Name: でプライマリ神経発生を評価しますアフリカツメガエル胚用いた免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 学ぶ免疫蛍光染色法によるXenopus胚の一次神経発生評価技術。神経幹細胞と分化ニューロンを同時可視化し、約2時間で完了する迅速な手法で発生神経科学の研究に有用です。

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私たちは親切に、それぞれ、抗Sox3および抗MYT1抗体を提供するためにコロラド大学ボールダー校教授マイケルKlymkowskyとマンチェスター大学で教授ナンシーPapalopuluに感謝します。私たちは、このプロトコルを開発する上で彼らの洞察に満ちた提案をPapalopuluラボのメンバーに感謝します。この作品は、SZとJLには、2つのヒーリング財団Studentships、そ​​れぞれヒーリング財団からSZ / EAおよびJL / EAへの2つのプロジェクト助成金、EAへのウェルカムトラストから一つのプログラムの助成金（WT082450MA）、および1制度の戦略的支援の助成金によってサポートされていましたウェルカム・トラスト[097820 / Z / 11 / Z]から。

<ol><li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li>
<li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li>
<li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li>
<li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li>
<li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsoventral+patterning+in+Xenopus%3A+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li>
<li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li>
<li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li>
<li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li>
<li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta-catenin%2FVegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li>
<li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li>
<li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-MyT1%2C+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li>
<li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+%28Xenopus+laevis%29%3A+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li>
<li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li>
<li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li>
<li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li>
<li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neurogenesis+in+Xenopus%3A+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li>
<li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fbeta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li>
<li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li>
<li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li>
<li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li>
<li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2%2F3+expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signalling+during+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469(2013).</li>
<li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li>
<li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li>
<li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cDNA%2FMorpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107(2007).</li>
<li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li>
<li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Ca2%2B-binding+protein%2C+parvalbumin%2C+during+embryonic+development+of+the+frog%2C+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li>
<li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xaml1%2FRunx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li>
<li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+%28FISH%29+on+whole+mounts+and+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li>
<li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+optical+imaging+in+living+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li>
