Name: TAPE：手術アプリケーションのための植物でユビキタス化合物に触発された生分解性止血グルー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぼう、タンニン酸とポリエチレングリコールから作る生分解性止血接着剤TAPEの調製法。手術用接着材としてフィブリン糊より2.5倍の耐水性接着力を持ち、簡便で環境に優しい製造プロセスを解説する。

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この研究は、韓国国立研究財団の中堅科学者助成金（2014002855）および産業貿易天然資源省（世界一流材料開発プログラム）の支援を受けました。この研究は、KAIST Institute for NanoCentury(KINC)のCenter for Nature-inspired Technology(CNiT)によっても部分的にサポートされています。

すべての動物の世話及び実験は、KAIST（韓国科学技術院）IRB（治験審査委員会）が提供する倫理的なプロトコルに従って行われています。 1. TAPE形成<ol><li> TA溶液を調製するために、マグネチックスターラーでは4 ML-サイズのガラスバイアルに配置し、かつ攪拌棒を蒸留水1mlを加えます。バイアルにタンニン酸の1グラムを追加し、1時間以上、200rpmで穏やかに攪拌することにより水に溶解します。 TAが完全に溶解されると、混合物は茶色と透明になります。 </li><li>白色のスラリーを作るために数秒間ボルテックスすることにより混合して、続いて蒸留水1 mlにPEG粉末1g（4-アーム、10 kDaの、直鎖状、4.6キロダルトン）を添加してPEG溶液を調製します。 10分間60℃のインキュベーター中で、このスラリーを保管してください。白1は完全に透明になるまで。 注：10 kDaの分子量を有するPEGの融点は約55であります- 58℃ - 60°C、4 kDaのものが53です。 1gに、水まででPEGの高濃度/ mlの透明な溶液として実現することができるように、溶融したPEGは、水混和性となります。透明なPEG溶液を高温で形成されると、溶液はまだ冷却した後、室温で安定です。 </li><li> 4.6キロダルトンとの直鎖状PEGの場合にはステップ1.1（で製造したTA溶液を671μlにステップ1.2で調製したPEGの329μlの（4-腕、10kDaの）溶液を添加し、PEG溶液の311μlを添加します微量遠心管中TA溶液）の689μL。静かに均一に混合するために狭いスパチュラで2粘性や蜂蜜のようなソリューションをブレンド。 注意：どちらのソリューションは非常に粘性であるため、科学者はゆっくりと、しかし十分にプルアップし、マイクロピペットで解決策を転送する必要があります。 </li><li>固定角ローターを装備した遠心機で3分間12,300×gでステップ1.3で調製した混合物をスピン。 </li><li>慎重レムマイクロピペットを用いて可能な限り上清をできるだけ多くOVE、落ち着いた生成物を回収：これは完全に形成されたテープです。テープを形成した後、冷蔵庫に保管-数週間までの注記 （4~8゜C）：テープはガンマ放射線または外科的用途に使用する前に電子線処理によって滅菌することができます。 </li></ol> TAPEの接着強度の2測定<ol><li>皮膚組織上のすべての脂肪を除去した後の生検パンチで切断することにより、直径6mmのブタの皮膚組織の2枚を準備します。 注：ブタの皮膚組織は、健康なブタの脇腹皮膚から得られたものであり、韓国の大田にあるローカル食肉市場から購入しました。 </li><li>各組織の外側に商用シアノアクリレート接着剤を塗布し、金属製の棒に組織を取り付けます。 注：金属製ロッドが補助的なハンドルはとても組織として使用されています再直接機械により把持されません。従って、引張機の構成以下の他の材料で置き換えることができます。 </li><li>組織の一方の側に - （6ミリグラムTAPEの降下は約3である）TAPEのドロップを適用します。次に、 図2（a）に示すように 、それらが結合しているように、均一に、その内側に2つの組織間の他の組織を使用してテープを広げます。 </li><li>その後、手動で均一に混合し、各組織とTAPEとの間のインタフェースを最大化するには、いくつかの回を添付して、組織の両側を取り外します。 </li><li>慎重にグリップロッドの各側UTM、と。接着強度は、テープが取り付けられた2つの組織を分離するために必要な力により決定されるであろう。まず、1分間20 Nの力を加えます。次に、マシンで、1ミリメートル/分の速度で逆方向に各ロッドを引っ張ります。組織が完全に分離されるまで。 注：データは運動によって検出された力-距離（FD）曲線として与えられます各ロッドの。 </li><li>つまり、試料表面の面積によってステップ2.5で達成FD曲線で示される最大の力（kNの）を分割することにより、テープの接着強度を計算し、3.14のx（0.003メートル）2。 </li><li>水の存在下で接着強度を監視するために、2つの組織間で一戸建て面積に20μlの水を追加し、それらをすぐに取り付けます。マシンで、再び剥離試験を行います。 </li></ol> インビトロ分解試験3. <ol><li>マイクロ遠心管のキャップ（D = 8 mm）をカットし、W cとしてそれを定義するためにキャップを量ります。 </li><li> TAPE 150mgのでキャップを記入し、0 W総初期重 ​​量としてそれを設定するために、再度すべて一緒に重量を量ります。 注意：キャップにTAPEに過負荷をかけないでください。また、ステップ3.4でのインキュベーションの間に攪拌処理により生成されたPBS緩衝液の流れに対する物理的障壁とすることができるようにテープの高さは、キャップの上面よりも低くあるべきです。 </li><li&gt;細胞培養フラスコ（75cm 2の）にテープを含むキャップを入れ、キャップ内のテープが完全にPBS緩衝液に浸漬されるように、細胞培養フラスコにPBS緩衝液50mlを（1×、pH7.4）に加える、など図3Aに示された（n = 5）。 </li><li>穏やかに攪拌（50回転）との生理学的条件に類似し、37℃、オービタル振盪インキュベーター中でステップ3.3で調製された細胞培養フラスコをインキュベートします。 注意：50 rpmで攪拌状態にしてください。高回転はTAPEの崩壊を引き起こす可能性があります。 </li><li>各時点で、細胞を培養フラスコからテープで蓋を取り、その後、窒素ガスを吹き付けることにより、それらを乾燥させます。残りのテープを含むキャップを計量。 W tまでの各時点で体重を設定します。再び新鮮なPBSを交換し、各時点でW tを測定した後、再びそれを横に振ります。 </li><li>相対残りの重量（％）は次式を計算します。 相対残存量（％）=（W T </suB&gt; - W C）/（W 0 - W C）X 100％ </li></ol> TAPEの4止血能力 注：全ての動物実験は、健康と福祉の韓国省によって提供されたガイドラインや倫理的なプロトコルに従って行われるべきです。 <ol><li>参考文献24に記載されているようにin vivoでの止血能力を評価するために、出血のマウス肝臓モデルを確認します。 </li><li> （群当たりn = 5）チレタミン-ゾラゼパム（33.333ミリグラム/ kg）およびキシラジン（7.773ミリグラム/キログラム）の腹腔内注射で - 15マウス（オス35グラム、通常のICRマウス、6週間、30）を麻酔。適切な麻酔を確認するために、動物の足をやさしくつまんでませ動きは動物が手術を行うのに十分に麻酔をかけていることを示していないなど 、足を引き出すなどの動きを観察します。 </li><li> 、動物の眼の乾燥を防ぐの下で十分にしばらく目に獣医軟膏を適用するには知覚。腹部正中切開を介して肝臓を露出させ、出血を誘発する18 G針で肝臓を刺します。 </li><li>滅菌ガーゼで流れる血液を取り出し、出血部位に直ちにTAPEまたはフィブリン糊（ポジティブコントロール）の100μLを入れます。 注：これ以上の縫合が原因で創傷組織にその高度血性接着特性にテープを適用した後に必要とされません。陰性対照のために、何の治療は、出血部位で発生しません。 </li><li>それぞれの場合において、損傷部位からの血液を収集するために、肝臓の下に既知の質量を有する濾紙を置きます。新鮮なもの4回ごとに30秒（ すなわち 、2分）で紙を交換してください。 </li><li> 30秒毎に収集された各ろ紙に吸収され、血液の質量を測定します。動物実験の後、CO 2窒息の安楽死を介してマウスを生け贄に捧げます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々は、植物由来のポリフェノール化合物、TAの耐水性の分子間相互作用に触発された止血接着剤というテープの全く新しいクラスを開発しました。 TAが大きく、その抗酸化、抗細菌、抗変異原性、および抗発がん性に注目されている代表的な加水分解性タンニンです。 それは、任意のさらなる化学合成手順なしで遠心分離に続いて2つの水溶液のちょうど1ステップの混合であるようにテープを作るプロセスは、非常に、シンプルスケーラブル、かつ環境に優しいです。 2成分混合プロトコルは、フィブリン糊のような従来の製品に使用される組織接着剤を形成するための最も一般的かつ最も簡単な方法です。これは右の組織3を適用する前に、フィブリノーゲンおよびトロンビンを混合することによって形成されます。しかしながら、多段階の化学合成は、ケースO中の接着剤の成分を製造するために必要とされますFのシアノアクリレート接着剤や合成ポリマー系接着剤。一方の成分が化学的にグルタルアルデヒドとホルマリンとレゾルシノールを含む接着剤によって硬化タンパク質ベースの材料にポ...

