Name: 細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 学ぶ スワブからの核酸抽出と16S rRNA遺伝子配列決定による細菌群集解析法。フェノール・クロロホルム抽出とPCR増幅を用いて、ヒトサンプルの細菌組成と疾患関連性を明らかにする効率的な手法です。

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我々は、プロトコル上の重要なフィードバックのためにエリザベス・バーン、デイヴィッドGootenberg、クリスティーナGosmannに感謝したいと思います。サンプル調製の指導やデモのためのミーガン・ボルドリッジ、スコット・ハンドリー、シンディモナコ、そしてジェイソン・ノーマン。プロトコルのアドバイスと実りある議論のためのウェンディ・ギャレット、カーティスHuttenhower、スキップヴァージン、そしてブルース・ウォーカー。および配列決定をサポートするためのジェシカHoisington-ロペス。この作品は、ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団とNIAID（1R01AI111918）によってサポートされていました。 DSKは、バローズウェルカム基金から追加支援を受けました。 MNAは、受賞数NIGMSからT32GM007753、とポールとデイジー・ソロスフェローシップによってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIGMSまたはNIHの公式見解を示すものではありません。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、人間の膣スワブ内での相対的な細菌存在量の同定および特徴付けのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、容易にそのような糞便や他の身体部位のスワブのような他のサンプルタイプ、および多種多様な供給源から収集されたサンプルに適合させることができます。フェノールおよびクロロホルムの緩衝溶液中のビーズビーティングによる核酸の抽出は、臨床研究を通じて収集貴重なサンプルを扱うときに特に重要である、DNAとRNAの両方を単離することができます。 RNAの同時コレクションは、RNA-seqのを介して機能性細菌、ホスト、およびウイルスの寄与を決定する機会を提供しながら、単離された細菌DNAは、細菌の分類学的同定およびゲノムアセンブリに最適です。記載したプロトコルを正常ヒト、イヌ、および環境サンプル10を含むサンプルタイプの広範囲に展開された検証一工程プライマーセットを使用して</suP&gt;。バーコードプライマーの何千人もの利用可能性は、シーケンシングコストをサンプルと膨大な貯蓄の多重化を可能にします。 200サンプルが多重化されているとき（全ての試薬、単一の配列決定ラン、及びプライマーではなく、機器を含む）完全なコストは、サンプルあたり約$ 20です。また、同じサンプルサイトからの複数の綿棒がパイプライン全体を通して独立して処理されている非常に高い再現性があります。全体的に、プロトコルは、コスト、効率的で柔軟性、信頼性、および再現性があります。 このプロトコルの核酸抽出部分をフェノール及びクロロホルムで作業する際に必要な安全上の注意事項、および高スループット、96ウェルプレートフォーマットへのパイプラインを自動化するという課題によって制限されます。また、積極的なビーズの鼓動は約6キロベースの断片に機械的溶解ばさみのための細菌のDNAを使用します。より長いDNA断片を、ビーズビーティング秒の期間、下流側アプリケーションに必要である場合houldを短縮します。このプロトコルの細菌同定部分の制限は、16S rRNA遺伝子の塩基配列決定に依存している任意の方法に固有です。 16S rRNAの塩基配列決定属、さらには種レベルに細菌同定のための理想的ですが、まれに歪みレベルの識別を提供しません。 16S rRNA遺伝子のV4可変領域は、ほとんどの細菌種11の間で強固な識別を提供するが、そのようなOligotyping 31のような付加的な計算方法は、正確にこのようなラクトバチルスcrispatusなどの特定の種を同定するために使用される必要があり得ます。このプロトコルは、この目的に向けて使用することができる全ゲノムDNAとRNAの抽出を可能にしても最終的には、特定のサンプル内の正確な細菌の機能的能力についての情報は、単独で、16S rRNA遺伝子の配列決定により決定することができません。 このプロトコルで成功を確保するために最も重要なステップは、汚染のDURを防止するために、細心の注意を取っていまする試料収集、核酸抽出、およびPCR増幅。清潔な手袋を着用してと滅菌綿棒、チューブ、はさみを使って、サンプル収集の時に無菌性を確認してください。コレクション物質の汚染について評価するために、サンプリング時に輸送管に直接追加未使用の綿棒を配置することによって、陰性対照スワブを収集します。ラボでは、唯一の除染物資を含有し、唯一の分子グレード、DNAフリー試薬を用いて滅菌フード内のすべての前の増幅の手順を実行します。核酸抽出時には、各サンプルに新しい滅菌ピンセット、新鮮な手袋を使用し、使用中の場合を除き閉じたすべてのチューブを維持することによって交差汚染を防止します。並行して、未使用の綿棒を処理するサンプル収集及び核酸抽出の両方の無菌性を保証します。未使用の綿棒は、イソプロパノール沈殿及びエタノール洗浄後、ペレットを得てはなりません。