<li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pTransgenesis%3A+a+cross-species%2C+modular+transgenesis+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li>
<li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter%3A+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li>
<li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここでは、 アフリカツメガエル胚における一次神経新生を可視化するための便利で効率的な方法を示しています。この方法は、細胞型特異的マーカーを用いて、神経幹細胞および分化した初代ニューロンを含む神経細胞の異なる種類の評価を可能にします。 プロトコルは、再現性の非常に高いレベルで一般的に堅牢です。前孵化段階にある胚（ すなわち 、最大28のステージに）、これは胚が完全に固定する前に、真っすぐになることができますように、我々は手動で固定前に卵黄膜を除去することをお勧めします。 （孵化する前に）比較的早い段階で胚を収集する際に曲がった胚が装着室内部に所望の向きに配置することが極めて困難であるため、これは特に重要です。 MEMFAまたはPFA固定、したがって、追加の抗原回復ステップは、このプロトコルには必要ありません後に我々は、免疫原性の損失を経験していません。また、この免疫染色の手順は、in situハイブリダイゼーション発色/蛍光からのサンプルで実施することができます。このようなシナリオでは、in situハイブリダイゼーションプロトコルの間にプロテアーゼK処理工程を省略することをお勧めします。蛍光/発色基質反応の後、試料を、TBSで洗浄することができ、MEMFA / PFA固定したサンプルと同様に魚ゼラチン溶液に包埋しました。蛍光in situハイブリダイゼーションは、後免疫蛍光染色と一緒に画像化される場合、サンプルバイアルをアルミホイルでバイアルを包むことによって光から保護することができます。 いくつかのケースでは、胚は、ゼラチン浸透後過度に収縮することができます。これは、おそらくどちらかが不十分な固定または不十分なTBS-トリトン抽出によって引き起こされます。胚は4℃で少なくとも2〜3時間、好ましくは一晩PFA / MEMFAで修正されていることを確認してください。問題が解決しない場合は、1時間、3にTBS-トリトンの洗浄時間を増加させます。 クライオ切断面の間に魚ゼラチンの異なるバッチは、異なる特性を有するように寧、サンプルブロックの剛性が変化してもよいです。この問題は、部分的にミクロトームの温度を調整することによって補償することができます。より低い温度は、サンプルブロックがセクションにくっきりと困難になるしかし、過度の低温下で「硬い」のサンプルブロックになります。各切片の前に（胚なしモックサンプルブロックを使用して）いくつかの微調整や練習は、特に貴重なサンプルを上の使用前に有益であり得ます。 切片中に一般的に遭遇する問題は、時々厚のガラス板上に固執するのではなくスチールステージ上に平らに滞在する傾向が薄い部分です。これは、常に連続的な切削プロセスを中断するので、特に破壊することができます。セクション室と（特に）厚のガラス板が機械およびoに十分な寒さ、または過度の静電気されていない。このような例は、通常、二つの理由のいずれかによって引き起こされます特に乾燥した天候でperator、。前者はセクション室の温度を下げ、余分な時間（おそらく一晩）内のガラス板を残すことによって解決することができます。かつ適切クライオスタットを接地することにより、後者。金属タップまたは金属製の同様の水配管システムにクライオスタットの金属面に接続すると、静電気を放出するための代替方法することができます。各使用後、厚いガラス板は、（そのような食器用洗剤など）、非腐食性の洗剤でよく洗浄しなければならない超純水によりリンスし、純粋なエタノールを噴霧し、損傷から表面及びエッジを保護するためにタオル紙に包まれました。 プロトコルに記載された抗体は、一般的に特異的であり、我々はほとんど非特異的吸着または高いバックグラウンドシグナルが発生しません。すべき（血清中のふわふわ沈殿の形成により可視化）、ブロッキング剤としての過度の熱不活性化を熱不活性化ヤギ/子羊血清を使用している場合、ことに留意すべきですこの沈殿剤は、二次抗体に非常に魅力的であり、高いバックグラウンドのソースに貢献するかもしれないとして避けるこ​​と。 ことが可能であり、時には同時に神経細胞の異なる集団を可視化するために二重染色を行うために、所望します。このような二重染色が可能であり、一般的に以下の組み合わせで満足のいく結果が得られます。Sox3 / N-浴槽またはMYT1 / N-浴槽。しかし、Sox3およびMYT1の二重染色は、2つの抗体がウサギの起源からの両方であるという事実によって複雑になります。私たちは、おそらく二次抗体からの信号増幅の不足のために、しかし、満足な結果が観察されなかったいくつかの抗体の直接標識キットを、（低信号対雑音レベル）を試験しています。この問題を回避する1つの可能なアプローチは、以下に説明するように、 アフリカツメガエルにおけるトランスジェニック系統を上げることです。 このプロトコルの主な制限の一つは、このプロトコルは十分にディできるが、ということです神経細胞のstinguish二つの主なプールは、すなわち、Sox3を発現する神経幹細胞プール及びMYT1発現する分化した神経細胞は、分化した神経細胞の異なる亜集団を明らかにする能力を欠きます。含む、しかし、一次運動ニューロン、介在ニューロン、及び感覚ニューロンに限定されるものではなく、そのようなサブ集団は、通常、それらの差次的に発現マーカー遺伝子28-30によって特徴付けられます。上記のように、 アフリカツメガエル胚における抗体ベースの免疫蛍光検出方法と組み合わせてin situハイブリダイゼーション多色の開発における最近の進歩は、潜在的な調査31分化したニューロンのこれらのサブ集団を明らかにするためにギャップを埋めることができます。あるいは、マウスモデルで実証されているように、また、アフリカツメガエルにおいて、異なる細胞集団を区別するために細胞型特異的抗体のより包括的なセットを高めることが望ましいであろう。 それはこのメソッドへの追加として、そのような多光子顕微鏡、3D再構成、およびセグメンテーションなどの光学イメージングおよび画像解析の最近の進歩は、また、 アフリカツメガエル卵母細胞のより包括的な観測を実現するだけでなく、ために初期評価の後に適用することができる、ことを言及も価値があります特に32,33を設定するライブ下の初期胚、。したがって、増殖、分化、および生きた動物における神経細胞の移動を追跡するためには、初期のアフリカツメガエルにおけるこのような細胞集団の生の観察を可能にするために細胞型特異的プロモーターによって駆動される蛍光タンパク質を保有一つ以上のトランスジェニック系統を確立することが望まれるであろう胚。 X.の確立tauGFPとそのアプリケーションを駆動する神経特異的βチューブリンプロモーターとツメガエルのラインが良い例23,34を提供してきました。脊椎動物35-37を特徴sox3とMYT1の両方の完全なプロモーター配列と、それはshのですアフリカツメガエルのコミュニティと一次神経形成研究のより一般的なフィールドの両方に広く貢献すべきであるアフリカツメガエルにおける追加のトランスジェニック系統を確立することは比較的容易であることウルド。