過去10年間で、努力が外科的治療の際に、それらの使用における利便性と低い組織侵襲に生体吸収性/生分解性接着剤で傷口を閉じるために、現在の手術用縫合糸およびステープルを置き換えるために行われてきました。商業的に入手可能な組織接着剤は、4つのタイプに分類される：（1）シアノアクリレート誘導体1,2,3をトロンビンによるフィブリノゲンからフィブリンポリマーへの酵素的変換によって形成された（2）フィブリン糊、例えば、化学的または物理的のような（3）タンパク質ベースの材料架橋されたアルブミンまたはゼラチン4,5、および（4）合成ポリマー系のもの6。それらは多くの臨床用途で使用されているが、全ての接着剤は、それらの広範囲に及ぶ使用の障害とすることができる独自の固有の不利益と欠点を有します。シアノアクリレート系接着剤は、組織への高い密着強度を示すが、その副産物ような分解の間に形成されたシアノアセテートとホルムアルデヒドなどの有害、多くの場合、記号を引き起こします炎症反応のificant度7。ゼラチン系接着剤8用牛、鶏、豚、魚含むフィブリン糊や動物のためのヒト血漿：フィブリン糊およびアルブミンまたはゼラチン系材料は、動物源からウイルスなどの感染コンポーネントの伝送に関する安全性の問題を、持っています。いくつかの合成ポリマーベースの接着剤は、連邦医薬品局（FDA）によって承認されているが、合成ポリマー製のほとんどの接着剤は、製造工程を最小化し、生体適合性9を達成するのに困難を持ち続けます。最も重要なことは、すべての接着剤は、ウェットティッシュ10に不十分な機械的および接着強度に苦しみます。近年、海洋ムール貝11-13に触発されたバイオミメティック組織接着剤、ヤモリ14は 、イガイ15、および内部寄生ワーム16とヤモリは、その調整可能な機械的に現在の医学接着剤に有望な代替案を新興されており、生体適合性と接着性。しかし、この日に、彼らは商用製品17になる前に対処すべき問題が残っています。 ここでは、植物由来の接着分子、タンニン酸（TA）、および生体不活性ポリマーポリ（エチレングリコール）（PEG）との間の分子間水素結合により調製されたテープと呼ばれる医療用接着剤の全く新しいタイプを報告しますその名前が示すとおり。 TAは、遍在的に植物の二次代謝中に発見された代表的な加水分解性タンニンです。これは、抗変異原性、および抗発がん性、その抗酸化剤に注目しており、そのようなポリ（Nの -isopropylacrylamide）（PNIPAM）およびポリ（Nなどの多くのポリマーと超分子相互作用に関与することが示されています-ビニルピロリドン）（PVPON）、21-23層ごと（のLbL）フィルム18-20および薬物放出マイクロカプセルを形成します。本研究では、TAは、効率的として作用することができることを発見します耐水接着官能性部分は、テープの医療用接着剤を形成します。 TAとの単純な混合により、非汚染ポリマーPEGは、市販のフィブリン接着剤と比較して2.5倍増加した接着強度を有する超分子接着剤となり、この接着性はあっても、水の存在下で、着脱の最大20サイクルを通して維持されました。その止血能力は、in vivoでの肝出血モデルでテストされ、数秒以内に出血を止めるための良好な止血能力を示しました。 TAPEは、バイオ風のアプローチと現在の問題の欠点を解決するに新たな洞察を明らかにすることができる最初の植物由来の接着剤などの関連分野での重要な意味を持ちます。我々はまた、その単純な製造方法、スケーラビリティ、調整可能な生分解速度に、このような粘膜接着剤、薬物放出パッチ、創傷ケアドレッシング、および他のような医学・薬学の様々なアプリケーションでTAPEの普及を期待するだけでなく、非常に湿った耐性adhesイオンプロパティ。

