補因子再生と改善された再利用のためのアルギン酸ビーズでマルチ生体触媒の固定化

この実験手順の全体的な目標は、アルギン酸ビーズに固定化された結合全細胞生体触媒システムの使用を実証し、生産収率と再利用性を向上させることです。これは私のテーマであり、生体触媒の固定化、安定性、補因子再生、全細胞生体触媒などの生体触媒分野の重要な質問に答えました。この技術の主な利点は、補因子依存性経路による多くの重要な生体分子の産生を改善するためのシンプルでありながら柔軟なアプローチを提供することです。

このプロトコルでは、2つの組換え大腸菌株が使用されます。NADHオキシダーゼを発現するSpNOx E大腸菌と、L-アラビニトールデヒドロゲナーゼを発現するHjLAD E大腸菌です。この手順は両方の大腸菌株で同じであるため、HjLAD E大腸菌についてのみ実証されます。

HjLAD E大腸菌の単一コロニーを3ミリリットルのLB培地に接種し、1ミリリットルあたり15マイクログラムのKet-A-My-Sinを補充し、インキュベーターシェーカーで一晩インキュベートします。翌日、Ket-A-My-Sinの1ミリリットルあたり15マイクログラムを含む新鮮なLBの200ミリリットルで培養物を1〜100に希釈し、OD600が約0.6に達するまで250RPMで摂氏37度でインキュベートします。培地に0.1ミリモルのIPTGを添加し、摂氏25度、200 RPMで6時間インキュベートすることにより、HjLADタンパク質の発現を誘導します。

誘導した細胞を、Gの3200倍、摂氏4度で20分間遠心分離して回収します。上清を捨て、次のセグメントに示すように細胞ペレットの処理を続行します。この手順を開始するために、HjLAD E大腸菌とSpNox E大腸菌の細胞ペレットを50ミリモルのTris-Hcl緩衝液に別々に懸濁し、細胞密度は乾燥細胞重量1リットルあたり5グラムです。

14ミリリットルの丸底チューブに、HjLAD E大腸菌1リットルあたり5グラムの乾電池重量の600マイクロリットル、1リットルあたり5グラムの乾電池重量の600マイクロリットルをSpNOx E大腸菌、100マイクロリットルの20ミリモルNADプラス、および150マイクロリットルの2モルL-アリビニトールを混合します。50ミリモルのTris-HClを550マイクロリットル加えて、反応量を2ミリリットルにします。反応混合物を摂氏30度、200RPMで8時間インキュベートします。

8時間後、混合物をGの3200倍、摂氏4度で10分間遠心分離し、反応上清を回収します。比色アッセイによりL-キシルロース産生を定量するには、採取した上清100マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに吸引します。エタノールに溶かした1.5%システインを50マイクロリットル、70%硫酸を900マイクロリットル、0.1%Kar-Piz-Allを50マイクロリットル加え、チューブを3回反転させて穏やかに混合します。

反応混合物を摂氏37度、200RPMで20分間インキュベートします。分光光度計を使用して、反応混合物の560ナノメートルでの光吸光度を測定します。固定化プロトコルは、4%アルギン酸溶液を調製して開始します。

0.8ミリリットルの蒸留水に0.8グラムのアルギン酸ナトリウムを加え、混合物を加熱してアルギン酸ナトリウムを溶解します。1リットルあたり5グラムの乾燥気電池重量の600マイクロリットルを追加します HjLAD E大腸菌、および1リットルあたり5グラムの乾燥気電池重量の600マイクロリットルを1リットルあたり4%アルギン酸溶液の1.2ミリリットルに追加します。細胞を混合し、気泡の形成を避けるために穏やかなピペッティングでアルギン酸を添加します。

均一なサイズ、形態、剛性を持つアルギン酸ビーズの形成を確実にするためには、細胞アルギン酸懸濁液をゆっくりと滴下しながら最適な距離で、すべてのビーズを覆うのに十分な量の塩化カルシウム溶液に加えることが重要です。アルギン酸細胞懸濁液を針を使用してシリンジに吸引し、次いで混合物を100ミリリットルビーカー中の0.3モル塩化カルシウム溶液に連続的に攪拌しながら滴下する。ビーズを塩化カルシウム溶液に室温で2〜3時間放置し、攪拌せずに架橋を行います。

塩化カルシウム溶液を15ミリリットルの円錐管に慎重に注ぐことにより、ビーズを乱さずに塩化カルシウム溶液をデカントします。残りのビーズを別の50ミリリットルの円錐管に移します。過剰な塩化カルシウムとカプセル化されていない細胞を除去するには、ビーズを50ミリモルのTris-HClバッファーで洗浄します。

ビーズに10ミリリットルの緩衝液を加え、懸濁液を3〜5分間邪魔されずに放置します。ビーズが底に落ち着いたら、バッファーを別の容器にデカントします。このように、ビーズを3回洗います。

ビーズを任意のステップで遠心分離しないでください、またはビーズは破裂します。使用済みのTris-HCl洗浄バッファーは廃棄しないでください。30ミリリットルの使用済み洗浄バッファーを、以前に収集した使用済み塩化カルシウム溶液で引き出します。

固定化されていない大腸菌細胞を、引っ張った塩化カルシウムとTris-HCl溶液をGの3200倍で20分間遠心分離することにより、ペレット化します。洗浄したビーズをチューブに移します。続いて、細胞ペレットについて示された手順に従って、しかし細胞ペレットの代わりに洗浄されたすべてのビーズを使用して、L-キシルロース生合成を評価します。

L-キシルロース産生のための固定化生体触媒の安定性を評価するには、ビーズが形成された後にビーズを収集します。また、先に示したように、遠心分離せずに10ミリリットルの50ミリモルTris-HClバッファーで2回洗浄します。洗浄したすべてのビーズを使用して、前に示したようにL-キシルロース生成の反応を実行します。

L-キシルロースの産生を比色アッセイで定量します(これも前に示したように)。L-キシルロース産生反応を所望の生産サイクル数だけ繰り返し、各サイクルで反応上清で産生されるL-キシルロースの量を測定します。L-キシルロース産生は、この結合全細胞生体触媒システムによって増強されます。

150ミリモルのL-アリビニトールの初期濃度から始めて、HjLAD E大腸菌生体触媒のみの使用は、79%のL-キシルロースの収量をもたらしました。これに対し、HjLAD E大腸菌とSpNOx E大腸菌の細胞を1対1の比率で使用すると、96%のL-キシルロースが得られました。生体触媒の固定化効率に影響を与えるパラメータの評価により、アルギン酸ナトリウム濃度が1〜3パーセントの範囲で増加すると効率が向上することが明らかになりました。

ただし、アルギン酸ナトリウム濃度が2%を超えると、L-キシルロースの収量が減少します。アルギン酸ナトリウム濃度を2%とすると、固定化に最適な塩化カルシウム濃度とL-キシルロースの収率は0.3モルと決定されました。生体触媒の再利用性を評価しました。

このグラフでは、固定化および自由共役全細胞生体触媒の7つの連続した再利用サイクルのL-キシルロース産生をそれぞれ暗い灰色と明るい灰色で示しています。固定化共役全細胞生体触媒による最大L-キシルロース収率は、自由共役全細胞システムによるものよりも低いが、固定化により再利用性が向上する。7サイクルの連続的な再利用の終わりに、固定化された生体触媒は安定性を維持し、元のL-キシルロースの収率の65%を保持しました。

その開発後、この技術は、生体触媒の分野の研究者がフルマルチセル生体触媒の収量と、補因子が関与する主な反応を探求する道を開きました。