ペレットが表示されない場合は、の可能性のあるソースを決定するために、16S rRNA遺伝子の増幅を行います汚染（ 例えば、 連鎖球菌やブドウ球菌の存在は、皮膚の汚染を示すであろう）。また、PCR試薬と反応が汚染されていないことを確認するために並列に鋳型なしコントロール反応でPCR増幅を行います。バンドはテンプレートなしのコントロールに表示されている場合、試薬を廃棄し、新たな試薬と増幅を繰り返します。これらの予防措置をとることは目的の細菌の正常なシーケンシングを保証します。 PCR増幅工程は、ほとんどのトラブルシューティングを必要とする傾向があります。 12サンプルのセットで増幅し、効率性と一貫性の間のバランスを提供します。与えられた増幅セット内のすべてのサンプル全体でのバンドの完全な欠如は、 例えば、試薬を追加し忘れたり、間違ってサーモサイクラーのプログラミングを、系統的な障害を示します。いくつかのサンプルからのバンドの不在は通常、ヒューマンエラーによるものであり、増幅は再-Rでなければなりませんサンプルおよびリバースプライマーの同じペアとアン。バンドの連続不在の場合には、試料は、異なるバーコードを有するリバースプライマーを使用して再増幅することができます。複数のリバースプライマーを用いて繰り返し増幅の失敗は、試料中に存在する阻害剤を示すことができます。その場合には、カラムでDNAを洗浄することは、しばしば大幅に相対的な細菌の存在量を変更することなく、阻害剤を除去します。複数のバンドが増幅後に生じた場合は、異なるリバースプライマーのバーコードでサンプルを再増幅します。 ライブラリー・プールを作成する際に、環境汚染を防止し、単一の特定の製品の増幅を確保することに加えて、成功したシークエンシングは、介護に依存しています。目標は、約シーケンシング同じ数のサンプルあたりの読み込みを保証するために、各サンプルのアンプリコンの等モル量を組み合わせることです。増幅前に核酸濃度が同等である場合は、単純に各SAの等容量を追加しますmpleのアンプリコンライブラリー・プールを作成するときには十分です。核酸の濃度が非常に異なると等量で添加されている場合には、低い核酸濃度を有するサンプルは不十分読み取りの低い数で表されます。この場合には、ゲルのバンドの相対強度に基づいて、低濃度サンプルからアンプリコンのより高い量を添加することが可能です。あるいは、より厳密に各試料の等モル量を、個々のアンプリコンのプライマーを除去蛍光のdsDNA定量キットを使用して、個々のサンプルのアンプリコンの濃度を定量し、正確に組み合わせることも可能です。 バランスのとれたアンプリコンのプールが生成されると、それは慎重にプールの濃度を測定することが重要となります。その後の慎重な希釈およびスパイクでPHIXで読み取り複雑さを増加させるためには、最適な配列決定の結果を達成するために重要です。 sequenを使用するハイスループットシーケンサー合成によってcingフローセル上のクラスタ密度に非常に敏感です。あまりにも低い品質スコア、下位データ出力、および不正確な分波32と、overclusteringになります集中しているライブラリープールをロードします。あまりにも希薄されたライブラリーのプールをロードすると、低データ出力になります。慎重に配列決定前にライブラリープールを定量化することは、最適な結果を保証します。 16S rRNA遺伝子配列決定は、所与の試料内に存在する細菌の包括的な評価を提供し、仮説生成における絶対的に重要な最初のステップです。さらに、メタデータの豊富なセットの存在は、特定の細菌種及び重要な生物学的要因との関連性をテストするための研究を可能にします。また、同一の16S情報は、PICRUSt 33のようなツールを使用して細菌の機能を推定するために使用することができます。最終的な目標とすることができる新規の関連付けを識別するために16S特徴付けを使用することですさらに、ヒトの健康および疾患に対する細菌microbiomeの影響の成長を続ける当社の理解に追加、モデル系でテストおよび検証。

人間の下生殖器官、消化器系、呼吸器、皮膚を組織の恒常性を維持し、ホスト1の健康をサポートするために重要である複雑な細菌群集によって植民地化されています。例えば、特定の乳酸菌は、膣円蓋を酸性抗菌エフェクターを生成し、ローカルホスト免疫2-4を調節することにより、病原体のための無愛想環境を作成します。細菌microbiomeの重要性の高まり感謝も多くの臨床の状況で細菌群集を特徴づけるの関心を増大させました。ここでは、生殖器スワブからの細菌microbiomeの組成を決定する方法を説明します。プロトコルは、容易に他の解剖学的位置および他の宿主種から収集便試料及びスワブ用に修正することができます。 与えられたスタッドから収集し、保存することができるサンプル数に固有の制限のためにYの参加者は、このプロトコルは、適合フェノール-クロロホルムベースのビーズビーティング法5,6を使用して単一の綿棒から潜在的にDNA、RNA、さらにタンパク質を抽出するために設計されました。洗剤とビーズビーティングおよび化学的破壊を有する細菌の細胞壁の物理的破壊の組み合わせは、追加の酵素消化段階なしに、グラム陽性、グラム陰性、および抗酸菌の迅速な溶解を可能にします。高品質のRNAを得るためには、すぐに回収後、実験（該当する場合）への輸送中に、またはC°4以下に保たれた乾燥綿棒を使用することをお勧めし、-80℃で長期間保存されます。 