でプライマリ神経発生を評価しますアフリカツメガエル胚用いた免疫染色

この実験の全体的な目標は、発生中のゼノプス胚脳におけるニューロン細胞のさまざまな集団を迅速かつ便利に視覚化できるようにすることです。これらの方法は、ゼノプス中枢神経系におけるニューロン分化の制御過程の観察など、一次ニューロン新生の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、神経幹細胞前駆細胞プールと分化した一次神経プールを1回の実験で同時に観察できることです。

この手順を開始するには、気泡を導入せずに、プラスチックまたはガラスピペットを使用してガラスバイアルから5〜10個の胚を慎重に吸引します。胚をマウントチャンバーに移し、ステレオスコープで観察します。取り付けチャンバーにゼラチン溶液を充填して、セクションブロックの剛性を確保します。

次に、一対の細い先端の鉗子を使用して胚を並べて配置します。極低温対応マーカーを使用してチャンバーの縁に矢印を描き、頭の向きをマークします。胚の複数のグループについては、対応するチャンバーの縁に各グループの説明を書き留めます。

次に、ドライアイスで半分満たされたフォームボックスにチャンバーを水平に慎重に置きます。蓋を閉め、取り付けチャンバーを一度に1つずつ5〜10分間凍結させます。その後、凍結切片処理を進めるか、凍結したサンプルを免疫原性を失うことなく少なくとも1〜2週間摂氏80度に保ちます。

この手順では、鈍いスティックまたは指を使用してチャンバーの底を押して、凍結したサンプルブロックをチャンバーから取り出します。次に、サンプル保持ディスクに組織凍結培地を数滴加えます。胚の前端を上にしてサンプルブロックをマウントし、マウントされたブロックをクライオスタットチャンバー内に約1分間、または組織凍結培地が不透明になるまで放置します。

サンプル保持ディスクを、サンプルブロックの下側を上にしてすぐにミクロトームに取り付けます。サンプルブロックがまだ比較的柔らかいときに、ブレードを使用してサンプルブロックの一部を切り取ります。次に、サンプル保持ディスクをミクロトーム上に少なくとも5分間放置して、温度が平衡に達するまで待ちます。

その後、オタマジャクシの頭が半透明のゼラチンを通して見えるまで、サンプルブロックを徐々にトリミングします。トリミング速度を上げるには、断面の厚みを大きくします。ブレードの切れ味や角度などのクライオスタットの性能を監視して、後続のセクションが長いストリップで生成されることを確認します。

オタマジャクシの頭が見えてきたら、クライオスタットの設定を通常の状態に戻し、完成したスライスがストリップを形成し、ブレードに重なったり付着したりしないようにします。次に、オタマジャクシの頭がほとんど露出するまでトリミングを続けます。サンプルセクションの収集を開始する前に、ステージ上の残りのセクションを払い落とします。

約10〜15個のセクションを作成し、それらを長いストリップを形成します。厚いカバーガラスプレートを横に裏返し、細い先端の絵筆を使用してストリップをブレードからそっと取り外します。次に、長軸をブレードと平行にしてステージに並べます。

10〜15個のセクションを作り、壊れずに長いストリップを形成します。それは簡単ではないかもしれませんし、練習が必要です。1つの秘訣は、ハンドホイールに速度を高くしすぎないようにすることです。

むしろ、ハンドホイールを慎重にゆっくりと回転させます。その後、室温で正に帯電したスライドを1枚選び、鉛筆でラベルを付けます。次に、ラベルの付いた面を下に向けて、すばやくしっかりとストリップに押し付けます。

その後、スライドをクライオスタットチャンバーから取り出します。この手順を繰り返して、各スライドに20〜30個のスライスを平行に配置します。側面を10分間風乾してから、すぐに免疫染色手順に進むか、免疫染色手順が行われる前に、スライドを摂氏80度のスライドボックスに最大3〜6か月間保管します。

ここでは、キセノプスオタマジャクシの前脳、中脳、後脳、脊髄の対応する断面を見ることができ、次の画像の位置参照を提供するために使用されます。Anti-Sox 3、Anti-Acetylated Tubulin、およびDAPIで染色した対応する断面は、神経幹細胞プールと神経管内のニューロフィラメントの相対的な位置を示しています。また、Anti-MyT1とDAPIで染色した対応する断面図は、神経管内の分化した一次ニューロンの相対的な位置を示しています。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了できます。この手順を試行する際は、ドライアイス中のサンプルブロックに十分な冷却時間を確保することを忘れないでください。そうしないと、サンプルブロックの硬さが足りず、切断が難しくなる可能性があります。

その開発後、この技術は、発生神経科学の分野の研究者がゼノプス中枢神経系の神経分化を探求する道を開きました。このビデオを見た後、切片の作り方をよく理解し、ゼノプス中枢神経系の神経細胞の特定のプールを観察するはずです。