Name: 全体のマウントその場でハイブリダイゼーション法モノアラガイstagnalis (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶLymnaea stagnalisの全体マウントその場でハイブリダイゼーション法。発生段階別の前処理と高速脱カプセル化で遺伝子発現パターンを可視化し、Evo-Devo研究に有用です。

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注：以下の手順は、Lの胚および幼生期にその場での実験で行うための我々の方法を概説しますステップはこれが単語&#39;注意&#39;で示され、すべての適切な安全手順が採用されるべき有害化学物質の使用を伴うstagnalis。有害化学物質のための代表的なMSDSシートへのリンクは、 補足ファイル1で提供されている。全ての試薬 ​​のためのレシピは、 補足ファイル2で提供されています。 脱カプセル化装置の1組立<ol><li>これを行うために、 図2Aに示すように、適切な長さにP1,000先端カットを使用して（1mmの内径3mmの外径を有する）シリコンチューブ20 mlの使い捨て注射器を接続します。 </li><li>反転大きなペトリ皿に、標準的な顕微鏡スライドをテープで固定します。 図に示すように、顕微鏡スライドに直接隣接したシリコンチューブをテープ60;図2Cおよび2D。 </li><li>顕微鏡スライド上に引っ張らガラス針を休ま、ゆっくりと針の先端がチューブの内径を横断道の約20％を突出するまで、シリコンチューブに挿入します（ 図2Cおよび2Dを参照）。針は、ペトリ皿に位置テープそれを下にしたら。 </li><li>シリコンチューブの自由端は、カプセル化を解除した材料を収集する別のペトリ皿に休息できるようにします。 </li></ol> 2.検体採取、固定化と脱カプセル化注：特に断りのない限り、すべてのステップは室温で実施されます。 <ol><li>慎重に水槽の壁から卵の文字列を集めます。これを行うには、基板から卵の文字列をこすり、水の外に浮遊卵の文字列を魚にプラスチック製の茶こしを使用するようにへらのように柔軟なプラスチックの平らな部分を使用します。 図に設けられたガイドを使用して、顕微鏡下で材料を舞台と並べ替え1。 </li><li>ペーパータオルの上に卵の文字列を配置し、フェザー級の鉗子を使用して卵塊に沿って縦切開を行います。卵の文字列のうち、卵カプセルをロールとフェザー級の鉗子を使用して、紙タオルの周りにそれらを押すことによって、各カプセルから可能なゼリーの材料の多くを削除します。 </li><li>フェザー級の鉗子を使用して、水道水5mlを含むペトリ皿に卵のカプセルを転送します。この皿に希望の発達段階の脱ゼリー状の卵カプセルを収集し続けます。そして、次のステップに進み、計画WMISH実験のためのすべての発達段階から十分なカプセルを収集します。 </li><li>より発展した幼虫を操作する場合は、固定する前に、それらをanaesthetize（5日は最初の切断（DPFC）と古いポスト）。 注：これは、 その場での染色パターンでの解釈が非常に困難にする契約から筋肉を防ぐことができます。 <ol><li>彼らはcapsuにまだある間（幼虫をリラックス固定前に30分間•6H 2 OのMgCl 2の2％w / vの溶液中でのレ）。 </li><li>まだ固定液中で彼らの卵カプセル内ながら、いくつかの幼虫を沈め、顕微鏡下での応答を監視することにより、30分後に緩和の程度を評価します。完全にリラックスした幼虫が応答しませんしながら、不完全にリラックスした幼虫は、自分の殻の中に収納されます。これらの幼虫が緩和されたら次のステップに進んでください。 </li></ol></li><li>卵カプセルの10倍の体積を提供する密封可能なチューブに広い口径のプラスチックピペットを用いて卵カプセルを転送する（ 例えば 、沈降カプセル1mlを10+ mlのチューブを必要とします）。 </li><li>チューブからできるだけ多くの液体として吸引し、定住卵カプセルの10倍の量である固定液の量と交換します。静かに各発達段階（ 図1を参照）のための適切な時間RTで固定剤で卵のカプセルを回転させます。 </li><li> DiscontinUE回転およびカプセルは、適切な廃棄容器に固定溶液をシンクし、吸引することができます。 </li><li>室温で5分間、0.1％のTween-20（PBTw）とリン酸緩衝生理食塩水で固定液を交換し、回転させることにより、卵カプセルを洗ってください。 PBTwを吸引し、二回繰り返します。 </li><li> 図2に示されている（詳細はセクション1を参照）装置を用いて、それらのカプセルから胚および幼生を削除します。最大20 mlシリンジにカプセルを描き、チューブを取り付け、その後に出て、チューブを通って、ガラス針を過ぎてカプセルを払拭コレクションの一品。 注：通常、すべてのカプセルの大部分（&gt; 90％）がデバイスを介して1つのパスのみを必要とする必要があります。多くの場合、カプセル膜が損傷しているが、胚および幼虫が破裂したカプセルの内部に残っています。単にシリンジにそれを描画し、再びそれを払拭することにより、この材料を再処理。 </li><li>マイクを使用して、1.5mlチューブにデカプセル化胚および幼生を収集ropipette（0 P20 - 3日齢幼虫、およびカットオフチップの先端を持つ古い幼虫のためのP200）。 注：この段階で行うことができるプロトコルで（数ヶ月までのための）ポーズ。これが必要な場合は、decapsuled材料は、（次のステップに進みます）保存のために1.5mlチューブに収集する必要があります。それ以外の場合は議定書3に、すぐに続けています。 </li><li>胚および幼虫がチューブの底に沈み、上清を吸引することを可能にします。 PBTwで33％エタノール（エタノール）と交換し、5放置 - 10分。 PBTw 66％エタノールおよび100％EtOHで繰り返します。室温で100％エタノールで二回幼虫を洗ってください。 100％EtOH中、-20℃で材料を保管してください。 </li><li> 10分 - 準備が継続する場合には、再水和物100％エタノールを除去し、PBTwで66％EtOHで置き換えることによって、サンプルは、5放置します。 10分 - 5放置、PBTwに33％EtOHで繰り返します。最後に、すべてのエタノールが除去されていることを確認するためにPBTwの3倍、5分間の洗浄で洗浄します。 </li></ol> 3.プロテイナーゼK、TEAとポストFiのxation 注：我々はすぐにタイムクリティカルなソリューションを交換するための最も効率的かつ穏やかな方法は、メッシュの床と小さなバスケットに次の手順を実行して見つけます。これらは自宅行うことができますが、我々はIntavis InSituPro -Vsi液体ハンドリングロボット（www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc）と互換性のあるバスケット（ミディアムサイズ）を使用します。このようなバスケットは、迅速かつ容易に交換溶液に順に12ウェル組織培養皿（TCD）のウェルの間で移動させることができ、または溶液を十分にピペットを使用してから吸引することができます。代わりに、すべてのソリューション交換は、単に幼虫からの上清を吸引することにより、これらのバスケットなく行うことができます。この場合、穏やかな旋回運動は、上清をウエルの縁部から除去されることを可能にする皿の中央にすべての胚および幼虫を集中します。以下は、ユーザーがソリューション交換のバスケットを採用されている前提としています。 <ol><li>ピペットを使用して、PBTwの2ミリリットルで12ウェルTCDに座ってバスケットに胚および幼虫を移します。 注：追加された発達段階に依存することができ胚および/ ​​または幼虫の数は、しかし、一般的な経験則は、胚/幼虫（ すなわちの空き床面積の少なくとも25％を維持することで、研究されている、しないでください）バスケットを混雑。 </li><li>適切なプロテイナーゼK溶液2ml（ 図1を参照）、および0.2％グリシンの2ミリリットルそれぞれに別の2つのウェルとよく隣接を準備します。よくプロテイナーゼKの適切な濃度を含む、すぐに開始タイミングに各バスケットを移動します。 </li><li> 10分後も含む0.2％グリシンに各バスケットを移動し、5分間インキュベートします。その後、0.2％グリシンを有する第2のウェルに各バスケットを移動し、5分間インキュベートします。 3ミリリットルPBTwの3×5分間の交流とグリシンを洗浄します。 </li><li> PBTw溶液を除去し、新たに調製したトリエタノールアミン（TEA）で1回のサンプルを扱うゾル5分間の注意のためのution！撹拌しないでください。 