与えられた試料内の細菌microbiomeを決定するには、この手順は、現在、総合的に細菌の分類を割り当て、相対定量を行うための最も費用対効果の高い手段である16S rRNA遺伝子アンプリコンのシーケンシングを利用します。代替方法では、標的のqPCR 7、カスタムmicroarrを含みますAYS 8、及び全ゲノム配列9。 16S rRNA遺伝子は、9超可変領域を含み、膣microbiome研究のためのシーケンスに最適なV領域に関するコンセンサスはありません。ここでは、515F / 806Rプライマーセットを使用し、Caporaso らによって設計されたパイプラインの上に構築。10-12。 Caporaso らの515F / 806Rプライマーセットが原因検証バーコードプライマーとイルミナシーケンシングプラットフォームとの互換性の何千もの可用性に単一の配列決定ランでのサンプルの何百もの多重化を可能にします。人間Microbiomeプロジェクトの27F / 338Rプライマーセット13とは異なり、515F / 806Rも有効Bifidobacteriaceaeを増幅し 、したがって、正確ガードネレラ膣 、一部の女性では膣の微生物群集の重要なメンバーは、キャプチャします。あるいは、338F / 806Rプライマー対は、正常膣サンプル14及び515F / 926Rプライマー対はRECEを有するのパイロシーケンシングのために使用されていますntly次世代シーケンス12のために利用できるようになります。 最後に、このプロトコルは、微生物生態学（QIIME）ソフトウェアパッケージ15に定量的洞察を使用して、16Sアンプリコンの分析を実行するための基本的な手順を説明します。ここで説明するQIIMEコマンドの実装を成功させるには、各サンプルの細菌分類学上の存在量を含むテーブルを生成します。 QIIMEウェブサイト（http://qiime.org/index.html）に詳細に記載されるように多くの付加的な品質管理工程、分類学的分類方法、及び分析ステップは、分析に組み込むことができます。分析は、Appleコンピュータ上で実行する場合は、MacQIIMEパッケージ16は QIIMEとその依存関係の簡単なインストールを提供します。 16S rRNAの遺伝子配列解析のための代替ソフトウェアパッケージはMothur 17とUPARSE 18が含まれます。

<table><tbody><tr><td><ストロング>機器:</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ミニビーズビーター-16</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>PCRワークステーション</td><td></td><td></td><td>AirClean 600など、任意のPCRフードを使用することができます。</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td></td><td></td><td>MJ Research PTC-200など、加熱された蓋付きのサーマルサイクラーであれば、どれでも使用できます。</td></tr><tr><td>電気泳動システム</td><td></td><td></td><td>Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis Systemなど、あらゆる電気泳動システムを使用することができます。</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000C</td><td>他のDNA定量法で十分です</td></tr><tr><td>バイオアナライザー</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Agilent 2200 TapeStation Instrumentの代替品があります。絶対に必要というわけではありませんが、とても助かります。</td></tr><tr><td>MiSeqまたはHiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>材料:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catch-Allサンプルコレクションスワブ</td><td>エピビオ</td><td>QEC89100</td><td>他の綿棒も使用できますが、Human Microbiome Projectではキャッチオール綿棒を推奨しています。&nbsp;</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher</td><td>04-355-31</td><td></td></tr><tr><td>SteriFlip 50 ml ろ過装置 (0.22 &micro;m)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>0.1 mm ガラスビーズ</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td></td></tr><tr><td>2 ml スクリューキャップチューブ</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 