Name: 植物抽出物からの分散粒子の除去のための凝集剤の効率を評価するための手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 学ぶ植物抽出物の分散粒子除去のための凝集剤評価法。実験計画法を用いて最適なポリマーと凝集条件を同定し、濁度低減と濾過効率向上を実現する。バイオテクノロジー研究に有用です。

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私は、トランスジェニックタバコの種子を提供してくださったトーマス・ラーデマッハー博士と、タバコ植物の栽培をいただいたイブラヒム・アル・アメディに感謝したいと思います。編集協力をしてくださったRichard M Twyman博士と、実りある議論をしてくださったRainer Fischer教授に感謝いたします。この研究は、欧州研究会議アドバンスドグラント「Future-Pharma」(提案番号269110)、フラウンホーファー未来財団、およびフラウンホーファー研究機構の内部プログラム(助成金番号)によって部分的に資金提供されました。125-600164を引き付けます。

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著者は、開示することは利害の衝突を持っていません。

粒子の凝集を特徴付けるためにエネルギー省を設定する際に考慮すべき最も重要な側面は、デザインは、原則的に例えば 、pH、ポリマーの種類とポリマー濃度16の影響を予想または考えられる影響36,38を検出し、記述することができなければならないということです。したがって、実際の実験を開始する前に、設計空間（FDS）の割合を評価することが重要です。 FDSは、 例えば 、250の濁度の差を検出し、既知の可変のシステム与えられた2つの実験結果の間で事前に定義された差を検出することが可能な範囲内（設計因子、 例えば、pHによって覆わ）多次元実験空間の割合でありますNTUは、125 NTUの変動を与えられました。 FDSは、追加の実行を使用してデザインを増大させることによって増加させることができ、プロセス制御36を案内するように意図された設計のために≥0.95する必要があります。また、ランの数がトンを許可しない場合彼全実験は一日で行うことが、ブロックを考慮するためのDoEに予め定義されるべきであるバッチ間および日々の変動。植物材料で作...

植物は、広くそのようなフルーツジュースのような食料品を製造するために使用されるが、それらはまた、より高い値のバイオ医薬品製品1-3の製造のためのプラットフォームとして開発することができます。両方の場合において、下流処理（DSP）は、多くの場合、粒子を含んだ抽出物4,5の明確化に続いて、このような葉や果実などの組織からの液体の抽出から始まります。バイオ医薬品の製造のために、DSPのコストが全体的な製造コスト6,7の最大80％を占めることができ、これは、部分的には、ブレードベースの均質8,9として破壊の方法で調製した抽出物中に存在する高い粒子負荷を反映しています。抽出物中の粒度分布に合わせてフィルタ層の合理的な選択は、フィルタ容量を増加し、コスト10,11を削減することができるが、改善がごとに保持されなければならない粒子の数によって定義される絶対的な容量の上限を超えることはできません明確化を達成するためのフィルタ領域の単位。 より少ない粒子が濾過列における最高のフィルタの表面に到達した場合天井に持ち上げることができる、分散粒子が大きなフロック12を形成するために凝集を促進する凝集剤として知られているポリマーと混合される場合、これを達成することができます。このようなフロックの微細化と、より高価なデプスフィルターに到達する粒子の負担を軽減し、より粗い及びより安価なバッグフィルターによってさらに上流に保持することができます。ポリマーは、適正製造基準（GMP）に準拠している必要があり、そして典型的にはモル質量&gt; 100 kDaのを持っている必要がありますし、中立的であるか、または13を帯電したことができますいずれかのバイオ医薬品などのため、それらの用途に適した安全性プロファイルを、持っている必要があります。中立凝集剤は、一般に、それらの凝集および径のフロックを形成させる分散粒子を架橋することによって作用するのに対し、1ミリメートル11、荷電ポリマーがdの電荷を中和します&gt;ispersed粒子は、その溶解性を低下させ、従って、沈殿14を引き起こします。 凝集は、抽出物15,16の特性と一致するように、このような緩衝液のpHまたは導電率、及びポリマーの種類や濃度などのパラメータを調整することによって改善することができます。 0.5〜5.0のG L -1ポリエチレンイミン（PEI）で前処理したタバコ抽出物については、デプスフィルタ容量の2倍以上の増加が100-Lパイロット規模のプロセスで報告されました。セルロース系濾過助剤17と組み合わせた場合、このポリマーのコスト未満€10キロ-1プロセスにため、その導入は、フィルタ、さらにバッチ16またはあたりの消耗品のため、約€6,000コスト削減をもたらしています。たとえそうであっても、予測モデルは、それらの含有は15〜30分間16,18のホールドステップを必要とすることができるため、ストレージのための更なる投資コストで、その結果、凝集剤の先験的経済的利益を評価するために必要とされますタンク。しかし、凝集の複雑な性質のために、このような実験の結果を予測することができます利用可能なメカニズムのモデルは現在ありません。そのため、より適切な設計・オブ・実験（DOE）アプローチ19本資料に記載されているよう開発されました。一般のDOE手順のためのプロトコルは、最近20を出版されました。 小規模な装置は現在、凝集条件21のハイスループットスクリーニングのために利用可能です。しかしながら、これらのデバイスは、現実的に、植物の凝集中に条件をシミュレートしないことがあり、反応容器（96ウェルプレートのウェルについて約7 mm）の寸法ために抽出した粒子またはフロックは離れて一桁未満であることができます。これは、混合パターンため、​​モデルの予測力に影響を与えることができます。また、原因混合挙動の非線形変化の沈殿を含む方法を縮小し、STAを沈殿させることは困難です性22。そこで、この記事では、100Lのパイロットスケールプロセス16への最初の20ミリリットルの反応ボリュームからスケーラブルな結果をもたらす、一日あたり50から75のサンプルのスループットを持つベンチトップ規模スクリーニングシステムの概要を説明します。エネルギー省のアプローチと組み合わせると、これは予測モデルは、品質・バイ・デザインコンセプトの一環として、プロセスの最適化やドキュメントのために使用することができます。 以下に記載される方法はまた、凝集剤はまた、コスト削減ツール23として検討されている細胞培養ベースのプロセスで製造バイオ医薬品に適合させることができます。また、キャノーラ、トウモロコシおよび大豆24,25で生産βグルクロニダーゼのために示されているように、精製戦略の一部として、粗抽出物から標的タンパク質の沈殿をモデル化するために使用することができます。凝集剤の特性の詳細な説明は、16,26の他の場所見つけることができ、そのポリマーconcentrを確保することが重要ですationsは、非毒性または最終製品11中の有害レベル以下のいずれかです。