5分間の新たに調製したTEA溶液3mlと交換してください。攪拌しないでください。サンプルからのTEA溶液の大部分を吸引します。新たに調製された無水酢酸とトリエタノールアミン（TEAAA）ソリューションを追加し、5分間インキュベートする。 注意！撹拌しないでください。 </li><li> OPTIONAL - 上記の手順をインキュベートしている間、TEAAA液の別の新鮮なバッチを準備し、上記の手順を繰り返します。 注：TEAAAでのこの第二の処理はオプションですが、完全にバックグラウンドを生成する傾向がプローブとすべてのバックグラウンドを除去するために役立つことがあります。 </li><li>井戸からそれを吸引することによってTEAAA溶液を除去し、PBTwの3ミリリットルと交換してください。攪拌しないでください。 PBTwを削除し、PBTw 3.7％ホルムアルデヒドの3ミリリットルを適用します。ゆっくり30分のインキュベーションの間、時折渦巻きます。 </li><li>井戸からそれを吸引することにより固定液を取り出して、PBTwの3ミリリットルと交換してください。 1.5mlチューブに材料を移します。 Rハイブリダイゼーション緩衝液でPBTwをeplaceし、室温で5分間インキュベートする - 注意。 </li><li> RTでホットブロックにチューブを配置し、所望のハイブリダイゼーション温度に温度を設定。 注：ハイブリダイゼーション温度は、特定のプローブ、経験的に最適化する必要がある、しかし、我々は55°Cが最初に裁判に良好な温度であることがわかりました。ブロックは、ハイブリダイゼーション温度に来て、サンプルを約15分間プレハイブリダイズすることを可能にすることを可能にする（ すなわち、それがより長い、リボプローブを作製するのにかかる時間は必要ありません）。希釈されたリボプローブの十分な容量（通常100μl）を準備します。我々は最初の範囲として100および500 ng / mlでの、典型的には裁判プローブ濃度。私たちは12に従ってリボプローブを準備します。 </li><li>サンプルからのハイブリダイゼーション緩衝液を除去し、サンプルにハイブリダイゼーションバッファーにプローブを追加します。 100μlの（またはハイブリダイゼーションブフェ上記相を形成するのに十分な容量を持つオーバーレイR）鉱油。 注：鉱油は長いハイブリダイゼーション工程の間に形成する大規模な凝縮を防ぎます。豊富な結露を大幅にハイブリダイゼーション溶液の化学的性質およびプローブの濃度の両方が変更されます。 </li><li>所望のハイブリダイゼーション温度に熱を減らすその後、10分間75℃にサンプルを加熱することにより、プローブと標的RNAを変性させます。 （ - 48〜24時間）ハイブリダイゼーションは12時間（O / N）以上の最小のために進行させます。 </li><li>ハイブリダイゼーションの間に、ヒートブロックから単一の管を除去する油相を乱すことなく幼虫を中断し、親指と人差し指の間で急速にそれを回転させて、ヒートブロックでそれを交換してください。 12時間かそこら - この回6を繰り返します。 </li></ol> 4.ホットウォッシュと免疫注：私たちは、次の手順のために液体処理ロボットを使用していますが、これらも簡単に手動で行うことができます。この場合には、胚および幼生の笙それらがでハイブリダイズした1.5​​ミリリットルチューブ内に保持することULD。後続のすべてのソリューションの交換がP1,000ピペットで吸引し、追加されます。手動で行う場合は、次のステップの各々は、各溶液1mlを採用すべきです。 <ol><li> 4倍、2倍とハイブリダイゼーション温度に1×洗浄溶液の熱十分なボリューム（3ミリリットル各サンプルについて、それぞれ）。 </li><li>ハイブリダイゼーション温度で15分間ずつ、すべてのサンプルを4倍洗浄バッファーで3回洗浄します。ハイブリダイゼーション温度で15分間ずつ、すべてのサンプルを2回洗浄緩衝液で3回洗浄します。ハイブリダイゼーション温度で15分間ずつ、すべてのサンプルを1×洗浄バッファーで3回洗浄します。 </li><li>ハイブリダイゼーション温度で1×塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム緩衝液+ 0.1％のTween（SSC + 0.1％のTween）で1回、すべてのサンプルを洗います。サンプルは室温まで冷却します。 </li><li> wはMABを繰り返しマレイン酸バッファー（MAB）この1×SSC溶液を交換して15分間、1×SSC + 0.1％Tween中で二度全てのサンプルを洗浄し、10分間放置灰。ブロック溶液でMABを交換し、1.5時間インキュベートします。 </li><li>抗体溶液（1：ブロック溶液中の抗体の10,000希釈）のブロックソリューションを交換し、穏やかに攪拌しながら室温で12時間（O / N）インキュベートします。 </li></ol> 5.色の開発と取り付け<ol><li>抗体溶液を吸引し、10分ごとにPBTwで15回洗浄します。 1xのアルカリホスファターゼバッファー（AP）とPBTwを交換し、10分間インキュベートします。 </li><li>注意-上記のインキュベーション工程が進行は、AP染色溶液を調製しながら（ 補助ファイル2を参照）。よくTCDに材料を移し、AP染色液で1×APソリューションを交換してください。時間の長さは、呈色反応を記録することができるために起こるようになりました時間に注意してください。シグナル対バックグラウンド比が最適になるまで染色パターンの開発を監視します。 </li><li>発色を停止するには、適切なワストに処分（1×AP染色溶液を除去電子コンテナ）、およびPBTwの2ミリリットルを適用し、現在の時間に注意してください。 5分間ずつ二回以上PBTwですすいでください。 1.5mlチューブに材料を転送するために、これらのリンスのいずれかを使用します。 </li><li> （これはまた、O / Nを行うことができます）PBTwを外し、PBTwで3.7％ホルムアルデヒドの1ミリリットルを適用し、攪拌または室温で少なくとも30分間回転させます。 </li><li> （適切な廃棄容器に廃棄物の固定剤を廃棄）PBTの3回の洗浄で固定液を洗浄します。脱イオン水に50℃でサンプルを3回洗浄します。 注：これらの洗浄は、清算および可視化工程の間に見えるようになるかもしれ塩の沈殿をなくします。 </li><li>ベンジルアルコール（BB：またマレーの明確なとして知られているBA）またはグリセロールサンプルは安息香酸ベンジルでマウントする必要があるかどうかを決定します。 注：私たちは、より強力な浄化剤BBを好む：L.としてBA stagnalis胚はやや不透明です。 BBに搭載されるサンプルは：BAは最初のエタノール系列で脱水する必要があります。試料は、60％に搭載されますグリセロールは、直ちに実装することができます。 </li><li>ピペットを用いて：マウントソリューション（BAまたは60％グリセロールBB）にサンプルを移します。 注：BBにマウントする場合：BAこれはよくガラスに（BBを：BAはポリカーボネートプラスチックを溶融する）行わなければなりません。 </li><li> 10分、その後、スペーサーとして積み重ねられたカバースリップの適切な数（サンプル&lt;1 DPFC、サンプル用の2カバースリップ&gt; 1 DPFC 1カバーガラス）を使用して、スライド上にそれらをマウントする - サンプルは5のためにクリアすることができます。 注記：全マウントは現在DIC光学系を有する化合物の顕微鏡を使用して画像化することができます。 </li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

ここで説明する方法はモノアラガイstagnalisのすべての発達段階内で、おそらく様々な発現レベルを有するRNA転写物の効率的な可視化を可能にする。そのカプセルから胚および幼生を削除するには、我々は他のencapsulated-に対して報告化学物質、浸透圧ショックおよび物理的処理の様々な試用しましたモデル生物を開発。しかし、私たちの手の中に私たちがここで説明する方法は、胚および幼虫に損傷を与えることなく、タフな莢膜を除去するだけで高スループット技術です。デカプセル化後、材料は、いずれかの保存することができ、またはプロテイナーゼKのステージ特異的レジメンで処理した後、リボプローブとハイブリダイズさせました。 （典型的には、プローブ濃度及びハイブリダイゼーション温度に焦点を当てた）追加の経験的な最適化の努力は、各プローブ/標的のために必要となる場合があります。 （固定レジメンおよびプロテイナーゼK処理に加えて）これらのパラメータは、一般的に最も影響力のパラメータでありますその場での実験で 、任意の（固定された材料の品質およびRNAプローブは、高い水準であることを仮定して...