5M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740-011</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9856</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>0.5 MEDTA</td><td>Ambion (Invitrogen)</td><td>AM9260G</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム、20% 溶液</td><td>フィッシャー</td><td>BP1311-200</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-free 蒸留水</td><td>Ambion</td><td>10977-015</td><td>分子生物学グレード、バッファー調製用</td></tr><tr><td>2-Propanol BioReagent、分子生物学用、&ge;99.5%</td><td>シグマ</td><td>I9516-500ML</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:IAA、25:24:1</td><td>Invitrogen</td><td>AM9730</td><td>警告:有毒</td></tr><tr><td>な3 M酢酸ナトリウム、pH 5.5</td><td>Life Technologies</td><td>AM9740</td>分子<td>生物学グレード</td></tr><tr><td>使い捨て滅菌ポリスチレン鉗子、PS</td><td>コールパー</td><td>マーEW-06443-20</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml、透明、PCRクリーンチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td>22364120</tr><tr><td>PCRグレードの水</td><td>MoBio</td><td>17000-11</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Sigma</td><td>D7295-0.5mL</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml PCR 8 チューブ クリアフラットキャップ付き、ナチュラル</td><td>USA Scientific</td><td>1492-3900</td><td>DNase、RNase、DNA、PCR inhibitor フリー ウィルである任意の 8 チューブ ストリップ作業</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioExpress</td><td>E-3121-25</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE buffer</td><td>Lonza</td><td>51216</td><td></td></tr><tr><td>DNA gel stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>6x DNA Loading Dye</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>50 bp GeneRuler Ladder</td><td>Thermo (Fisher)</td><td>SM0373</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA kit</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>UltraClean PCR Clean-up Kit</td><td>MoBio</td><td>12500-100</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P11496</td><td>代替案は Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Primers:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>515F(フォワードプライマー)5'-AATGATACTACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'100nmole</td><td></td><td></td><td>で注文します。精製:標準的な脱塩。**Critical:プライマーは、汚染を避けるためにフード内のMoBio PCRグレード水(上記参照)で再懸濁する必要があります。**</td></tr><tr><td>Reverseプライマーは、Supplemental Code Fileおよび以下を参照してください:ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt</td><td>IDTを推奨します</td><td></td><td>プライマーを大量にご注文の場合は、100 nmoleスケールの96ウェルプレートとしてご注文ください。100 &mu;Mで再懸濁します。