ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

この外科的介入の全体的な目標は、機能不全の網膜色素上皮 (RPE) を置き換えて、加齢性黄斑変性症などの RPE 関連疾患の可能な治療法を見つけることです。この方法は、細胞ベースの治療と加齢性黄斑変性症に関する検眼分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞置換基質または薬物送達デバイスを網膜下空間に輸送モダリティを提供できることです。

この方法は、ウサギの硝子体切除術や網膜下手術に関する洞察を提供する可能性がありますが、ブタ、サル、ヒトなどの他のモデル生物にも使用できます。一般的に、眼内手術が複雑であるだけでなく、この手順の人員、組織、および技術も十分に同期する必要があるため、この方法に不慣れな個人は苦労するでしょう。この装置装填手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるFabian Thieltgesと外科スクラブ看護師のRalf Brinkenです。

手術を開始する前に、適切な麻酔レベルを確認し、動物のもう一方の未手術の目に眼軟膏を塗布します。次に、ウサギの左側を手術用顕微鏡の下に置き、右目を上に向け、鼻を毛布の折り目でわずかに持ち上げます。数滴のポビドンヨードで1分間目を消毒します。

次に、滅菌BSSで目をすすぎ、動物の頭を事前にカットされた目の開口部を備えた滅菌ドレープで覆います。12 x 17センチメートルの粘着性のある外科的切開ドレープを目の上に置き、ハサミを使用して正中線水平切開で目を露出させます。逆キャリパーを使用して、目を支柱の位置に移動し、3-0シルク縫合糸で組織を固定します。

次に、Vannasのハサミを使用して、隣接する血管から約1ミリメートルの辺縁部に近い結膜を切開し、輪部と平行に腹膜を拡大します。結膜を鈍く分離し、続いて垂直に6〜7ミリメートルの垂直切開を行って、結膜にT"を作ります。2時の位置で別の小さなペリトミーを作ります。

次に、23ゲージの微小硝子体網膜ブレードの先端を強膜に慎重に挿入し、8時の位置でリンバスから3.5ミリメートルの眼の後極を指しています。切開部が拡大するのを避けるために、ブレードを同じ方向にゆっくりと引っ込め、7-0 Vicryl縫合糸を事前に配置します。次に、カスタムサイドポート注入カニューレを強膜開口部に挿入し、事前に配置された縫合糸を使用してカニューレを固定します。

眼圧を20〜24ミリメートル水銀柱に設定します。次に、25ゲージのフラットヘッドトロカールを使用して2時の位置で強膜を貫通し、25ゲージのシャンデリアライトをポートに挿入します。ライトをテープで固定し、約30%の電力に調整してから、個別に調整します。

20メスを使用して浮腫性角膜上皮を切除し、眼内視界の改善を促進します。次に、10時位置にある23ゲージの微小硝子体網膜ブレードで別の強膜切開を行い、結び目を完全に結ばずに、切開した強膜の周りにU字型の7-0 Vicryl縫合糸を配置します。高速硝子体の先端を切開部に挿入し、入口ポートの周りで硝子体切除を開始します。

硝子体液を毎分最大2, 000〜3, 000カットで小片に切り、視神経乳頭と線維髄質の硝子体切除術を継続し、最大200ミリメートルの水銀で吸引します。硝子体液を網膜から穏やかに分離するために、硝子体を椎間板の後極と下極に保持し、切断せずに吸引を続けます。後部硝子体の剥離が完了したら、硝子体内に約50マイクロリットルの目的の化合物を注入して、ほぼ全除去中の浮遊硝子体を視覚化します。

眼球の準備ができたら、移植細胞培養液を未添加の眼科用BSSで3回すすぎます。次に、100 x 20 mmの細胞培養ディッシュに10 mmの眼科用BSSを入れ、細胞培養インサートをディッシュに加えます。光学顕微鏡で皿の中央に置き、鋭利な楕円形のカスタムメイドの中空針を使用して、細胞培養物から2つの長辺と2つの丸い端を持つ平らな豆形の2.4 x 1.1 mmの基質を打ち抜きます。