脊椎動物では、中枢神経系の開発は、いくつかの独特まだ連続した段階を含みます。最初のステップは、ナイーブ外胚葉細胞は、神経運命ではなく、表皮の運命に向かって指定されている神経誘導、です。いくつかの相互接続さ調節機構は、 アフリカツメガエルおよび他のモデル系1,2のこの段階の間に関与しています。このプロセスは、主に、コーディン、ノギンおよびフォリスタチン3-7として基本となる中胚葉によって産生される分泌因子によって調整されています。神経誘導した後、神経前駆細胞のサブセットは、細胞周期を終了し、一次神経新生と呼ばれるプロセスで分化し始めます。すべての神経前駆体は、この時点では区別されません。残りの神経前駆細胞は、それによって開発を通して、および成人期に中枢神経系の継続的な成長のために必要な幹細胞のプールを維持し、増殖し続けます。 これらの広報神経前駆細胞をoliferatingはSRY（性決定領域Y）-box 3（sox3）遺伝子8-11の発現によって特徴付けられます。細胞の他の集団、出口細胞周期および分化した運命にコミットするには、分化の遺伝子マーカー、 チューブリン、ベータ2BクラスのIIb（tubb2b、N- 浴槽 ）とミエリン転写因子1（MYT1）の発現により同定されます12-14。このような分化した神経細胞は、最終的には神経管15-17内の異なる領域に位置し、モーター、間、および感覚ニューロンを含むがこれらに限定され、ではないが、ニューロンの異なるカテゴリを生じます。 かなりの努力が前方神経外胚葉でイベントを決定するパターニングと運命を支配する調節機構を解明することに専念してきたが、あまり注目は、以下の発生神経性のイベントを調査してなされたものです初期のパターニング段階。実際に、シグナル伝達、転写の規制だけでなく、翻訳後修飾は、すべての神経新生18-20中の両方のタイミングおよび系統仕様を制御し、この後の段階に関与しています。これらのメカニズムへのさらなる調査が簡単に視覚化し、神経細胞の異なる集団を区別するために信頼性の高い方法を必要とします。 、Sox3、MYT1、及びN-タブを含む上記神経マーカーは、従って、神経分化21-23の基礎となるメカニズムを明らかにするために必要な基礎を提供し、これらの異なる細胞集団を同定するための手段を提供することができます。 神経細胞集団の特異的標識は、他のモデル生物で実証されているが、比較的少数の研究は、この点において最大限にアフリカツメガエル系を利用しています。これは主に、確実に、様々なneurを識別互換性のある抗体の不足に起因しています神経管でonal細胞集団。ここでは、 アフリカツメガエルにおける一次神経発生を調査するための堅牢かつ便利な手法を提供する免疫染色を介して初期のアフリカツメガエル胚で神経分化を可視化する方法について説明します。このプロトコルは、ステージ26とステージ45との間にアフリカツメガエルの中枢神経系の早期開発に興味を持って研究者のための十分な指針を与える必要があります。

<table><tbody><tr><td>ゲンタマイシン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>トリスHCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>冷水魚の皮からのゼラチン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>ベースモールド 使い捨て 15 mm x 15 mm x 5 mm スインポート</td><td>VWR</td><td>EMB-200-015A</td><td></td></tr><tr><td>ベースモールド 使い捨て 7 mm x 7 mm x 5 mm スインポート</td><td>VWR</td><td>EMB-200-010K</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト プラス スライド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ凍結培地 (OCT)</td><td>ライカ&nbsp;</td><td></td><td></td>14020108926</tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>グローブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;85-90度;C ヒートブロック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP ペン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>アセトン、分析グレード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライドラック</td><td></td><td></td><td></td>付き染色ジャー</tr><tr><td>適切なサイズのクリックロックフードボックス (1-2 6 ウェルプレートを内部に保持する能力があります)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗アセチル化チューブリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスIgG(H+L)、F(ab')2&nbsp;フラグメント(Alexa Fluor&reg;&nbsp;488 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG (H+L), F(ab')2&nbsp;フラグメント(Alexa Fluor&reg;&nbsp;555 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4413</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647 Phalloidin</td><td>Cell Signaling</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

でプライマリ神経発生を評価します<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚用いた免疫染色

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesisは、中枢神経系の初期レイアウトを設定する胚発生中の動的で複雑なプロセスです。この過程で、神経幹細胞の一部が分化し、新生中枢神経系内で分化した初代ニューロンの最初の集団が生じます。いくつかの脊椎動物モデル生物を用いて、神経細胞の運命指定、パターン化、分化のメカニズムを探っています。その中には、アフリカツメガエル(Xenopus)があり、その急速でアクセス可能な発達と発生学的および分子的操作の容易さにより、一次ニューロン新生に関与する分子および細胞メカニズムを調査するための強力なシステムを提供します。ここでは、Xenopus中枢神経系内の神経細胞のさまざまな集団を観察するための便利で迅速な方法を紹介します。Xenopusの胚切片に対する抗体染色と免疫蛍光法を用いて、初代神経新生における神経幹細胞と分化した初代ニューロンの位置を観察することができます。