<table><tbody><tr><td>2100P携帯用濁度計</td><td>Hach</td><td>4650000</td>の<td>濁度計</td></tr><tr><td>2G12抗体</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>参照抗体</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GEヘルスケア</td><td>28-9750-01</td><td>SPR装置</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>袋フィルターCatiofast</td></tr><tr><td>VSH</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>凝集剤</td></tr><tr><td>遠心分離機 5415D</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424 000.410</td><td>遠心分離</td></tr><tr><td>機 遠心分離管 15 ml</td><td>Labomedic</td><td>2017106</td><td>反応管</td></tr><tr><td>遠心分離管 50 ml 自立</td>型 <td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>反応管</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5375.1</td><td>凝集剤</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>&nbsp;4984.3&nbsp;</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>Ferty 2</td>メガ<td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td></td></tr>肥料<tr><td>Forma -86C ULT冷凍庫</td><td>サーモフィッシャー88400</td><td></td>冷凍<td>庫</td></tr><tr><td>温室</td><td>n.a.n.a</td><td>.</td><td>植物栽培用</td></tr><tr><td>グローダンロックウールキューブ 10 x 10 cm</td><td>グローダン</td><td>102446</td><td>ロックウールブロック</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>カールロスGmbH</td><td>9105.3</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>K700P 60D</td><td>ポール</td><td>5302305</td><td>デプスフィルターレイヤー</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>ポール</td><td>B12486</td><td>デプスフィルターレイヤー</td></tr><tr><td>ミラクロス</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R</td><td>フィルタークロス</td></tr><tr><td>マルチライン マルチ 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020</td><td>pHメーター/導電率計</td></tr><tr><td>オスラム クールホワイト 36 W</td><td>オスラム</td><td>4930440</td><td>光源</td></tr><tr><td>フィトトロン</td><td>イルカ・ツェル</td><td>n.a.</td><td>植物栽培用</td></tr><tr><td>ポリミンP</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>凝集剤</td></tr><tr><td>POLYTRON PT 6100 D</td><td>キネマティカ</td><td>11010110</td><td>カスタムブレードツール付き均質化装置</td></tr><tr><td>プロテインA</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 10-1006</td><td>抗体結合タンパク質</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Carl Roth</td><td>GmbH P029.2</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>シナジーHT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>蛍光プレートリーダー</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>ポール</td><td>VP60G03KNH4</td><td>フィルターハウジング</td></tr><tr><td>ゼータサイザー ナノ ZS</td><td>マルバーン</td><td>ZEN3600</td><td>DLS 粒度分布測定</td></tr></tbody></table>

