細菌群集の特徴付けのための効率的な核酸抽出および16S rRNAの遺伝子配列決定

この手順の全体的な目標は、綿棒から高品質のDNAとRNAを単離し、16S rRNA遺伝子シーケンシングを使用してそれらの細菌組成を決定することです。この方法は、研究者が特定のヒトサンプルに含まれる細菌を特定し、特定の細菌と宿主の特性または疾患状態との関連を判断するのに役立ちます。この方法は、ヒトの膣内細菌群集に関する洞察を提供するために設計されましたが、この方法は、鼻孔、口、皮膚、直腸などの他の身体部位や他の生物からの細菌群集の研究にも適用できます。

このビデオでは、プロトコルの難しい部分に焦点を当てており、シーケンシング部分やシーケンシング解析については説明していないことに注意してください。私の研究室の技術者であるBrittany Bowmanがデモンストレーションを行います。この手順は、添付の文書に記載されているように、湿った氷の上に収集および保管された子宮頸管外スワブから開始します。

核酸抽出の準備として、フードのすべての表面とフードに持ち込まれたすべてのアイテムを漂白剤で洗浄し、続いてRNase、DNase、およびDNAを除去する除染剤を塗布します。フードには、サンプルごとに1本のビーズビーズチューブを入れます。各チューブに、500マイクロリットルのNaCl-Tris-EDTAバッファー、210マイクロリットルの20%SDS、および500マイクロリットルのフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを追加します。

綿棒の慎重な取り扱いは、このプロトコルで明確な結果を得るために重要です。綿棒を落とさずに移すには少し練習が必要ですが、このような中空のシャフトの綿棒を使用すると簡単です。滅菌鉗子を使用して、輸送用バイアルから綿棒をビーズビーズチューブに移します。

綿棒の頭をチューブの内壁に少なくとも30秒間しっかりとこすります。チューブを氷の上に置きます。次に、手袋を交換し、次のサンプルで綿棒の手順を繰り返します。

すべてのサンプルを激しくこすったら、氷の上で少なくとも10分間冷やします。綿棒を取り外すために10分が経過した後、滅菌ピンセットでハンドルを持ち、清潔なP200チップを使用して、頭をチューブ壁の内側に押し付けます。このプロセスでは、綿棒から液体を放出し、核酸回収率を高めます。

ビーズビーズチューブをビーズビーズに入れ、サンプルを摂氏4度で2分間均質化します。次に、ビーズビーズチューブを6, 000 g、摂氏4度で3分間遠心分離し、破片をペレット化し、水相とフェノール相を分離します。スピン後、通常、3つのフェーズが見られます。

最上層は水相で、DNAとRNAが含まれています。最下層は有機相で、細胞や綿棒からの脂質や破片が含まれています。間期と呼ばれる薄い白い中間層には、タンパク質が含まれています。

約500〜600マイクロリットルの水相を滅菌済みの1.5ミリリットルチューブに移します。等量のフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを追加します。反転と短時間のボルテックスで混合します。

チューブを5分間遠心分離します。スピン後、水相を新しい滅菌1.5ミリリットルチューブに移します。間相または下にあるフェノール相から材料を移動させないように注意してください。

転送された量をメモし、将来のタンパク質単離のためにフェノール相を保存します。次に、0.8容量のイソプロパノールと0.1容量の3モル酢酸ナトリウムを追加します。反転させ、短時間ボルテックスして完全に混合します。

チューブを摂氏20度で少なくとも2時間、場合によっては一晩冷やして、核酸を沈殿させます。沈殿後、チューブを30分間遠心分離します。スピン後、ピペットを使用して上清を慎重に取り除き、ペレットを無傷のままにします。

500マイクロリットルの100%エタノールを追加します。ペレットに触れずに、穏やかなボルテックスまたはピペッティングでペレットを取り出します。5分間遠心分離します。

P10ピペットを使用して、ペレットを乱さずにできるだけ多くのエタノールを取り出して廃棄します。ペレットを室温で15分間風乾します。ペレットを 20 μL の UltraPure 0.1X-Tris-EDTA バッファーに再懸濁します。

サンプルを氷上で10分間冷やし、ピペットで繰り返し使用して、完全な再懸濁を確保します。分光光度計を使用して核酸濃度を測定します。必要に応じて、メーカーのプロトコルに従ってカラムクリーンアップキットを使用してRNAからDNAを分離します。

PCRセットアップは、この手順の重要なステップです。試薬、PCRフード、手袋の無菌性を確保することにより、汚染を最小限に抑えることが非常に重要です。迅速かつ慎重に作業し、フードにアイテムを出し入れするときは適切な技術を使用してください。