軟体​​動物は、科学分野の幅広い多様性の持分を保有動物の群です。その形態的多様性1、（種数2の点で第のみ節足動物への）種の豊かさや商業3、医学4及び科学的問題5-8の広い範囲との関連性にもかかわらず、に主張することができ、比較的少数の軟体動物の種があります設備の整った科学的なモデルと実験室環境で維持しやすいの両方です。多くのそのような神経生物学9、生態毒性10、より最近では進化生物学11,12などの分野で使用されている一つの軟体動物は、主に、その広範な分布およびメンテナンスの極度の容易さのため、モノアラガイのstagnalisです。 「モデル」生物としての人気とLに利用できる発達生物学者13-19、分子ツールの範囲とパワーによる使用の長い歴史にもかかわらず、 stagnALIS科学コミュニティは、はるかに多くの伝統的な動物モデル（ ショウジョウバエ 、マウス、ウニ、線虫）の背後にあります。 分子モデルとしてモノアラガイを開発することが私たちの願いは、シェル形成を誘導する分子機構への関心から生じます。これはモノアラガイの発達中の遺伝子発現の、効率的で一貫性のある敏感な可視化を可能にする技術のセットを絞り込むために私たちの動機。 in situハイブリダイゼーションホールマウント（WMISH）が広くモデル生物のさまざまな使用され、40年以上20のために使用されてきました。その異なる装いで、ISHは空間的に染色体、リボソームRNA、mRNAおよびマイクロRNAは上の特定の遺伝子座をローカライズするために使用することができます。 私たちは前L.ためWMISH方法を精緻化に対処するために必要な課題の一つstagnalisは静かにかつ効率的に抽出する胚およびトンから様々な段階の幼虫の問題でした彼それらが積層された卵のカプセル。この抽出、または「脱カプセル化」は、同時に形態学的および細胞の完全性を維持しながら、 その場での実験で与えられるために十分な材料を収集するために効率的に達成する必要があります。他のモデル生物はまた、カプセル化された開発を受けている間、我々の手でこれらの種について報告された方法のいずれもが正常L.において使用することができませんでしたstagnalis。 この方法の全体的な目標は、したがって、次のとおりです。L.を抽出するために、イメージングのための十分なWMISHsignalsで胚および幼虫を準備するために、WMISH信号を最適化するプレハイブリダイゼーション処理を適用するために、ハイスループット様式でそのカプセルから胚および幼生をstagnalis。

<table><tbody><tr><td>フェザー級鉗子</td><td>Ehlert&パートナー</td><td>#4181119</td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ</td><td>グラスガー&auml;tebau OCHS GmbH</td><td>760070</td><td></td></tr>ガラス<tr><td>毛細血管</td><td>ヒルゲンベルグ</td><td>1403547</td><td></td></tr><tr><td>12ウェル組織培養皿</td>カール<td>ロス</td><td>CE55.1</td><td></td></tr><tr><td>37%ホルムアルデヒド</td><td>カールロス</td><td>P733.1</td><td>注意-癌を引き起こす可能性があります。吸入、皮膚との接触、飲み込むと有毒です。有毒:吸入、皮膚との接触、および飲み込んだ場合、非常に深刻な不可逆的な影響の危険性。</td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸</td><td>カールロス</td><td>CN06.3</td><td>注意 - 目の刺激を引き起こします。気道や皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。ほこりを吸い込まないようにしてください。目、皮膚、衣服との接触を避けてください。適切な換気がある場合にのみ使用</td></tr>してください <tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Carl Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.1</td><td>注意 - 吸入すると有害な場合があります。気道の炎症を引き起こす可能性があります。皮膚から吸収されると有害な場合があります。皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。目の炎症を引き起こす可能性があります。飲み込むと有害な場合があります。</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>カールロス</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>フィコールタイプ 400</td><td>カールロス</td><td>CN90.1</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン K30 (MW 40)</td><td>カールロス</td><td>4607.1</td><td>注意 - 吸入すると有害である可能性があります。気道の炎症を引き起こす可能性があります。皮膚から吸収されると有害な場合があります。皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。目の炎症を引き起こす可能性があります。