プライマーの注文と再 http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and での再懸濁の完全な指示_resuspension.doc.&nbsp;**Critical: プライマーは、汚染を避けるためにフード内でMoBio PCRグレード水(上記参照)で再懸濁する必要があります。**</td></tr><tr><td>Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3'25</td><td></td><td></td> <td>nmole;精製:標準的な脱塩。100μmで再懸濁します。</td></tr><tr><td>2 シーケンシングプライマー 5'-AGT、CAG、TCA、GCC、GGA、CTA、CHV、GGG、TWT、CTA、AT-3'26</td><td></td><td></td>、<td>nmole;精製:標準的な脱塩。100μmで再懸濁します。</td></tr><tr><td>インデックスシーケンシングプライマー 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3'27</td><td></td><td></td> <td>nmole;精製:標準的な脱塩。100μmで再懸濁します。</td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td>シーケンシングを社内で行う場合に必要です。シーケンシングがサードパーティのシーケンシングセンターによって行われる場合、そのセンターはすでにPhiXを保有していることになります。</td></tr></tbody></table>

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16s rrnaの遺伝子配列決定

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

人間の健康と病気の重要な調節因子として微生物群集の役割のための成長の感謝があります。ハイスループットシークエンシング技術は、さまざまなソースからの16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を使用して細菌群集の迅速かつ効率的な特徴付けのために許可されています。 16S rRNA配列の分析のために容易に利用可能なツールは、計算ワークフローを標準化しているが、DNA抽出のための試料処理は、研究間の変動の継続元のままです。ここでは、綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。我々はまた、シーケンシングライブラリーの生成、データ品質管理、および配列分析を含む16S rRNA遺伝子配列決定のための下流の方法を描きます。ワークフローは、解剖学的位置と宿主種の多様から収集した便や綿棒など、複数のサンプルタイプを、対応することができます。また、DNAを回収し、RNAを分離して使用することができます全ゲノムシーケンシングまたはRNA-seqのなど、他のアプリケーションのため。記載された方法は、複数のサンプルのタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、ゲノムメタゲノムおよび転写情報を下流の解析に対応しています。

<html> 16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を使用して、綿棒からの相対的な細菌の存在量の決意を可能にするプロトコルの一般的な概要は、1【選択プロトコルは人間の膣スワブ用に最適化された図に示されているが、簡単にほとんどの粘膜サンプリングサイトに適合させることができます他のホスト。 図2ビーズビーティングプロトコルを用いて単離することができる高品質のDNAとRNAを示す。 図3は、サンプルと各増幅が正しいの単一の強いバンドが得られた12サンプルの成功したPCR増幅を示しますサイズと各水対照バンドが得られなかった。 図4、配列決定前に最終的なライブラリープールの定量化を示している。 図5のシングルエンド300 bpのMiSeqランの後に典型的なシーケンスの品質プロファイルを示します。 &quot;SRC =&quot; /ファイル/ ftp_upload / 53939 / 53939fig1.jpg &quot;/&gt; 図1プロトコルの概略概要まず 、核酸は、イソアミルアルコール、フェノール、クロロホルムなどを含む緩衝液中でビーズビーティングによりスワブから抽出されます。 16S rRNA遺伝子の可変領域4は、その後、PCRを用いて得られた核酸から増幅されます。サンプルの数百までからのPCRアンプリコンは、単一の実行に合わせて、配列決定されます。結果のシーケンスは、相対細菌の存在量を決定するための参照データベースに一致しています。プロトコル全体は約3日で実施することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig2.jpg" /> 図2.高品質の核酸抽出は、フェノールを用い：クロロホルムビーズはMを打ちますethod。 （A）DNAの品質、分光光度計を用いて評価しました。 1.8と2.0の間のA260 / A280比は、フェノール又はタンパク質で汚染されていない純粋な核酸を示している。（B）カラムクリーンアップの後、このプロトコルは高品質のRNAを得ることができる、強力な16Sおよび23S rRNAのピークによって示されました。