糖鎖ノード分析：グライコミクスへのボトムアップアプローチ

この手順の全体的な目標は、単糖類の組成と結合情報を保存しながら、生体サンプル中のすべての糖鎖を分解することです。シックなシアラリゼーションやN-アセチルグルコサミンの二分による単一の分析シグナルへの二等分など、興味深い糖鎖の特徴の蒸留を促進します。この方法は、特定の疾患状態においてどのようなユニークな糖鎖の特徴が変化するかなど、グリコマイトの分野における重要な問題に直接答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、β 1-6 の分岐やコルフルコスル化など、疾患で変化しやすい糖鎖の特徴が、複数の無傷の糖鎖に分散するのではなく、単一の分析シグナルに蒸留されることです。一般的に、個人はこの方法を行う必要がありますが、新たにパーメチル化された糖鎖の不適切な処理により、N-アセチルシステインの貧弱なyeildsと本当に苦労しています。まず、各生物学的分析物の9マイクロリットルを別々の1.5ミリリットルの試験管に移すことにより、サンプルを準備します。

各サンプルに、1マイクロリットルの脱イオン水と270マイクロリットルの高純度DMSOを追加します。そして、それらをボルテックスして激しく混ぜ合わせます。サンプル調製後、テキストプロトコルに記載されているように、水酸化ナトリウムを充填したスピンカラムを組み立てます。

分析用シリンジを使用して、各分析物に105マイクロリットルのヨードメタンを追加し、すぐにチューブにキャップをします。サンプルを徹底的にボルテックスします。前に準備したスピンカラムを抜き、2、400Gs.Afterで15秒間遠心分離しますリザーバーチューブと豊かなものを廃棄した後、カラムを再度差し込み、各分析物にラベル付けされたチューブの新鮮なセットの中に配置します。

1000マイクロリットルのパイプヘッドを使用して、各分析種溶液を対応するスピンカラムに移します。分析液を添加したら、200μLのパイプヘッド先端から約2ミリリットルを圧着し、先端をカラムに残して攪拌機として使用します。パイプヘッドの先端を使用して、2〜3分に一度カラムを静かに攪拌します。

11分後、カラムを抜き、2、400 Gs.Immediatelyで15秒間遠心分離機にスピンカラムを取り外し、新しいリザーバチューブに入れ、フロースルー溶液を節約しますが、プラグを廃棄します。カラムに、アセトネニトリルの300マイクロリットルを追加し、9、600 Gs.Nowでそれらを30秒遠心分離します最初のパーメチル化フロースルー溶液を、リン酸ナトリウム緩衝液の3.5ミリリットルを含むシラン化ガラス試験管に移します。転送されたスーパーナネッドが透明であり、固体材料が転送されていないことを確認してください。

プラスチックチューブの底に小さな白いペレットが形成されます。明らかな固体材料の移動は避けてください。これを怠ると、N-アセチルシステイン-グルコサミン糖鎖ノートの収量が低下します。

すべてのサンプルが転送されたら、バッチ内のすべてのサンプルをすぐにボルテックスします。次に、アセトンニトリルのフロースルー溶液を、それぞれの試験管内の残りの液体と混合します。繰り返しになりますが、このステップ中に固体の白い残留物を移さないでください。

次のサンプルに移動する直前に、結合した溶液にキャップをし、振とうし、ボルテックスします。過メチル化後、ドラフト内の各試験管に1.2ミリリットルのクロロホルムを追加します。次に、チューブにキャップをし、内容物を激しく混ぜます。

層を分けるためには、簡潔に3、000 Gs.Useで解決を遠心分離機にかけなさい上部の水層のほとんどを取除き、そして層の残りの約3ミリリットルを残して廃棄する牧草地の管の頭部。3.5ミリリットルの0.2モルリン酸ナトリウム緩衝液を加え、次に試験管にキャップをして混合し、遠心分離します。この液体/液体抽出ステップを合計3回実行します。

最終抽出に約1ミリリットルの水性層を残します。次に、清潔なシラン化牧草地パイプヘッドを使用して、テキストプロトコルで説明されているように、クロロホルム層を清潔でラベル付けされたシラン化ガラス試験管に慎重に移します。摂氏75度に設定された予熱された蒸発マニホールドで、窒素ガスの穏やかな流れの下でサンプルを乾燥させます。

