Name: 初期の飢餓応答でCoronin Aの機能を調査細胞性粘菌凝集アッセイによって (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学ぶ細胞性粘菌Dictyostelium discoideumにおけるCoronin A依存性の初期飢餓応答と凝集アッセイ法。この手法は発生シグナル伝達経路の同定と多細胞化の初期段階の研究に有用です。

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私たちは、菌株と試薬を提供してくださったDictyostelium Stock Centerに感謝します。この研究は、スイス国立科学財団とバーゼル州からの助成金によって資金提供されました。

<ol><li>タイムラプス顕微鏡による細胞性粘菌の早期の飢餓応答を観察します。 <ol><li> 5グラムプロテオースペプトン、5グラムthiotone Eペプトン、10gのグルコース、5gの酵母エキス、0.35グラムHPO 4 2のNa：DH1.10細胞またはHL-5培地（1L用を含むエルレンマイヤーフラスコ中のコーラ欠損細胞成長* 7H 2 O、0.35グラムのKH 160回転の回転に振盪インキュベーターで22℃で2 PO 4、0.05グラムジヒドロ-硫酸塩、pHは6.6）。 0.01×10 6細胞/ mlおよび2×10 6細胞/ mlの密度で細胞を保管してください。 </li><li>収穫対数期に成長しているDH1.10セル21または22℃でのHL-5培地で振とう培養で増殖させたコーラ欠損細胞DH1.10のバックグラウンドで生成された10、によって、細胞凝集を調べます。これを行うには、400×gで3分間、細胞（通常10〜50 ml）を、遠心分離の適切な量を取り、BSS（10mMの塩化ナトリウム、10mMのKClの中で細胞を2回洗浄、2.5 mMのCaCl 2を、pHは6.5）。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を数えます。続いて、（5、10、20、または40）の密度でプレートの細胞を24ウェルプレートに10 4細胞/ cm×2。彼らはBSSに22℃で1時間接着させます。 </li><li> 10前に説明したように、画像ごとに135秒を取って、タイムラプス顕微鏡により凝集を視覚化します。設定5Xの客観的かつ適切なソフトウェアによって自動化された電子増倍電荷結合素子カメラを搭載したライブセルイメージングを使用して（ 材料表を参照してください）。 </li></ol></li><li>飢餓時の細胞性粘菌細胞のcAMPのパルス化。 <ol><li>外部から細胞を採取することにより、DH1.10細胞21またはDH1.10 コーラ欠損細胞10の開発にcAMPのパルスを適用の効果を調べます。これを行うには、400×gで3分間、適切な細胞の量（通常10〜50ミリリットル）、遠心分離機を取り、BSSで二回洗います。 </li><li> COUNT血球計数器を用いて細胞やBSSで1×10 7細胞/ mlの密度に細胞を再懸濁します。パルスを印加する前に、2時間22℃で培養（160 rpm）を振ります。タイマー制御蠕動ポンプを使用したcAMPのパルスを追加します。 5時間かけて5秒パルスに50 nMでのcAMP（最終濃度）の15μlのあらゆる6.5分を提供するためにポンプをプログラムします。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を数えます。続いて、（5、10、20、または40）の密度で細胞をプレート24ウェルプレートに10 4細胞/ cm×2。 BSSで1時間接着させます。 </li><li> 5Xの対物レンズを使用して明視野顕微鏡による22℃で16時間後に凝集を視覚化します。 </li></ol></li><li>馴化培地への暴露による細胞性粘菌開発の誘導。 <ol><li> 22に記載されているように 、新鮮な馴化培地を準備します。カルトを振ってから、対数期DH1.10細胞21またはDH1.10 コーラ欠損細胞10を収集400×gで3分間、ピペット、遠心分離器を用いて22℃でHL-5培地でURESとPBMで細胞を3回洗浄し（0.02 Mリン酸カリウム、10μMのCaCl 2、1mMのMgCl 2、pHは6.1）。 </li><li>血球計数器を用いて細胞をカウントし、mlの1×10 7細胞/の密度でPBMでこれらを再懸濁し、110回転数/ 22℃で20時間振とうします。 </li><li> 3分間400×gで遠心分離後、馴化培地を収集し、4℃で15分間8000×gで遠心分離することにより明らかにしました。 </li><li> 0.45μmフィルターを通してフィルター条件培地は、（ 材料表を参照）、PBMで3倍に希釈します。 </li><li> （5、10、20、または40）の密度で血球計およびプレートを用いて細胞をカウントし、24ウェルプレートに10 4細胞/ cm×2。彼らは22℃で1時間接着させます。 </li><li>先に調製した馴化培地を用いた細胞の交換上清。 </li><li>集約aを可視化5Xの対物レンズを使用して明視野顕微鏡によるFTER 16時間。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Weijer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenetic+cell+movement+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenetic cell movement in Dictyostelium.</a> Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).</li>
<li>Devreotes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum%3A+a+model+system+for+cell-cell+interactions+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development.</a> Science. 245, 1054-1058 (1989).</li>
<li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signal+transduction+pathways+regulating+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum.</a> Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).</li>
<li>Clarke, M., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+and+CMF%2C+autocrine+factors+that+regulate+gene+expression+during+growth+and+early+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium.</a> Experientia. 51, 1124-1134 (1995).</li>
<li>Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aggregation+in+Dictyostelium+discoideum+by+an+External+Periodic+Pulse+of+Cyclic+Adenosine+Monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate.</a> Science. 175, 333-335 (1972).</li>
<li>Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cyclic+AMP+in+Dictyostelium+discoideum+and+Polysphondylium+pallidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum.</a> Nature. 224, 1211-1212 (1969).</li>
<li>Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analyses+of+gene+regulation+during+early+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum.</a> Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).</li>
<li>Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotactic+signals+induce+cell+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).</li>
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<li>Vinet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+multicellular+differentiation+in+Dictyostelium+discoideum+is+regulated+by+coronin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A.</a> Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).</li>