植物抽出物からの分散粒子の除去のための凝集剤の効率を評価するための手順

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

植物は、食品、飼料、原材料などの商品を提供するだけでなく、バイオ医薬品などの付加価値製品の製造プラットフォームとしてますます使用できるため、人間にとって重要です。どちらの場合も、微粒子を除去するために液体植物抽出物を清澄化する必要があるかもしれません。最適な清澄化により、容量と寿命が延びることにより、ろ過と遠心分離のコストが削減されます。これは、凝集剤と呼ばれる荷電ポリマーを導入することで達成でき、凝集剤は分散した粒子を架橋して固液分離を促進します。植物抽出物のような複雑な混合物の機構的な凝集モデルは存在しないため、代わりに経験的モデルが使用されます。ここでは、さまざまな凝集剤の迅速なスクリーニングを可能にし、植物抽出物の清澄化を最適化し、濁度を大幅に低減する実験計画法の手順について説明します。結果として得られる予測モデルにより、ロバストなプロセス条件と相補的な特性を持つポリマーのセット(特定の導電率を持つ抽出物の効果的な凝集など)を特定できます。タバコ葉抽出物の結果は、他の植物種や組織にも容易に適応させることができるため、コモディティや植物由来の医薬品のより費用対効果の高い下流プロセスの開発が容易になります。

異なるポリマーとタバコ抽出物の凝集上述の方法は、正常なモノクローナル抗体（HIV中和抗体2G12）と蛍光タンパク質（DsRedの）（ 図1）16の製造中にタバコ抽出物の凝集のためのプロセスを開発するために使用し、以降転送されていますレクチン、マラリアワクチン候補および融合タンパク質（未発表データ）を含む他のタンパク質に。典型的には、凝集剤の適用は、〜6000 NTU（抽出後万NTU）へ〜千NTUからバッグろ過植物抽出物の濁度を減少させました。 （この要因は凝集効率13,27に影響するため）最初のスクリーニング実験では、91ランIV-最適設計は、3つの異なる濃度で18の異なるポリマーをテストするために使用され、〜12時間のインキュベーションペリオ上に凝集を観察D（ 図2AおよびB）。長い潜...

>jove_content<ここで提示されている実験計画法は、植物抽出物中の分散粒子を凝集させる能力の観点から、さまざまな凝集剤の評価を可能にし、その結果、濁りと下流処理のコストを削減します。