サンプルは採取後（輸送および保管中に）冷たい保たれていない場合（C）RNAの分解が発生する可能性がありますまたはリボヌクレアーゼが処理中に存在している場合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig3.jpg" /> 515Fとバーコード806Rプライマーセットを使用して成功した16S rRNAの遺伝子増幅の図3.確認。トップ ）ゲル電気泳動は、380塩基対の周囲の単一バンドの存在を確認するために使用されるInはテンプレートを用いて増幅したすべてのサンプル。バンドの不在が失敗した増幅を示しています。これが原因で、ヒューマンエラーと繰り返されるべきで、そのサンプルからのPCR反応に通常である。 ボトム ）いいえテンプレート（水）コントロールは、バンドの存在を持つべきではありません同じプライマー対と並行して実行されます。水管理におけるバンドの存在は、汚染された試薬を示しています。そのプライマー対のためのテンプレートや水管理の両方のPCR増幅を汚染し、再実行することができる試薬を廃棄する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig4.jpg" /> 個々の試料のアンプリコンをプールした後、 ライブラリサイズの最終図書館プール濃度および検証の図4.定量。、目最終的なライブラリープールの電子濃度が決定されなければなりません。ライブラリプールはその後さらに2 nMの濃度を達成するために希釈しなければならない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53939/53939fig5.jpg" /> 図5.代表バー読むの各位置でのシーケンス品質スコアのプロット。シーケンスの品質は200塩基対の後にドロップするのは正常ですが、平均品質スコアが30以上に維持する必要があり<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/53939fig5large.jpg" target="_blank">、より大きなバージョンを表示するには、こちらをクリックしてください。この図の。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> #SampleID </td><td colspan="2"> バーコード <br/&gt;シーケンス</td><td colspan="3"> LinkerPrimer シーケンス </td><td> rcbcPrimer </td><td> SampleType </td><td> 抽出 バッチ </td><td> 増幅 プレート </td><td> 説明 </td></tr><tr><td> http://qiime.org/_static/Examples/File_：#An例マッピングファイルはで見つけることができます フォーマット/ Example_ マッピング_ FILE.TXT </td><td colspan="2"></td><td colspan="3"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> AG2350 </td><td colspan="2"> TCCCTTGTCTCC </td><td colspan="3"> CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT </td><td> rcbc000 </td><td>頸部の 綿棒</td><td> 1 </td><td> A </td><td></td></tr></tbody></table> 表1 のマッピングファイルのテンプレート。クレアティン正確かつ徹底したマッピングファイルが正常にプロトコルを実行するために重要です。マッピングファイルはQIIMEを実行するために必要とされるだけでなく、それはまた、サンプルバーコードとメタデータとの間のリンクを維持するために、任意の体系的バイアス（ 例えば、バッチ間変動）のデータを分析すること、および決定するために研究を可能にしますメタデータと細菌集団の間で興味深い相関関係。ベアボーンマッピング・ファイルが提供されていますが、ユーザーは、可能な限りメタデータを含むなど、多くの列を追加することをお勧めします。膣スワブのための追加のメタデータの例としては、綿棒コレクション、ホルモン避妊薬の種類（該当する場合）、性感染症検査結果などの参加の年齢、日付/時間を含みます<img alt="Suppliment 1" src="/files/ftp_upload/53939/53939suppliment.jpg" /> バーコードリバースプライマー配列 10 の補足ファイル1.一覧 </suP&gt;。最初の3列は、マッピングファイルを完了するために使用することができ、最後の列は目的を注文するため、全プライマー配列を提供しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53939/Supplemental_Code_File.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