<table><tbody><tr><td>タンニン酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレンオキシド)、4アーム、ヒドロキシ終端</td><td>アルドリッチ</td><td>565709</td><td>平均 Mn ~ 10,000</td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)</td><td>アルドリッチ</td><td>373001</td><td>平均 Mn 4,600</td></tr><tr><td>生検パンチ</td><td>ミルテック</td>ス <td>33-36</td><td>直径=6mm</td></tr><tr><td>アロンアルファ</td><td>東亞合成(株)</td><td></td><td>インスタント接着剤</td></tr><tr><td>万能試験機 (UTM)</td><td>インストロン</td><td>5583</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>60015</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>10090</td><td>90 x 15 mm</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>1x PBS 成分</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>1xPBS成分</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Duchefa biochemie</td><td>S0520.5000</td><td>1x PBS成分</td></tr><tr><td>インキュベーティングシェーカー</td><td>ラボコンパニオン</td><td>SIF6000R</td><td></td></tr><tr><td>ICRマウス</td><td>オリエントバイオ</td><td>正常ICRマウス</td><td>6週間、30 - 35 g、雄</td></tr><tr><td>チレタミン-ゾラゼパム (ゾレチル 50)</td><td>ビルバック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ザイラジン (ロンプン)</td><td>バイエル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlideTM針(18 G)</td><td>BD</td><td>302032</td><td>18 G</td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Whatman</td><td>1001 125</td><td>直径= 125 mm</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>Bemis フレキシブル パッケージ</td><td>PM996</td><td></td></tr></tbody></table>

tape：手術アプリケーションのための植物でユビキタス化合物に触発された生分解性止血グルー

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

このビデオでは、商業組織接着剤よりも効果的な止血能力と大きな耐水性の接着強度を有する生分解性外科手術用接着剤を製造するための最も簡単なプロトコルを記述しています。医療接着剤は、縫合糸および低侵襲での使用での利便性のためにステープルへの潜在的な代替ツールとして大きな注目を集めています。バイオドリブン材料の場合において、このようなフィブリン糊およびシアノアクリレートベースの材料として市販されているものは、主にそれらは有機分子、または複雑なタンパク質精製法の化学合成のシリーズを必要とするなどの組織接着剤を開発するためのいくつかのプロトコルが存在するが（ すなわち 、フィブリン糊）。また、生分解性を維持しつつ、高い接着性を示す手術用接着剤の開発は、まだ体の湿潤環境で良好なパフォーマンスを達成することの難しさに起因する課題です。私たちは、準備するための新しい方法を示しています植物由来、ウエット性接着分子の物理的混合した後に形成された水非混和性超分子集合体の重量ベースの分離によって、TAPEとして知られている医療用接着剤は、Tは、CID（TA）、および周知をannicバイオポリマー、ポリ（エチレン）グリコール（PEG）。我々のアプローチでは、TAPEは、水の存在下で商業フィブリン糊よりも2.5倍である高い接着強度を示しています。さらに、テープは、生理学的条件下で生分解性であり、組織の出血に対する強力な止血接着剤として使用することができます。私たちは、このような粘膜接着用ポリマーなどの医療設定および薬物送達用途、薬物デポー剤、及びその他の様々なTAPEの普及を期待しています。

