TAPE：手術アプリケーションのための植物でユビキタス化合物に触発された生分解性止血グルー

本プロトコルの全体的な目的は、植物に広く存在する化合物に着想を得た、外科的に適用可能な生分解性止血剤を開発することです。この手法は、生物医学的応用における組織接着剤やシーラントなどのバイオメトリクスの耐水性接着メカニズムの理解に寄与します。この技術の主な利点は、TAPEの作製工程が極めて単純で、スケールアップが可能であり、かつ環境に優しいことです。

まず、マグネティックスターラーを用いて、4 mLのガラスバイアル内でタンニン酸溶液を調製します。蒸留水1 mLとタンニン酸1 gを加え、200 rpmで撹拌します。1時間後、タンニン酸が完全に溶解し、褐色の溶液になります。

次に、1 gのPEG粉末に1 mLの蒸留水を加え、ボルテックスミキサーで攪拌して白いスラリー状にします。このスラリーを60 °Cで10分間保持します。これにより、溶液は完全に透明になります。

その後、室温に戻します。次に、マイクロ遠心チューブ内で、PEG溶液 329 µL とタンニン酸溶液 671 µL を混合します。両溶液とも非常に粘性が高いため、分注はゆっくりと行ってください。

狭いスパチュラを用いて、溶液をゆっくりと混ぜ合わせ、ハチミツ状の混合物にします。固定角ローターを用いて、この混合物を12,300 gで3分間遠心分離します。その後、完全に形成されたTAPEを残し、上清を可能な限り注意深くピペットで除去します。

TAPEを4〜8°Cで数週間保存します。TAPEの接着強度を測定するために、ブタの皮膚生検パンチから試験組織を調製します。すべての脂肪を除去し、直径6 mmの試験組織を2つ調製します。

市販のシアノアクリレート系接着剤を各組織の外側に塗布し、試験機で把持するためのロッドまたは同様の物体を取り付けます。次に、TAPEを組織の片側に1滴滴下し、2つの組織の内側で均一に広げて接着させます。その後、組織を数回付け外しし、界面全体を完全に覆う均質な混合状態にします。

次に、試験装置にロッドを取り付けます。まず、20 Newtonsの力を1分間加えます。次に、組織が完全に剥離するまで、1 mm/minの速度でロッドを間引きます。

データは力-距離曲線として示されます。水が存在する場合の接着強度を試験するため、2つの組織間の剥離領域に20 µLの水を追加し、直ちにTAPEで濡れた表面を接着させます。その他の条件は変更せず、前述と同様に試験を繰り返します。

まず、マイクロ遠心チューブから直径8 mmのキャップを切り出し、重量を測定します。次に、キャップに150 mgのTAPEを入れ、全重量を測定します。このとき、障壁として機能させるため、キャップの縁を超えて充填しないでください。

75 cm²の細胞培養フラスコに50 mLのPBSバッファーを加えます。ロードキャップをフラスコに入れ、キャップを浸します。50 rpm以下に設定したオービタルシェーカーを用い、37 °Cでフラスコをインキュベートします。

所定の時間に、キャップを取り外して窒素ガスで乾燥させます。次に、キャップの重量を測定します。その後、フラスコ内のPBSを交換し、次のタイムポイントまで緩やかに振盪しながらインキュベーションを継続します。

測定値から、相対的な残存重量を算出します。足指をつまむテストで確認し、完全に麻酔をかけた6週齢の雄マウスを用いて開始してください。手術を開始する前に、必ず眼に動物用軟膏を塗布してください。

次に、腹部正中切開により肝臓を露出させ、肝臓の下に既知の質量のろ紙を敷いて固定します。続いて、18ゲージの針で肝臓を刺し、出血を誘発させます。滅菌ガーゼで血液を吸収しながら、切開部位に直ちに100 µLのTAPEを塗布します。

ポジティブコントロールにはシアノアクリレートまたは同様の接着剤を使用し、ネガティブコントロールには何も行わない。これ以上の縫合は不要である。接着剤を塗布した後、損傷部位から出血した血液をろ紙に回収する。

30秒ごとにフィルターペーパーを交換し、これを2分間繰り返します。4枚のフィルターペーパーに吸収された血液の質量を測定します。その後、動物を安楽死させてください。

TAとPEGの複数の比率を検討した結果、TAPE作製に最適な組み合わせは体積比2:1であった。このようなTAPEを直径6 mmの2枚の豚皮膚の間に塗布し、上述の通り引張試験機で試験した。2枚の豚皮膚を剥離させるのに必要な力は、初期状態で200 kPaであり、サイクルの反復に伴い250 kPaまで増加した。

各接着・剥離サイクルの後に皮膚サンプルを湿らせたところ、結合の引張強度は当初90 kilopascalsまで低下し、20サイクル後には50 kilopascalsまで減少しました。TAPEの耐久性は、生理的な光条件下で振盪させながら、PBSで希釈した小容量において試験されました。2対1の比率の処方を用いることで、21日間質量が維持されました。

これらの条件下では、TAPEの1:1比率の配合は13日間しか持続しませんでした。次に、in vivoでの止血試験を実施しました。TAPEで密封した肝臓を、市販のフィブリン糊と比較しました。

TAPEで封止した肝臓は、フィブリン糊で封止した肝臓よりも大幅に出血が少なかった。習熟すれば、適切に実施することでTAPEの調製は5分で完了できる。この処法を行う際は、タンニン酸とPEGの最適比率を維持することが重要である。なぜなら、この比率がTAPEの接着力に劇的な影響を及ぼすためである。

この技術の開発後、バイオメトリクスの分野の研究者は、耐水性接着材料の開発における現在の課題を解決するための自然界にヒントを得た手法を模索できるようになりました。この手法は止血材料に関する知見を提供しますが、創傷治癒のための組織封止材や薬物送達のための植え込み型パッチなど、他のシステムにも応用可能です。