代表的な結果は、異なる抗体（ 図4）で染色し、異なるレベル、すなわち前脳、中脳、後脳、脊髄、でステージ30 アフリカツメガエル胚の断面を示しています。前述したように、分化した初代神経細胞が外側に移動して、神経管の限界層（基底層）の近くに見つけMYT1標識ながら、神経前駆細胞集団は、神経管の内腔の近くに位置しSox3標識。抗アセチル - チューブリンは、全体の神経管の中に観察することができる分化したニューロンにおける軸索を、ラベルを付けます。 側特異的遺伝子のノックダウンまたは過剰発現は、特定の遺伝子の発現を調節する神経細胞の成長および分化を妨害するかどうかを評価するための神経生物学で広く使用される方法です。このような場合には、モルホリノ（MOS）またはDNA構築物（単数または複数）のいずれかのプロ搬送します<html> moter駆動型遺伝子は、2細胞期23における2つの割球の中に注入されます。あるいは、それらは、ノックダウンまたは過剰発現所望の遺伝子（単数または複数）27の結果となる電気穿孔に続く脳室に注入することができます。どちらの場合も、効果は、未処理の内部コントロールとして、胚の反対側を作り、胚の片側に制限さ​​れます。 固定、切片、および免疫染色した後、遺伝子ノックダウン/過剰発現の影響をカウントし、胚の両側に異なる集団の細胞数を比較することによって定量化されます。いくつかの胚からこれらのデータを蓄積し、統計分析を行うことができます。当社の代表的な結果では、何の摂動は、胚では行いませんでした。遺伝子摂動と異なる神経細胞集団に対する効果の例は、参考文献20,23に記載されています。 トン &quot;FO：キープtogether.withinページ=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> 図1：セクションの金型における胚の配置及び向き （A）取り付けアセンブリを示す漫画の描写は、トレイは、日付、ステージ、および胚の向きで標識されています注意してください。 （B）取り付けアセンブリの自然な外観を示すイメージ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> 図2：サンプルの保持ディスク上のゼラチンブロックの向きや位置 （A）節ブロックアセンブリを示す漫画の描写、胚は「ヘッドアップ」位置とゼラチンブロックがしっかりと固定されているOであることに注意してください。ベースで組織凍結培地による試料保持ディスクNTO（図2B参照）。 （B）節ブロックアセンブリの自然な外観を示す画像は、ゼラチンブロックと試料保持ディスクとの間の組織凍結培地の蓄積に注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> 図3：セクション室の連続切片 （A）のモデル。サンプル保持ディスクは、胚側が上を向いている位置に回転し、固定してください。数（6-10）のセクションの後、連続するセクションのタイルの長いストリップを穏やかに細かいブラシを使用してブレード（青）から分離され、その後、保持板上に90°回転しました。その後、室内温度正に帯電したスライドですしっかりと下に向けセクションストリップに押し付け、すぐに集め、完成ストリップまで上昇。 （b）に示すように、通常は、各スライドは、ストリップの2本の平行線を収容することができます。鉛筆を使用して、スライドラベルに詳細な記録を作成することを忘れないでください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> 図4：ステージ30 X のクロスセクション 神経組織、20Xにオタマジャクシと染色を ツメガエル 。 アフリカツメガエルのオタマジャクシのセクション平面の相対的な位置（前脳、中脳、後脳、脊髄）を示す（A）回路図。 （B）抗Sox3（赤）で染色した断面を対応する、抗アセチル化チューブリン（グリーn）とDAPI（青）、相対的な神経幹細胞プールの位置ならびに神経管内ニューロフィラメントを示します。神経管中で分化した初代ニューロンの相対的な位置を示す抗MYT1（赤）およびDAPI（青）で染色した断面を、対応する（C）。スケールバー=20μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