2番目のポートに針をBSSで静かに浸し、インプラントをBSSで満たされた細胞培養皿に洗い流します。3番目のエッジを得るには、インプラントの丸い端の1つに0.5ミリリットルの切開を行い、23ゲージの膜剥離鉗子を使用してインプラントをカスタムメイドのローディングステーションに移します。インプラントが直立位置にあることを確認してから、鉗子を使用してインプラントをシューター器具に完全にゆっくりと押し込み、すべての組織が先端の内側に固定されるまでシューターチップをBSSの下のローディングステーションに配置します細胞が埋め込まれるまで

網膜下に細胞を移植できるようにするには、気密注射器に接続された拡張可能な41ゲージの網膜下注射針で神経網膜に近づき、BSSを網膜下に注入して網膜剥離を作成します。ブレブが円盤径2〜3程度のところで、縦型23ゲージのVRハサミで網膜切開を1.5ミリに拡大し、1.4ミリの切開ナイフで10時方向の強膜切開を20ゲージアプローチまで精密に伸ばします。次に、20ゲージのシューターダミーを強膜切開に通し、必要に応じて切開を拡大して、装填されたシューターのスムーズでありながらぴったりとした移行を確保します。

次に、装填された射手を水銀の20〜24ミリメートルの強膜切開部に通し、網膜切開の端までインプラントを横膜下に挿入します。射手は最初の試行で強膜をすばやく通過する必要があるため、最適なサイズの強膜切開術を確保してください。次に、RPE細胞を浅い角度で網膜下に移植して、ブルッフ膜にインプラント前縁が閉じ込められるのを防ぐ必要があります。

インプラントが網膜切開術から適度に離して網膜の下に配置されるようにインプラントを調整します。次に、強膜切開術からポートを取り外し、シャンデリアポートから25マイクロリットルのトリアムシノロンを注入します。7-0縫合糸を使用して、2時と10時の強膜を閉じ、漏れがないか確認します。

輸液カニューレを取り外し、事前に配置された7-0 Vicryl縫合糸で最後の強膜切開術をすぐに閉じます。30ゲージの針を使用して、触診しながら、必要に応じてBSSを注入して眼圧を調整します。最後に、結膜を7-0 Vicrylで縫合し、深部眼窩静脈叢を避けながら、プロポシングシルクを取り除きます。

網膜下の生着は、コア硝子体切除術が行われると約60%の手術成功率があり、後部硝子体剥離が誘発されると75%以上に増加します。ここでは、簡単な手順の後、ポリエステル膜上に異種移植された培養網膜色素上皮の走査型レーザー検眼鏡赤外線反射画像が示され、免疫反応に起因する視細胞萎縮がインプラントの周りのハローとして現れます。この対応するスペクトル領域の光コヒーレンストモグラフィー画像では、RPEの異種移植に対する応答として、主にインプラントの上に目に見える過反射バンドを持つ網膜で、外側の核層の薄化が観察できます。

しかし、インプラントに隣接する神経網膜は、ほぼ正常な反射帯を示しており、インプラントの非外傷性送達を示唆しています。H/E染色で観察されるように、異種移植された非免疫抑制ウサギでは、網膜下瘢痕化と外核層萎縮が見られます。インプラントの下のブルッフ膜も隣接しているように見え、絨毛細血管には散在する赤血球が含まれており、インプラントの送達中に発生した外傷の欠如をさらに確認しています。

一度習得すると、このテクニックは合併症に遭遇しなければ1時間で完了することができます。この手順を試みる際には、インプラントにフィットするのに十分な大きさの網膜ブレブと網膜切開術を作成することを忘れないでください。また、外科的介入が迅速であればあるほど、通常はより良い結果が得られます。

この手順に続いて、移植の成功、網膜下の生体適合性、移植された細胞の生存などの追加の質問に答えるために、光干渉断層撮影法や組織学などの他の方法が使用される場合があります。その開発後、この技術は、幹細胞生物学および生体材料の分野の研究者が、網膜疾患、特にRPEのための幹細胞誘導体および/または生体機能担体基質の網膜下送達を探求する道を開きました。このビデオを見れば、ウサギの硝子体切除術と網膜下移植手術の方法についてよく理解できるはずです。

レンズ、網膜硝子体、および網膜下界面での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切な手の位置、良好な視覚化、安定した眼圧などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。