ガスの流れが液体表面を乱すことを確認しますが、飛び散らないようにしてください。サンプルが乾燥すると、加水分解の準備が整います。各サンプルに325マイクロリットルの2モルトリフルオロ酢酸またはTFAを加え、よく混合します。

すべてのサンプルに添加した直後に各サンプルチューブをしっかりとキャップして、TFAの蒸発とその後の加熱ステップ中のサンプルの損失を防ぎます。サンプルを摂氏121度で2時間インキュベートし、糖鎖を加水分解します。サンプルをインキュベートしている間に、再び、摂氏75度で蒸発マニホールドを準備します。

インキュベーション後、蒸発マニホールド内の窒素の安定した流れの下でサンプルを乾燥させます。サンプルを頻繁にチェックして、可能な限り最小限の乾燥時間で乾燥していることを確認します。各サンプルに、1リットルあたり10グラムの水素化ホウ素ナトリウムを475マイクロリットル加えます。

次に、サンプルを十分に混合して残留物を溶解します。試験管にキャップをし、還元反応を1時間継続させます。次に、各サンプルに63マイクロリットルのメタノールを加えます。

サンプルを混合し、窒素下で摂氏75度で乾燥させます。各サンプルの酢酸溶液に125マイクロリットルのメタノールを加えます。サンプルを混合し、窒素下で摂氏75度で再度乾燥させます。

サンプルが完全に乾燥していることを確認するには、真空下に20分間置きます。乾燥後、各サンプルに18マイクロリットルの脱イオン水を加えます。次に、サンプルを短時間遠心分離し、よく混合して沈殿物を溶解します。

次に、各チューブに250マイクロリットルの無水酢酸を加えます。チューブにキャップをし、十分にボルテックスし、サンプルを水浴で2分間超音波処理して、残留物が完全に溶解することを確認します。次に、サンプルを摂氏50度で10分間インキュベートします。

次に、各サンプルに230マイクロリットルの濃縮TFAを追加します。サンプルをキャッピングして混合した後、内部温度50°Cで10分間インキュベートします。各サンプルに1.8ミリリットルのジクロロメタンを加え、よく混ぜます。

次に、チューブに2ミリリットルのディオン水を加え、液体/液体抽出を2回行います。ジクロロメタン層をシラン化した牧草地パイプヘッドで回復します。オートサンプラーバイアルに移し、サンプルを74°Cの窒素下で乾燥させます。

GC-MSの前に、サンプルをそれぞれ120マイクロリットルのアセトンで再構成し、キャッピングして完全に混合します。スプリットモードでは、オートサンプラーを使用して、各サンプルの1マイクロリットルをGCスプリットモードライナーに注入します。飛行時間型質量分析計では、毎分0.8ミリリットルの定流量モードで40とヘリウムガスの分割比が推奨されます。

摂氏325度に達する2段階の勾配を使用してサンプルを分析します。逃亡したサンプル成分を電子イオン化します。飛行時間質量分析装置では、Z 40 から 800 のフラグメント M を 0.1 秒のパルス合計速度で分析します。

このプロトコルの感度を実証するために、生物学的サンプルを慎重に処理しました。得られたクロマトグラムは、目的の製品ピーク間に適切な強度を与え、比較と分析を容易にします。次に、同じ開始生物学的サンプルを同じ手順で処理しました。

しかし、NAOHカラムを介して遠心されたパーメチル化溶液中の白色残留物は、液体/液体抽出のために後続の混合物に運ばれました。クロマトグラムは、同じ主要なサンプル製品のピーク強度の異なる比率を示しています。直接比較すると、その差は歴然としています。

セカンドクロマトグラムで 4 位結合した N-アセチルグルコサミンピークがはっきりとくぼんでいるのは、過メチル化と抽出が失敗したことの認識可能な特性です。このアプローチが病態における糖鎖組成の違いを検出することの有用性を理解するために、正常な血漿サンプルとがん患者の血漿サンプルから抽出されたイオンクロマトグラムを 2 結合マノスで正規化し、重ね合わせます。β 1-6の分岐や病気のシアラリゼーションなど、糖鎖特有の特徴の量的な違いは容易に明らかです。

このビデオを見れば、ボトムアップグライコミクスの糖鎖ノード解析の方法について十分に理解できるはずです。コーフルコシュレーション、シックシアラリゼーション、グリカンナイトの二分など、興味深い糖鎖の特徴を単一の分析シグナルに蒸留します。