私たちは、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシングを用いて細菌群集の特徴付けのために綿棒から核酸を抽出するための、効率的で堅牢、かつコスト効果的な方法を説明します。方法は、複数のサンプルタイプのための一般的な処理アプローチを可能にし、下流分析プロセスの数を収容します。

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

この手順の全体的な目的は、スワブから高品質なDNAおよびRNAを単離し、16S rRNA遺伝子シークエンシングを用いてそれらの細菌組成を決定することです。この手法により、研究者は特定のヒトサンプルにどのような細菌が含まれているかを特定し、特定の細菌と宿主の特性または疾患状態との関連性を判断することができます。本手法はヒトの膣内細菌叢についての知見を得るために設計されましたが、鼻腔、口腔、皮膚、直腸などの他の身体部位や、他の生物からの細菌叢の研究にも適用可能です。このビデオでは、プロトコルのなかでも特に困難な箇所に焦点を当てており、シーケンシング部分およびシーケンシング解析についてはカバーしていないことに留意してください。私の研究室の技術者であるBrittany Bowmanが実演します。付属のドキュメントに記載されている方法で採取し、ウェットアイスで保存した外子宮頸部スワブを用いて、この手順を開始してください。核酸抽出の準備として、フード内のすべての表面およびフード内に持ち込むすべての物品を、漂白剤で洗浄した後、RNase、DNase、およびDNAを除去する除染剤で処理します。フード内に、サンプル1つにつき1本のビーズビーズチューブを配置します。各チューブに、500 µLのNaCl-Tris-EDTA緩衝液、210 µLの20% SDS、および500 µLのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加えます。本プロトコルで明確な結果を得るには、スワブを慎重に扱うことが極めて重要です。スワブを落とさずに移し替えるには多少の練習が必要ですが、このような中空シャフトのスワブを使用するとより簡単になります。滅菌鉗子を用いて、スワブを輸送用バイアルからビーズビーズチューブへ移してください。綿棒の先端をチューブの内壁に、少なくとも30秒間十分にこすりつけます。チューブを氷上に置きます。その後、手袋を交換し、次のサンプルで綿棒による採取手順を繰り返します。すべてのサンプルを十分に強く擦った後、氷上で少なくとも10分間冷却します。10分経過後、滅菌ピンセットでハンドルの部分を持ち、清潔なP200チップを用いて、スワブの先端をチューブ壁の内側に押し付けます。この操作により、スワブから液体が放出され、核酸の回収率が向上します。ビーズビーディングチューブをビーズビーターにセットし、4 °Cで2分間サンプルをホモジナイズします。次に、ビーズビーディングチューブを6,000 g、4 °Cで3分間遠心分離し、デブリをペレット化して水相とフェノール相を分離させます。遠心後、通常3つの層が確認できます。上層は水相であり、DNAおよびRNAが含まれています。下層は有機相であり、細胞やスワブ由来の脂質およびデブリが含まれています。インターフェースと呼ばれる中央の薄い白い層には、タンパク質が含まれています。水相約 500 〜 600 µL を、滅菌済みの 1.5 mL チューブに移します。等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加えます。転倒混和および短時間のボルテックスで混ぜ合わせます。チューブを5分間遠心分離します。遠心後、水層を新しい滅菌済み1.5 mLチューブに移します。この際、中間層や下層のフェノール層の物質が混入しないように注意してください。転送した液量を確認し、後のタンパク質単離のためにフェノール相を保存してください。次に、0.8量分の中等度のイソプロパノールと0.1量分の3 M 酢酸ナトリウムを加えます。転倒混和と短時間のボルテックスを用いて十分に混ぜ合わせてください。チューブを20 °Cで少なくとも2時間、または一晩冷却し、核酸を沈殿させます。沈殿後、チューブを30分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットを崩さないように注意しながら、ピペットを用いて上清を除去します。100%エタノールを500 µL加えます。穏やかなボルテックス処理、またはペレットに触れないようにピペッティングして、ペレットを剥離させます。5分間遠心分離します。P10ピペットを用いて、ペレットを乱さないように注意しながら、可能な限り多くのエタノールを除去し、廃棄します。室温で15分間、ペレットを風乾させます。その後、20 µLのUltraPure 0.1X-Tris-EDTA緩衝液でペレットを再懸濁します。サンプルを氷上で10分間冷却し、繰り返しピペッティングして完全に再懸濁させます。分光光度計を用いて核酸濃度を測定します。必要に応じて、メーカーのプロトコルに従い、カラム精製キットを用いてDNAをRNAから分離してください。PCRのセットアップはこの手順において極めて重要なステップです。試薬、PCRフード、およびグローブの無菌性を確保し、コンタミネーションを最小限に抑えることが非常に重要です。迅速かつ慎重に作業を行い、フードへの物品の出し入れの際は適切な手法を用いてください。クリーンベンチ内に、マイクロ遠心チューブ用のベンチトップクーラーラックとPCRプレートクーラーを設置します。個別のキャップが付いた8連チューブにラベルを貼り、PCRクーラーに入れます。