質開発に貢献する。

バイオフィルム関連をターゲット

さらに動画を探す