植物抽出物からの分散粒子の除去のための凝集剤の効率を評価するための手順

本実験の全体的な目的は、植物抽出物から分散粒子をより効率的に除去できる凝集剤を特定することです。これは、分散粒子の凝集を制御する最も効果的なポリマーおよびパラメータを特定するための実験計画を立てることで達成されます。第2段階では、大規模アプリケーションで使用される単位操作に対応したワークフローを定義します。

次に、様々な条件下で凝集剤を用いた葉抽出液を調製し、濁度および産物の回収率を測定するために分析を行います。結果から、実験計画法（DoE）モデルによる評価に基づいた、最適な凝集条件およびポリマーが示されます。深層ろ過のみを用いた従来の清澄化と比較したこの手法の主な利点は、フィルター容量を数倍に高めることができ、プロセス全体のコストを削減できることです。

凝集により粒子の有効径を増大させることができ、遠心分離やろ過による除去を容易にすることが可能です。したがって、凝集手順に関連する環境プロセスのパラメータをまず特定する必要があります。通常、そのようなパラメータは複数存在します。

したがって、メカニズムモデルが不足している状況において、DoE（実験計画法）のアプローチは適切です。DoEは、文献データおよび事前知識に基づいてパラメータを選択することで設定されます。代表的なパラメータには、インキュベーション時間に加え、ポリマーの種類および濃度が含まれます。

ろ過性能などの凝集効率を評価するために用いられる実験結果についても、実験前に定義しておきます。その後、これらの情報を、調査する因子の数およびシステムに関して既に蓄積されている知識の程度に適したDoE（実験計画法）の形式に入力します。そして、植物抽出物の凝集およびラボスケールでの処理に関連するすべての工程を網羅するワークフローを構築します。

分注量は、高いサンプルスループットを可能にする十分な少量である必要があります。実験室機器の性能は、プロセススケールの装置の性能と相関している必要があります。植物は、最終的なプロセスを代表する方法で栽培されます。

抽出および凝集実験を開始する前に、すべての器具の準備を整えます。凝集剤のストック溶液は、メーカーによる事前希釈の有無を十分に考慮して慎重に調製します。すべての凝集剤で同一のストック濃度を選択することで、その後のピペッティングが簡素化され、ミスの可能性を低減できます。

各新鮮な凝集剤ストック溶液の緩衝液成分、pH、および導電率は、抽出液の条件に合わせるように調製します。DoEスケジュールをピペッティングスキームに変換し、植物抽出液サンプルに添加するストック溶液の量を決定します。植物抽出液サンプルは、DoEでテストする条件に合わせた緩衝液を用いて、収穫したタバコの葉から調製します。

抽出液を攪拌しながら、あらかじめ定義した容量に合わせて分注します。これにより、すべてのサンプルにおいて粒子が均一に分布することが保証されます。その後、凝集剤ストックを添加した際にすべてのサンプルの容量が同一になるよう、各分注液に抽出バッファーを添加します。

DoEで定義されたストック溶液の量を、ランダム化された実行順序に従ってサンプルに順次添加します。ポリマーを添加した後、すぐにチューブを振ってサンプル全体にポリマーを均一に分散させます。これにより、凝集結果の再現性が確保されます。この手法は、凝集剤の組み合わせや、同一凝集剤の繰り返し添加を試験するために容易に修正することが可能です。

ただし、これはDoE（実験計画法）に組み込む必要があります。フロックの形成には通常3～30分の静置時間が必要です。再現性のある結果を得るには、DoEで定義された静置時間を遵守することが不可欠です。

凝集物の沈降速度、またはろ液の濁度およびろ過容量のいずれかを用いて、凝集剤の性能を評価することができます。また、ポリマーがタンパク質などの産物に影響を与えないことを確認することも重要です。データの品質が確認された後、その情報をDoEソフトウェアに転送することができます。

実験データは、データ変換、因子の選択、および品質管理ツールを含むDoEソフトウェアに組み込まれたツールを用いて分析されます。これらのツールを使用することに加え、最終的なモデルは物理学および熱力学の基本法則とも一致している必要があります。モデルの品質が確認されれば、そのモデルを使用して凝集の最適条件を予測することができます。

モデルの予測に基づき、設計空間を最も関連性の高い領域に絞り込むことができ、前述の手順を繰り返して新しいDoE（実験計画法）を設定することが可能です。その後、結果をパイロットスケールまたは製造スケールで確認できます。この代表的な研究では、DoEアプローチを用いて、23種類の異なる合成凝集剤と4種類の天然凝集剤の、タバコ葉抽出物を凝集させる能力について試験を行いました。

ポリマー濃度やポリマーの種類といったポリマー固有のパラメータに加え、インキュベーション時間、温度、バッファーのpH、および導電率などのプロセスパラメータを考慮しました。合計約200個の20 mL抽出液分注量を含む、4つの入れ子状のIV-最適設計（IV-optimal designs）を用いて、温度が4〜30 °Cの間であれば、pH 4〜8の範囲においてPolymin Pがタバコ抽出物に対して最も効果的な凝集剤であることを明らかにしました。凝集には15分間のインキュベーション時間で十分でしたが、導電率が40 mS/cmを超えると効果が低下しました。

しかしながら、DoEアプローチにより、Catiofast VSHがPolymin Pを補完し、40 mS per cmを超える導電率において効果的な凝集を達成することが示されました。これらの凝集剤をタバコ抽出物のダウンストリームプロセスに導入したところ、使用したデプスフィルターの容量が3.2倍から5.7倍に増加し、それに伴いこの工程の製造コストが削減されました。また、これらの凝集剤が、モノクローナル抗体、蛍光タンパク質、レクチン、および様々なワクチン候補を含む標的タンパク質の回収率を低下させないことを確認しました。

最適な凝集条件は、100 Lのパイロットスケールバッチにおいても確認されました。DoEの結果は、ブレード式ホモジナイザーではなくスクリュープレスで調製したタバコ抽出液にも正常に適用でき、収集された情報の適用範囲がいかに広いかが裏付けられました。また、同等に有効であった凝集剤の組み合わせを検証するために、本手法を調整して適用しました。

このビデオを視聴することで、DoE（実験計画法）を用いて植物抽出物の凝集実験をセットアップする方法を理解することができます。