増幅は3連（triplicate）で実施し、各プライマーペアに対してテンプレートとして水を用いたコントロール（no template water control）を含めてください。マスターミックス用のマイクロ遠心チューブをクーラーに配置します。次に、添付ドキュメントに従い、各サンプルについてUltraPure water、5X HF buffer、dNTPs、515F forward primer、および3% DMSOを混合します。その後、ポリメラーゼをマスターミックスに添加し、ピぺッティングにより混合します。最初のウェルに、マスターミックス 90 µLとリバースプライマー 2 µLを加え、よく混ぜ合わせます。次に、テンプレートなしコントロールとして使用する4番目のウェルに、マスターミックス 23 µLと水 2 µLを加え、混ぜ合わせます。続いて、最初のウェルに適切なサンプル 6 µLを加えます。十分に混ぜ合わせ、25 µLを2番目のウェルに移します。チップを交換し、さらに25 µLを1番目のウェルから3番目のウェルに移します。すべてのウェルのキャップをしっかりと閉めます。ウェルの内部やキャップに触れないように注意してください。次に、この工程を各サンプルに対して繰り返します。すべてのサンプルの調製が完了したら、ストリップチューブを短時間遠心し、サーモサイクラーに移してプログラムを実行します。ランが完了後、チューブを速やかに遠心し、壁面の液体を回収します。次に、清潔なラボベンチ上で、各サンプルのPCR反応液（n=3）を、ラベル付きの滅菌マイクロ遠心チューブにまとめます。各ノーテンプレートコントロール（NTC）から25 µLを、別の滅菌チューブに分注します。まだ異なるサンプルの増幅産物を混合しないでください。PCR増幅が成功したことを確認するため、各サンプル5 µLを1.5%アガロースゲルにロードし、120 Vで30〜60分間電気泳動を行います。UVライトを用いてゲルを確認してください。380 base pairs付近に単一の強いバンドがあることを確認し、各サンプルの増幅が成功したことを検証します。ダブルバンドが見られる場合は、別のリバースバーコードを用いてサンプルを再増幅してください。バンドが全く見られない場合は、同じリバースバーコードまたは新しいリバースバーコードを持つプライマーを使用して、サンプルを再増幅してください。再増幅に失敗した場合は、サンプル中にPCR阻害剤が存在している可能性があるため、カラム法によるDNA精製を行い、PCR阻害剤を除去してください。残りの70 µLの増幅産物は20 °Cで保存します。テンプレート非添加コントロール（no template control）の残り20 µLは、バンドが出現しなかったと想定して廃棄してください。アンプリコンプールを作成するために、各アンプリコンを2〜5 µLずつ、単一の滅菌済みチューブに混合します。サンプルのバンドが薄い場合は、他のサンプルに対して2倍の量を加えてください。その後、キットを用いてPCRプライマーを除去します。必要に応じて、プライマー除去後のアンプリコンプールを混合し、最終ライブラリを作成します。分光光度計または蛍光光度計を用いて、ライブラリのDNA濃度を測定してください。最後に、サンプルを2nMに希釈し、シーケンシングに供します。配列解析に関する詳細な情報は、付随文書に記載されています。高品質なDNAおよびRNAを単離し、このビデオで説明した通り、DNAをテンプレートとして16S rRNA遺伝子V4領域のPCR増幅を行いました。ゲル電気泳動を用いて、テンプレートを用いて増幅したすべてのサンプルにおいて、380 base pairs付近に単一のバンドが存在することを確認しました。同一のプライマーペアを用いて並行して実施したテンプレートなしコントロールでは、バンドは検出されませんでした。その後、PCRアンプリコンを単一のチューブにまとめ、定量し、さらに希釈してからシーケンシングに供しました。ここでは、リードの各ポジションにおけるシーケンスクオリティスコアの代表的な棒グラフを示します。200塩基対を超えるとシーケンス品質が低下するのは一般的です。しかし、平均品質スコアは30以上に維持される必要があります。このビデオを視聴することで、フェノール・クロロフォーム抽出法を用いてスワブからDNAおよびRNAを単離し、16S rRNA遺伝子のV4領域を増幅させ、ハイスループットシーケンス用のライブラリを調製する方法について深く理解できるはずです。この手法を習得すれば、適切に行うことで2日間で完了させることができます。本手順を実施する際は、検体採取、核酸抽出、およびPCR増幅におけるコンタミネーションの防止に細心の注意を払うことが重要です。フェノール・クロロホルムを取り扱う際は極めて危険であるため、常にドラフトチャンバー内で作業し、不浸透性手袋、サイドシールド付き保護メガネ、および白衣を着用するなどの予防措置を講じてください。

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生物学

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学ぶ スワブからの核酸抽出と16S rRNA遺伝子配列決定による細菌群集解析法。フェノール・クロロホルム抽出とPCR増幅を用いて、ヒトサンプルの細菌組成と疾患関連性を明らかにする効率的な手法です。

細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

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