フードには、微量遠心チューブ用の清潔なベンチトップクーラーラックとPCRプレートクーラーを配置します。8ウェルストリップチューブに個別のキャップをラベル付けし、PCRクーラーに入れます。増幅はトリプリケートで行う必要があり、各プライマーペアにテンプレートなしの水制御を含める必要があります。

マスターミックス用のクーラーに微量遠心チューブを置きます。次に、添付のドキュメントに記載されているように、各サンプルについて、UltraPure 水、5X HF バッファー、DNTP、515F フォワードプライマー、および 3%DMSO を組み合わせます。次に、マスターミックスにポリメラーゼを加え、ピペッティングで混合します。

最初のウェルに、90マイクロリットルのマスターミックスと2マイクロリットルのリバースプライマーを加え、よく混ぜます。次に、テンプレートなしコントロールとして機能する4番目の井戸に、マスターの23マイクロリットルと水の2マイクロリットルを追加して混合します。次に、6マイクロリットルの適切なサンプルを最初のウェルに加えます。

十分に混合し、25マイクロリットルを2番目のウェルに移します。ヒントを交換してから、さらに25マイクロリットルを最初のウェルから3番目のウェルに移します。すべてのウェルにしっかりとキャップをします。

ウェルの内側やキャップに触れないように注意してください。次に、サンプルごとにこのプロセスを繰り返します。すべてのサンプルが準備されたら、ストリップチューブをすばやく回転させ、サーモサイクラーに移してプログラムを実行します。

ランが完了したら、チューブをすばやく回転させて壁から液体を収集します。次に、クリーンなラボベンチで、各サンプルからのトリプリケートPCR反応を標識された滅菌微量遠心チューブに組み合わせます。各テンプレートコントロールの25マイクロリットルを別の滅菌チューブに移します。

まだ異なるサンプルのアンプリコンを組み合わせないでください。PCR増幅の成功を検証するには、各サンプルの5マイクロリットルを1.5%アガロースゲルにロードし、120ボルトで30〜60分間電気泳動を行います。UVライトの下でゲルを観察する。

各サンプルの増幅が成功したことを確認するには、380塩基対の周りの単一の強いバンドに注目してください。ダブルバンドがある場合は、別のリバースバーコードでサンプルを再増幅します。バンドがまったくない場合は、同じリバースバーコードまたは新しいリバースバーコードのプライマーを使用してサンプルを再増幅します。

再増幅が成功しなかった場合、サンプル中にPCR阻害剤が存在する可能性があり、その場合は、カラムベースのDNAクリーンアップを実行してPCR阻害剤を除去します。残りの70マイクロリットルのアンプリコンを摂氏20度で保管します。残りの 20 マイクロリットルのテンプレートなしコントロールは、バンドが生成されなかったと仮定して破棄します。

アンプリコンプールを作成するには、各アンプリコンの2〜5マイクロリットルを1本の滅菌チューブに組み合わせます。サンプルのバンドが弱い場合は、他のサンプルに比べて体積を 2 倍追加します。次に、キットを使用してPCRプライマーを取り出します。

該当する場合は、プライマーフリーのアンプリコンプールを組み合わせて、最終的なライブラリを作成します。分光光度計または蛍光測定システムを使用して、ライブラリーのDNA濃度を測定します。最後に、サンプルを2ナノモルに希釈し、シーケンシングに送ります。

配列解析の詳細については、添付のドキュメントを参照してください。このビデオで説明されているように、高品質のDNAとRNAを単離し、そのDNAを16S rRNA遺伝子V4領域のPCR増幅のテンプレートとして使用しました。ゲル電気泳動を使用して、テンプレートで増幅したすべてのサンプルに約380塩基対の単一バンドが存在することを確認しました。

同じプライマーペアで並行して実行されるテンプレートなしコントロールには、バンドが存在しませんでした。次に、PCRアンプリコンを1本のチューブに結合し、定量し、さらに希釈してからシーケンシングを行いました。ここに示されているのは、リードの各位置でのシーケンス品質スコアの代表的な棒グラフです。

200塩基対後に配列の品質が低下するのは正常です。ただし、平均品質スコアは 30 を超えている必要があります。このビデオを見れば、フェノールクロロホルムベースの抽出を使用してスワブからDNAとRNAを単離する方法、16SRリボソームRNA遺伝子のV4領域を増幅する方法、ハイスループットシーケンシングのためのライブラリを準備する方法について十分に理解できるはずです。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2日で完了します。この手順を試行する際は、サンプル収集、核酸抽出、およびPCR増幅中の汚染を防ぐために細心の注意を払うことが重要です。フェノールクロロホルムでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、通気孔のあるフードでの作業や不浸透性の手袋、サイドシールド付きの安全メガネ、白衣の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。