1体積比（ 図1A）：テープ2とTA（1グラム/ mlの蒸留水中）およびPEG（蒸留水中1グラム/ ml）を含む2つの水溶液の混合物を遠心分離した後、落ち着いた超分子集合体です。混合比は、高い接着強度を達成する上で重要な要因です。テープ2によって形成されている場合：1混合比、TAの25単位のヒドロキシル基（-OH）の20単位は、最大で最も高い分子間水素結合の形成をもたらす、PEGのそれぞれのエーテル基（-O-）と相互作用します接着特性。 -OHの残りの5つの単位は、TA（ 図1B）内の隣接するカルボニル基（C = O）と分子内水素結合によって消費されているように見えます。構成要素のいずれかが2を超えたとき：1体積比、密着強度が著しく25を減少しました。水素結合はまた、組織に重要な分子レベルの相互作用になります。制御間および凝集のためのTAとPEGとの間の分子内水素結合、およびTAとの密着性のための組織の間では、効果的な手術用接着剤としてTAPEのもっともらしいメカニズムであるかもし...

我々は、効果的な止血能を有する生分解性医療接着剤を製造するための最も簡単なプロトコルを記述します。テープは、市販のフィブリン接着剤と比較して2.5倍の耐水密着性を得、タンニン酸、植物に見出される遍在性の化合物、及びポリ（エチレン）グリコールを混合することによって調製した水非混和性超分子集合体です。

TAPE：手術アプリケーションのための植物でユビキタス化合物に触発された生分解性止血グルー

This video describes the simplest protocol for preparing biodegradable surgical glue that has an effective hemostatic ability and greater water-resistant ...