この記事では、切片で免疫蛍光染色を用いて、 アフリカツメガエル胚の中枢神経系における異なる神経細胞集団を可視化するための便利で迅速な方法を提示します。

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

この実験の全般的な目的は、発生中のゼノプスの胚脳において、異なる神経細胞集団を迅速かつ簡便に可視化することです。これらの手法は、ゼノプスの中枢神経系における神経分化の調節プロセスの観察など、一次神経発生の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、単一の実験内で、神経幹細胞前駆細胞プールと分化した一次神経プールを同時に観察できることです。この手順を開始するには、プラスチック製またはガラス製のピペットを用いて、気泡が入らないように注意しながら、ガラスバイアルから5〜10個の胚を慎重に吸引します。胚をマウントチャンバーに移し、実体顕微鏡下で観察します。セクションブロックの剛性を確保するため、マウントチャンバーをゼラチン溶液で満たします。次に、微細先端ピンセットを用いて、胚を横に並べます。極低温対応マーカーを使用し、チャンバーの縁に矢印を描いて頭部の向きを標記します。複数の胚グループがある場合は、対応するチャンバーの縁に各グループの説明を書き留めてください。次に、チャンバーをドライアイスが半分まで入った発泡スチロール製ボックスの中に慎重に水平に配置します。蓋を閉め、マウンティングチャンバーを1つずつ5～10分間凍結させます。その後、凍結切片作成に進むか、凍結サンプルを-80 °Cで少なくとも1～2週間保存しても、免疫原性は失われません。この手順では、鈍端のスティックまたは指でチャンバーの底を押し、凍結したサンプルブロックをチャンバーから取り出します。次に、サンプル保持ディスクに組織凍結剤を数滴滴下します。胚の前端が上を向くようにサンプルブロックを固定し、組織凍結剤が不透明になるまで、または約1分間、固定したブロックをクライオスタットチャンバー内に静置します。サンプルブロックの底面を上に向けた状態で、サンプル保持ディスクを直ちにミクロトームに取り付けます。サンプルブロックがまだ比較的柔らかいうちに、ブレードを用いて一部を切り落とします。その後、温度が平衡状態に達するまで、サンプル保持ディスクをミクロトーム上に少なくとも5分間放置します。その後、半透明のゼラチンの向こう側にオタマジャクシの頭部が見えるまで、サンプルブロックを徐々にトリミングします。トリミング速度を上げるには、セクションの厚みを大きくしてください。後続のセクションが長いストリップ状に生成されるよう、刃の鋭さや角度などのクライオスタットの性能を監視してください。オタマジャクシの頭部が見えてきたら、切り出した切片が帯状になり、重なったり刃に張り付いたりしないように、クライオスタットの設定を通常の状態に戻します。その後、オタマジャクシの頭部がほぼ露出するまでトリミングを続けます。サンプル切片の回収を開始する前に、ステージ上の残った切片をブラシで取り除いてください。約10〜15枚の連続切片を作成し、長い帯状にします。厚いカバーガラスプレートを横に倒し、細筆を用いて、ブレードから帯状の切片をそっと取り出します。次に、切片の長軸がブレードと平行になるようにステージ上に配置します。10〜15個のセクションを作成し、途切れることなく長い帯状にします。これは容易ではなく、練習が必要です。コツの一つは、ハンドホイールを回す速度を上げすぎないようにすることです。そうではなく、ハンドルを慎重に、ゆっくりと回してください。その後、室温の陽電荷スライドを1枚選び、鉛筆でラベルを記入します。次に、ラベルを貼った面を下に向けて、ストリップの上に素早くしっかりと押し当てます。続いて、クライオスタットのチャンバーからスライドを取り出します。この操作を繰り返し、各スライドに20〜30枚の切片を平行に並べます。側面を10分間風乾させた後、直ちに免疫染色の手順に進むか、免疫染色を行うまでスライドボックスに入れて-80°Cで最大3〜6ヶ月間保存します。ここでは、以降の画像の位置基準として使用する、ゼノプスのオタマジャクシの前脳、中脳、後脳、および脊髄の対応する断面平面を確認できます。Anti-Sox 3、Anti-Acetylated Tubulin、およびDAPIで染色した対応する横断面では、神経管内の神経幹細胞プールの相対的な位置とニューロフィラメントが示されています。そして、こちらはAnti-MyT1およびDAPIで染色した対応する横断面であり、神経管内の分化した一次ニューロンの相対的な位置が示されています。この手法を習得すれば、適切に行うことで2時間で完了させることができます。この手順を実施する際は、ドライアイス中でサンプルブロックを十分に冷却する時間を確保することが重要です。そうしないと、サンプルブロックが十分に硬くならず、切断が困難になる可能性があります。この手法の開発により、発生神経科学分野の研究者がゼノプスの中枢神経系における神経分化を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ゼノプスの中枢神経系の切片作成方法と、特定の神経細胞群を観察する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶ免疫蛍光染色法によるXenopus胚の一次神経発生評価技術。神経幹細胞と分化ニューロンを同時可視化し、約2時間で完了する迅速な手法で発生神経科学の研究に有用です。

でプライマリ神経発生を評価します

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