補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化

本実験手順の全体的な目的は、アルギン酸ビーズに固定化した結合全細胞バイオ触媒システムを用いることで、生産収率の向上と再利用性を実証することです。これが私の研究テーマであり、バイオ触媒の固定化、安定性、コファクターの再生、および全細胞バイオ触媒といった、バイオカタリシス分野における重要な課題に取り組んできました。本手法の主な利点は、コファクター依存性経路による多くの重要なバイオ分子の生産性を向上させるための、シンプルかつ柔軟なアプローチを提供できる点にあります。

本プロトコルでは、2種類の組換えE coli株を使用します。NADHオキシダーゼを発現するSpNOx E coliと、L-アラビニトール脱水素酵素を発現するHjLAD E coliです。本手順は両方のE coli株で共通であるため、ここではHjLAD E coliのみを用いて実演します。

15 µg/mLのKet-A-My-Sinを添加した3 mLのLB培地に、HjLAD E coliのシングルコロニーを接種し、振盪インキュベーターで一晩培養します。翌日、この培養液を15 µg/mLのKet-A-My-Sinを含む200 mLの新鮮なLB培地で100倍に希釈し、OD 600が約0.6に達するまで37 °C、250 RPMで培養します。培養液に0.1 mMのIPTGを添加し、25 °C、200 RPMで6時間培養することで、HjLADタンパク質の発現を誘導します。

3200 ×g、4 °Cで20分間遠心分離し、誘導後の細胞を回収します。上澄み液を除去し、次のセグメントで示す方法で細胞ペレットの処理を進めます。この手順を開始するために、HjLAD E coliとSpNox E coliの細胞ペレットを、それぞれ50 mM Tris-Hclバッファーを用い、細胞密度5 g dry cell weight/Lで懸濁します。

14 mLの丸底チューブに、5 g dry cell weight/LのHjLAD E coliを600 µL、5 g dry cell weight/LのSpNOx E coliを600 µL、20 mMのNAD+を100 µL、および2 MのL-aribinitolを150 µL混合します。50 mMのTris-HClを550 µL添加し、反応液量を2 mLにします。反応混合物を30 °C、200 RPMで8時間インキュベートします。

8時間後、混合物を3200 ×g、4 °Cで10分間遠心分離し、反応上清を回収します。比色法によりL-xyluloseの産生量を定量するため、回収した上清100 µLを1.5 mLチューブに分注します。1.5% cysteine 50 µL、70% sulfuric acid 900 µL、およびエタノールに溶解した0.1% Kar-Piz-All 50 µLを加え、チューブを3回反転させて緩やかに混合します。

反応混合液を37 °C、200 RPMで20分間インキュベートします。分光光度計を用いて、反応混合液の560 nmにおける吸光度を測定します。4%アルギン酸溶液を調製し、固定化プロトコルを開始します。

0.8 gのアルギン酸ナトリウムを20 mLの蒸留水に加え、混合物を加熱してアルギン酸ナトリウムを溶解させます。4%アルギン酸溶液1.2 mLに、乾燥菌体重量5 g/LのHjLAD E coliを600 µL、および乾燥菌体重量5 g/LのSpNOx E coliを600 µL加えます。気泡の形成を避けるため、緩やかにピペッティングして菌体とアルギン酸を混合します。

均一なサイズ、形態、および剛性を持つアルギン酸ビーズを確実に形成させるには、細胞懸濁液を十分な量の塩化カルシウム溶液に、最適な距離からゆっくりと一滴ずつ滴下し、すべてのビーズが浸るようにすることが重要です。ニードルを使用してシリンジにアルギン酸細胞懸濁液を吸引し、連続的に攪拌しながら、100 mLビーカーに入れた0.3 M塩化カルシウム溶液にこの混合液を滴下します。架橋反応を進行させるため、ビーズを攪拌せずに室温の塩化カルシウム溶液中で2〜3時間静置します。

ビーズを乱さないように注意しながら、塩化カルシウム溶液を15 mLコニカルチューブに慎重に注ぎ、デカンテーションします。残ったビーズを別の50 mLコニカルチューブに移します。過剰な塩化カルシウムとカプセル化されなかった細胞を除去するため、50 mM Tris-HCl緩衝液でビーズを洗浄します。

ビーズに10 millilitersの緩衝液を加え、懸濁液を3〜5分間静置します。ビーズが底に沈殿したら、緩衝液を別の容器にデカンテーションして除去します。この手順で、ビーズを3回洗浄します。

いずれの工程においても、ビーズを遠心分離しないでください。破裂する恐れがあります。使用済みのTris-HCl洗浄バッファーは廃棄しないでください。先に回収した塩化カルシウム溶液を含む、使用済みの洗浄バッファー30 millilitersを吸い出します。

回収した塩化カルシウムおよびTris-HCl溶液を3200 ×gで20分間遠心分離し、固定化されていないE coli細胞をペレット化します。洗浄後のビーズをチューブに移します。続いて、細胞ペレットの代わりに洗浄後のビーズをすべて用いて、細胞ペレットで実演した手順に従いL-xyluloseの生物合成能を評価します。

L-キシロース生産用固定化バイオカタリストの安定性を評価するために、形成後のビーズを回収します。そして、前述した通り、遠心分離を行わずに10 mLの50 mM Tris-HCl緩衝液で2回洗浄します。洗浄したすべてのビーズを用いて、前述した手順に従いL-キシロース生産反応を行います。

前述した方法と同様に、比色法を用いてL-xyluloseの生成量を定量します。目的の生産サイクル数分だけL-xylulose生成反応を繰り返し、各サイクルにおける反応上清中のL-xylulose生成量を測定します。この連結全細胞バイオカタリシスシステムにより、L-xyluloseの生成が促進されます。

150 millimolarのL-aribinitolの初期濃度から開始し、HjLAD E coliバイオキャタリストのみを用いた場合、L-xyluloseの収率は79%でした。対照的に、HjLAD E coli細胞とSpNOx E coli細胞を1:1の比率で用いた場合、L-xyluloseの収率は96%となりました。バイオキャタリストの固定化効率に影響を与えるパラメータを評価した結果、アルギン酸ナトリウム濃度を1%から3%の範囲で増加させると、効率が向上することが明らかになりました。

しかしながら、アルギン酸ナトリウム濃度が2%を超えると、L-キシルロースの収率が低下します。アルギン酸ナトリウム濃度を2%としたとき、固定化およびL-キシルロース収率における塩化カルシウムの最適濃度は0.3 molarであると決定されました。続いて、バイオカタリストの再利用性を評価しました。

このグラフでは、固定化および遊離の共連結全細胞バイオカタリストを7サイクル連続で再利用した際のL-xylulose生成量が、それぞれ濃い灰色と薄い灰色で示されています。固定化共連結全細胞バイオカタリストによる最大L-xylulose収率は、遊離共連結全細胞システムよりも低いものの、固定化によって再利用性は向上しています。7サイクルの連続再利用の終了時点で、固定化バイオカタリストは安定性を維持し、初期のL-xylulose収率の65%を保持していました。

この手法の開発後、バイオカタリシス分野の研究者は、全細胞バイオカタリストの収率や、コファクターが関与する主要な反応を探索することが可能になりました。