飲み込むと有害な場合があります。</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー牛血清アルブミン</td><td>カールロス</td><td>8895.1</td><td></td></tr><tr><td>サーモン精子</td><td>カールロス</td><td>5434.2</td><td></td></tr>ヘ<tr><td>パリン</td><td>カールロス</td><td>7692.1</td><td>注意-副作用には出血、局所刺激が含まれます。吸入、摂取、接触した場合のアレルギー反応の可能性。目/皮膚/気道を刺激する。過敏症の可能性があります。妊娠中は死産のリスクを高めると報告されています</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ-K</td><td>カールロス</td><td>7528.1</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>カールロス</td><td>3790.2</td><td></td></tr><tr><td>脱イオンホルムアミド</td><td>カールロス</td><td>P040.1</td><td>注意 - 目や肌に刺激を与えます。吸入、皮膚との接触、飲み込むと有害な場合があります。胎児に害を及ぼす可能性があります。吸湿性。</td></tr><tr><td>標準ホルムアミド</td><td>カールロス</td><td>6749.3</td><td>注意 - 目や皮膚に刺激を与えます。吸入、皮膚との接触、飲み込むと有害な場合があります。胎児に害を及ぼす可能性があります。吸湿性。</td></tr><tr><td>トリエタノールアミン</td><td>カール・ロス</td><td>6300.1</td><td>注意 - 蒸気やミストの吸入は避けてください。目に入らないようにしてください。皮膚との長時間または繰り返しの接触を避けてください。取り扱い後はよく洗ってください。</td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>カールロス</td><td>4483.1</td><td>注意 - 重度の皮膚と目の火傷を引き起こします。水と激しく反応します。飲み込むと有害です。目や気道を刺激する蒸気</td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td>カールロス</td><td>K304.2</td><td>注意 - 目に入った場合(刺激性)、摂取した場合、非常に危険です。皮膚接触(刺激性)、吸入(肺刺激性)の場合に危険です。皮膚に接触した場合には少し危険です(透過器)。目や皮膚に腐食性があります。</td></tr><tr><td>安息香酸ベンジル</td><td>シグマ</td><td>B6630-250ML</td><td>注意-吸入すると有害な場合があります。気道の炎症を引き起こす可能性があります。皮膚から吸収されると有害な場合があります。皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。目の炎症を引き起こす可能性があります。飲み込むと有害です。</td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>Sigma</td><td>10,800-6</td><td>注意 - 飲み込むと有害です。吸入すると有害です。深刻な眼の炎症を引き起こします。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>カールロス</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキングパウダー</td><td>ロシュ</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>アンチDIGファブフラグメントAP共役ロ</td><td>シュ</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>トリスHCl</td><td>カールロス</td><td>9090.3</td><td></td></tr>ジ<tr><td>メチルホルムアミド中の4-ニトロブルーテトラゾリウムクロリド&nbsp;</td><td>Carl Roth</td><td>4421.3</td><td>注意 - 胎児に害を及ぼす可能性があります。吸入や皮膚との接触により有害です。目に刺激を与えます。</td></tr><tr><td>5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸</td><td>カール</td>ロス<td>A155.3</td><td>注意-摂取すると潜在的に有害です。皮膚、目、衣服に付着しないでください。皮膚や目を刺激する可能性のあるもの&nbsp;</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>カールロス</td><td>4126.1</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>カールロス</td><td>6908.1</td><td>注意 - 目や皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。呼吸器や消化管の炎症を引き起こす可能性があります。この材料の毒物学的特性は十分に調査されていません。