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

本実験の全体的な目的は、植物抽出物から分散粒子をより効率的に除去できる凝集剤を特定することです。これは、分散粒子の凝集を制御する最も効果的なポリマーおよびパラメータを特定するための実験計画を立てることで達成されます。第2段階では、大規模アプリケーションで使用される単位操作に対応したワークフローを定義します。次に、様々な条件下で凝集剤を用いた葉抽出液を調製し、濁度および産物の回収率を測定するために分析を行います。結果から、実験計画法（DoE）モデルによる評価に基づいた、最適な凝集条件およびポリマーが示されます。深層ろ過のみを用いた従来の清澄化と比較したこの手法の主な利点は、フィルター容量を数倍に高めることができ、プロセス全体のコストを削減できることです。凝集により粒子の有効径を増大させることができ、遠心分離やろ過による除去を容易にすることが可能です。したがって、凝集手順に関連する環境プロセスのパラメータをまず特定する必要があります。通常、そのようなパラメータは複数存在します。したがって、メカニズムモデルが不足している状況において、DoE（実験計画法）のアプローチは適切です。DoEは、文献データおよび事前知識に基づいてパラメータを選択することで設定されます。代表的なパラメータには、インキュベーション時間に加え、ポリマーの種類および濃度が含まれます。ろ過性能などの凝集効率を評価するために用いられる実験結果についても、実験前に定義しておきます。その後、これらの情報を、調査する因子の数およびシステムに関して既に蓄積されている知識の程度に適したDoE（実験計画法）の形式に入力します。そして、植物抽出物の凝集およびラボスケールでの処理に関連するすべての工程を網羅するワークフローを構築します。分注量は、高いサンプルスループットを可能にする十分な少量である必要があります。実験室機器の性能は、プロセススケールの装置の性能と相関している必要があります。植物は、最終的なプロセスを代表する方法で栽培されます。抽出および凝集実験を開始する前に、すべての器具の準備を整えます。凝集剤のストック溶液は、メーカーによる事前希釈の有無を十分に考慮して慎重に調製します。すべての凝集剤で同一のストック濃度を選択することで、その後のピペッティングが簡素化され、ミスの可能性を低減できます。各新鮮な凝集剤ストック溶液の緩衝液成分、pH、および導電率は、抽出液の条件に合わせるように調製します。DoEスケジュールをピペッティングスキームに変換し、植物抽出液サンプルに添加するストック溶液の量を決定します。植物抽出液サンプルは、DoEでテストする条件に合わせた緩衝液を用いて、収穫したタバコの葉から調製します。抽出液を攪拌しながら、あらかじめ定義した容量に合わせて分注します。これにより、すべてのサンプルにおいて粒子が均一に分布することが保証されます。その後、凝集剤ストックを添加した際にすべてのサンプルの容量が同一になるよう、各分注液に抽出バッファーを添加します。DoEで定義されたストック溶液の量を、ランダム化された実行順序に従ってサンプルに順次添加します。ポリマーを添加した後、すぐにチューブを振ってサンプル全体にポリマーを均一に分散させます。これにより、凝集結果の再現性が確保されます。この手法は、凝集剤の組み合わせや、同一凝集剤の繰り返し添加を試験するために容易に修正することが可能です。ただし、これはDoE（実験計画法）に組み込む必要があります。フロックの形成には通常3～30分の静置時間が必要です。再現性のある結果を得るには、DoEで定義された静置時間を遵守することが不可欠です。凝集物の沈降速度、またはろ液の濁度およびろ過容量のいずれかを用いて、凝集剤の性能を評価することができます。また、ポリマーがタンパク質などの産物に影響を与えないことを確認することも重要です。データの品質が確認された後、その情報をDoEソフトウェアに転送することができます。実験データは、データ変換、因子の選択、および品質管理ツールを含むDoEソフトウェアに組み込まれたツールを用いて分析されます。これらのツールを使用することに加え、最終的なモデルは物理学および熱力学の基本法則とも一致している必要があります。モデルの品質が確認されれば、そのモデルを使用して凝集の最適条件を予測することができます。モデルの予測に基づき、設計空間を最も関連性の高い領域に絞り込むことができ、前述の手順を繰り返して新しいDoE（実験計画法）を設定することが可能です。その後、結果をパイロットスケールまたは製造スケールで確認できます。この代表的な研究では、DoEアプローチを用いて、23種類の異なる合成凝集剤と4種類の天然凝集剤の、タバコ葉抽出物を凝集させる能力について試験を行いました。ポリマー濃度やポリマーの種類といったポリマー固有のパラメータに加え、インキュベーション時間、温度、バッファーのpH、および導電率などのプロセスパラメータを考慮しました。合計約200個の20 mL抽出液分注量を含む、4つの入れ子状のIV-最適設計（IV-optimal designs）を用いて、温度が4〜30 °Cの間であれば、pH 4〜8の範囲においてPolymin Pがタバコ抽出物に対して最も効果的な凝集剤であることを明らかにしました。凝集には15分間のインキュベーション時間で十分でしたが、導電率が40 mS/cmを超えると効果が低下しました。しかしながら、DoEアプローチにより、Catiofast VSHがPolymin Pを補完し、40 mS per cmを超える導電率において効果的な凝集を達成することが示されました。これらの凝集剤をタバコ抽出物のダウンストリームプロセスに導入したところ、使用したデプスフィルターの容量が3.2倍から5.7倍に増加し、それに伴いこの工程の製造コストが削減されました。また、これらの凝集剤が、モノクローナル抗体、蛍光タンパク質、レクチン、および様々なワクチン候補を含む標的タンパク質の回収率を低下させないことを確認しました。最適な凝集条件は、100 Lのパイロットスケールバッチにおいても確認されました。DoEの結果は、ブレード式ホモジナイザーではなくスクリュープレスで調製したタバコ抽出液にも正常に適用でき、収集された情報の適用範囲がいかに広いかが裏付けられました。また、同等に有効であった凝集剤の組み合わせを検証するために、本手法を調整して適用しました。このビデオを視聴することで、DoE（実験計画法）を用いて植物抽出物の凝集実験をセットアップする方法を理解することができます。

procedure-to-evaluate-efficiency-flocculants-for-removal-dispersed

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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植物抽出物からの分散粒子の除去のための凝集剤の効率を評価するための手順

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