本プロトコルの全体的な目的は、植物に広く存在する化合物に着想を得た、外科的に適用可能な生分解性止血剤を開発することです。この手法は、生物医学的応用における組織接着剤やシーラントなどのバイオメトリクスの耐水性接着メカニズムの理解に寄与します。この技術の主な利点は、TAPEの作製工程が極めて単純で、スケールアップが可能であり、かつ環境に優しいことです。まず、マグネティックスターラーを用いて、4 mLのガラスバイアル内でタンニン酸溶液を調製します。蒸留水1 mLとタンニン酸1 gを加え、200 rpmで撹拌します。1時間後、タンニン酸が完全に溶解し、褐色の溶液になります。次に、1 gのPEG粉末に1 mLの蒸留水を加え、ボルテックスミキサーで攪拌して白いスラリー状にします。このスラリーを60 °Cで10分間保持します。これにより、溶液は完全に透明になります。その後、室温に戻します。次に、マイクロ遠心チューブ内で、PEG溶液 329 µL とタンニン酸溶液 671 µL を混合します。両溶液とも非常に粘性が高いため、分注はゆっくりと行ってください。狭いスパチュラを用いて、溶液をゆっくりと混ぜ合わせ、ハチミツ状の混合物にします。固定角ローターを用いて、この混合物を12,300 gで3分間遠心分離します。その後、完全に形成されたTAPEを残し、上清を可能な限り注意深くピペットで除去します。TAPEを4〜8°Cで数週間保存します。TAPEの接着強度を測定するために、ブタの皮膚生検パンチから試験組織を調製します。すべての脂肪を除去し、直径6 mmの試験組織を2つ調製します。市販のシアノアクリレート系接着剤を各組織の外側に塗布し、試験機で把持するためのロッドまたは同様の物体を取り付けます。次に、TAPEを組織の片側に1滴滴下し、2つの組織の内側で均一に広げて接着させます。その後、組織を数回付け外しし、界面全体を完全に覆う均質な混合状態にします。次に、試験装置にロッドを取り付けます。まず、20 Newtonsの力を1分間加えます。次に、組織が完全に剥離するまで、1 mm/minの速度でロッドを間引きます。データは力-距離曲線として示されます。水が存在する場合の接着強度を試験するため、2つの組織間の剥離領域に20 µLの水を追加し、直ちにTAPEで濡れた表面を接着させます。その他の条件は変更せず、前述と同様に試験を繰り返します。まず、マイクロ遠心チューブから直径8 mmのキャップを切り出し、重量を測定します。次に、キャップに150 mgのTAPEを入れ、全重量を測定します。このとき、障壁として機能させるため、キャップの縁を超えて充填しないでください。75 cm²の細胞培養フラスコに50 mLのPBSバッファーを加えます。ロードキャップをフラスコに入れ、キャップを浸します。50 rpm以下に設定したオービタルシェーカーを用い、37 °Cでフラスコをインキュベートします。所定の時間に、キャップを取り外して窒素ガスで乾燥させます。次に、キャップの重量を測定します。その後、フラスコ内のPBSを交換し、次のタイムポイントまで緩やかに振盪しながらインキュベーションを継続します。測定値から、相対的な残存重量を算出します。足指をつまむテストで確認し、完全に麻酔をかけた6週齢の雄マウスを用いて開始してください。手術を開始する前に、必ず眼に動物用軟膏を塗布してください。次に、腹部正中切開により肝臓を露出させ、肝臓の下に既知の質量のろ紙を敷いて固定します。続いて、18ゲージの針で肝臓を刺し、出血を誘発させます。滅菌ガーゼで血液を吸収しながら、切開部位に直ちに100 µLのTAPEを塗布します。ポジティブコントロールにはシアノアクリレートまたは同様の接着剤を使用し、ネガティブコントロールには何も行わない。これ以上の縫合は不要である。接着剤を塗布した後、損傷部位から出血した血液をろ紙に回収する。30秒ごとにフィルターペーパーを交換し、これを2分間繰り返します。4枚のフィルターペーパーに吸収された血液の質量を測定します。その後、動物を安楽死させてください。TAとPEGの複数の比率を検討した結果、TAPE作製に最適な組み合わせは体積比2:1であった。このようなTAPEを直径6 mmの2枚の豚皮膚の間に塗布し、上述の通り引張試験機で試験した。2枚の豚皮膚を剥離させるのに必要な力は、初期状態で200 kPaであり、サイクルの反復に伴い250 kPaまで増加した。各接着・剥離サイクルの後に皮膚サンプルを湿らせたところ、結合の引張強度は当初90 kilopascalsまで低下し、20サイクル後には50 kilopascalsまで減少しました。TAPEの耐久性は、生理的な光条件下で振盪させながら、PBSで希釈した小容量において試験されました。2対1の比率の処方を用いることで、21日間質量が維持されました。これらの条件下では、TAPEの1:1比率の配合は13日間しか持続しませんでした。次に、in vivoでの止血試験を実施しました。TAPEで密封した肝臓を、市販のフィブリン糊と比較しました。TAPEで封止した肝臓は、フィブリン糊で封止した肝臓よりも大幅に出血が少なかった。習熟すれば、適切に実施することでTAPEの調製は5分で完了できる。この処法を行う際は、タンニン酸とPEGの最適比率を維持することが重要である。なぜなら、この比率がTAPEの接着力に劇的な影響を及ぼすためである。この技術の開発後、バイオメトリクスの分野の研究者は、耐水性接着材料の開発における現在の課題を解決するための自然界にヒントを得た手法を模索できるようになりました。この手法は止血材料に関する知見を提供しますが、創傷治癒のための組織封止材や薬物送達のための植え込み型パッチなど、他のシステムにも応用可能です。

tape-biodegradable-hemostatic-glue-inspired-ubiquitous-compound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぼう、タンニン酸とポリエチレングリコールから作る生分解性止血接着剤TAPEの調製法。手術用接着材としてフィブリン糊より2.5倍の耐水性接着力を持ち、簡便で環境に優しい製造プロセスを解説する。

TAPE：手術アプリケーションのための植物でユビキタス化合物に触発された生分解性止血グルー

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