</td></tr><tr><td>テルジトール</td><td>シグマ</td><td>NP40S</td><td>注意 - 吸入すると有害である可能性があります。気道の炎症を引き起こす可能性があります。皮膚から吸収されると有害な場合があります。皮膚の炎症を引き起こす可能性があります。目の炎症を引き起こす可能性があります。飲み込むと有害な場合があります。</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>カールロス</td><td>CN30.3</td><td>注意-飲み込むと有害です。皮膚に接触すると有毒です。皮膚の炎症を引き起こします。重篤な眼の損傷を引き起こします。呼吸器への刺激を引き起こす可能性があります。</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>カールロス</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二ナトリウム水素二水和物(Na2HPO4&#8226;2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>4984.1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム (KH2PO4)</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>三クエン酸ナトリウム二水和物 (C6H5Na3O7&#8226;2H2O)</td><td>Carl Roth</td><td>3580.1</td><td>注意 - 目、皮膚、気道の炎症を引き起こす可能性があります。この材料の毒物学的特性は十分に調査されていません。</td></tr><tr><td>鉱物油&nbsp;</td><td>カール・ロス</td><td>HP50.2</td><td></td></tr><tr><td>InSituPro-VSI&nbsp;</td><td>インタヴィス</td><td></td><td>www.intavis.de/products/automated-ish-and-ihc</td></tr></tbody></table>

全体のマウント<em&gt;その場で</em腹足類軟体動物のための&gt;ハイブリダイゼーション法<em&gt;モノアラガイstagnalis</em

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

in situハイブリダイゼーション（WMISH） で全体のマウント興味のある（例えば、胚または幼虫など）「ホールマウント」組織標本、または発達段階内の核酸分子（多くの場合のmRNA）の空間分解能を可能にする技術です。それはかなり複雑な後生動物ゲノムの機能解析、次世代シーケンスデータの大洪水でボトルネックをより多くなってきている課題に貢献することができるので、WMISHは非常に強力です。技術に多くの時間の概​​念シンプルさにもかかわらず、多くの場合、新たなモデル系のためのWMISH実験に固有の様々なパラメータを最適化するために必要とされます。組織型と発達段階の間の細胞および生化学的特性の微妙な違いは、単一WMISH方法がすべての状況に適切ではないかもしれないことを意味します。我々は一貫生成し、再新興腹足類モデルモノアラガイのstagnalisためWMISHメソッドのセットを開発しています遺伝子の、およびすべての発達段階全体の範囲について明確なWMISH信号。これらの方法は、個体発生のウィンドウに未知の暦年齢の幼虫の割り当て、それらの卵のカプセルからの胚および幼生の効率的な除去、各個体発生のウィンドウのための適切なプロテイナーゼK処理の適用、およびハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション後および免疫検出、ステップ。これらのメソッドは、指定されたRNA転写物について得られた信号は、プローブ固有の調整（主にプローブ濃度及びハイブリダイゼーション温度）でさらに洗練することができ、そこから基盤を提供します。

図3に示される代表的なWMISH染色パターンは、上述の技術を用いて生成され、分子のシェルの形成に至るまでの処理（ 新規遺伝子1、2、3、4）の範囲に関与する遺伝子のための空間的な発現パターンの多様性を反映し、細胞間シグナル伝達（DPP）への発達段階の範囲にわたって転写調節（ ブラキュリ ）へ。一方で我々は、我々の方法は、様々なレベルでの開発のすべての段階で発現した遺伝子産物の幅広いに対して適用できることを示し、我々は、彼らがまた大きく変わるだろうと期待して、これらの遺伝子の発現レベルを定量化していません。のみここに提示する遺伝子（DPP）の一方が先にLに記載されていますstagnalis 21,22。ここで提示する結果は、主にこれらの以前の報告と一致しているが、有意に高い空間RESOと<html>リューション。 短尾の空間的な発現パターンはアワビ23と...

このプロトコルの目標は、Lymnaea stagnalisの胚と幼虫のハイスループットなカプセル化解除のための一連の方法をユーザーに提供することです。これは、全体のマウントin situハイブリダイゼーションの準備、およびその後のハイブリダイゼーション前およびハイブリダイゼーション後の処理のためのものです。

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

本プロトコルの総合的な目的は、淡水産腹足類 Lymnaea stagnalis の胚および幼生のホールマウントにおいて、個々の遺伝子の空間的発現パターンを効率的に可視化することである。この手法は、遺伝子がいつどこで発現し、互いにどのように相互作用し、どのような機能を持つかといった、進化発生生物学（Evo-Devo）および発生生物学における重要な疑問を解決するのに役立つ。本手法の主な利点は、卵嚢から胚および幼生の試料を取り出す操作が、迅速かつ簡便で効果的であることである。その後、この材料を補足資料で提供している発生ロードマップに従って分類し、ステージ特異的な前ハイブリダイゼーション工程で処理します。この手順を開始するには、20 mLの使い捨てシリンジをシリコンチューブに接続します。次に、標準的な顕微鏡スライドを、大きな転倒させたペトリ皿にテープで固定します。次に、シリコンチューブを顕微鏡スライドのすぐ隣にテープで固定します。その後、引き伸ばしたガラス針を顕微鏡スライド上に配置します。そして、針の先端がチューブの内径の約20%突出するまで、シリコンチューブの中にゆっくりと挿入します。針を所定の位置に配置したら、シャーレにテープで固定します。シリコンチューブの自由端を、脱殻した物質を回収するための別のシャーレの中に置きます。水槽の壁面から卵株を回収する場合は、平らで柔軟なプラスチック片をスパチュラとして使用し、基質から卵株を掻き取ります。次に、プラスチック製のティーストレーナーを使用して、水面に浮いている卵塊をすくい上げます。その後、本ガイドに従い、顕微鏡下で材料のステージングと選別を行います。卵塊をペーパータオルの上に置き、フェザーウェイト鉗子を用いて卵塊に沿って縦方向に切開します。次に、卵ストレーナーから卵嚢を転がして出し、ペーパータオル上で卵嚢を動かして、各卵嚢からゼリー状物質を可能な限り除去します。続いて、フェザーウェイト鉗子を用いて、卵嚢を5 millilitersの水道水が入ったペトリ皿に移します。目的の発生段階にある脱ゼリー卵嚢を、引き続きこの皿に回収します。次のステップに進む前に、計画しているWMISH実験に十分な量のすべての発生段階のカプセルを回収します。次に、初回卵割後5日以上の幼生を、固定前に2%重量対容量溶液の塩化マグネシウム六水和物で30分間弛緩させます。30分後、卵カプセルに入ったままの数匹の幼生を固定液に浸し、顕微鏡下で反応を観察して弛緩度を確認します。不十分に弛緩した幼生は殻の中に引っ込みますが、完全に弛緩した幼生は反応しません。幼生が弛緩したら、広口のプラスチックピペットを用いて卵嚢を、卵嚢の体積の10倍の容量がある密封チューブに移します。次に、チューブから可能な限り液体を吸引し、沈殿した卵莢の10倍の量の固定液に置換します。各発生段階に応じた適切な時間、室温で卵莢を固定液中で緩やかに回転させます。その後、回転を停止し、卵莢を沈殿させます。固定液を適切な廃棄容器に吸引除去します。固定液をPBTwに交換し、室温で5分間回転させて卵嚢を洗浄します。PBTwを吸引し、さらに2回洗浄します。その後、装置を用いて胚と幼生をカプセルから取り出します。カプセルを20-milliliterシリンジに吸い込みます。次に、シリンジをチューブに取り付けます。チューブとガラス針を通して、カプセルを回収皿の中に押し出します。その後、マイクロピペットを使用して、脱カプセル化した胚と幼生を1.5-milliliterチューブに回収します。その後、固定した試料を脱水して保存するか、あるいはProteinase K処理、TEA処理、および後固定のステップを行います。これらのステップが完了したら、試料を短時間プレハイブリダイズさせ、リボプローブを添加します。Lymnaea stagnalisを用いたin situ実験の最終結果において、適切なPro K処理を行うことは極めて重要です。これは、0から500 µg/mLまで、発生段階に応じて必要となるPro K濃度の幅広い範囲に反映されています。ハイブリダイゼーションの間、ヒートブロックからチューブを1本取り出します。オイル相を乱さないように、親指と人差し指の間で素早く回転させて幼虫を懸濁させ、再びヒートブロックに戻します。この手順を6〜12時間ごとに1回繰り返します。ここに示した遺伝子発現パターンは、さまざまな発達段階の幼虫を用いて作成されました。また、すべてのサンプルはMurray's Clearを用いて封入し、撮像しました。各画像の右上に概算の日齢を示しています。視野の方向は右下に、遺伝子のオーソロギーは左下に示されています。これらの結果は、殻の形成から転写、細胞間シグナリングに至るまで、さまざまな分子プロセスに関与する遺伝子の発現パターンを示しています。いずれの場合においても、特有かつ明瞭な細胞染色パターンが観察され、その結果は1つの実験内の個々の幼虫間で非常に一致しており、実験間での再現性も非常に高い。この手法に習熟すれば、実作業時間は2日未満で済む。時間の大部分は、ハイブリダイゼーションのための胚および幼虫材料の回収と調製、および結果の画像取得に費やされる。本手順を実施する際は、ハイブリダイゼーション温度、プローブ濃度、ハイブリダイゼーション時間などの重要なパラメータについて、リボプローブごとに微調整が必要になる可能性が高いことに留意してください。本手法の開発により、以前のトランスクリプトームおよびプロテオームスクリーニングで同定された、殻形成に関与する一連の遺伝子を適切に特性評価することが可能となりました。

a-whole-mount-situ-hybridization-method-for-gastropod-mollusc-lymnaea

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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