<li>Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+holistic+phylogeny+of+the+coronin+gene+family+reveals+an+ancient+origin+of+the+tandem-coronin%2C+defines+a+new+subfamily%2C+and+predicts+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function.</a> BMC Evol Biol. 11, 268(2011).</li>
<li>Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+guard%3A+coronin+proteins+in+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity.</a> Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).</li>
<li>Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+Leukocyte+Plasma+Membrane+with+the+Actin+Cytoskeleton+through+Coiled+Coil-mediated+Trimeric+Coronin+1+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules.</a> Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).</li>
<li>Kammerer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+trimerization+motif+controls+the+topology+of+short+coiled+coils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).</li>
<li>Uetrecht, A. C., Bear, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronins%3A+the+return+of+the+crown%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronins: the return of the crown.</a> Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).</li>
<li>Jayachandran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin+1+Regulates+Cognition+and+Behavior+through+Modulation+of+cAMP%2FProtein+Kinase+A+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling.</a> PLoS Biol. 12, e1001820(2014).</li>
<li>Suo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin-1+is+a+neurotrophin+endosomal+effector+that+is+required+for+developmental+competition+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival.</a> Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).</li>
<li>Mueller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+survival+through+coronin-1-mediated+generation+of+inositol-1%2C4%2C5-trisphosphate+and+calcium+mobilization+after+T+cell+receptor+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering.</a> Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).</li>
<li>de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronin%2C+an+actin+binding+protein+of+Dictyostelium+discoideum+localized+to+cell+surface+projections%2C+has+sequence+similarities+to+G+protein+beta+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits.</a> EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).</li>
<li>Shina, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+unique+roles+of+coronin+proteins+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium.</a> Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).</li>
<li>Cornillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phg1p+is+a+nine-transmembrane+protein+superfamily+member+involved+in+dictyostelium+adhesion+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis.</a> J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).</li>
<li>Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+80+x+10%283%29+Mr+protein+mediates+sensing+of+cell+density+and+the+onset+of+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium.</a> Development. (112), 269-278 (1991).</li>
<li>Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteinous+factor+mediating+intercellular+communication+during+the+transition+of+Dictyostelium+cells+from+growth+to+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Zoological+science%22%5BJournal%5D)">A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation.</a> Zoological science. 12, 61-69 (1995).</li>
<li>Mehdy, M. C., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+factor+and+cyclic+AMP+jointly+regulate+cell-type-specific+gene+expression+in+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum.</a> Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).</li>
<li>Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+density-sensing+factor+controls+development+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A density-sensing factor controls development in Dictyostelium.</a> Genes Dev. 6, 390-400 (1992).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Dev Biol. 391, 1-16 (2014).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

coroninタンパク質は、真核生物クレードのほとんどの分類群で発見されています。coronin欠損細胞は初期発生時に集計中心を形成することができないので、 細胞性粘菌の coroninのA、哺乳類coronin 1のホモログは、早期の飢餓応答に関与していますサイクル10。定量的かつ正確に系統間で開発の遅れを評価することができるようにするには、自動化されたステージコントローラと顕微鏡、ライブセルイメージングセットアップは不可欠なツールです。 D. discoideumのは、そのライフサイクル1-4のいくつかの段階の間に本質的なシグナル伝達分子としてのcAMPを利用しています。 cAMPのが要求される時にチェックポイントの一つは、多細胞構造を形成する単一のセルからの遷移です。飢餓〜6時間後のcAMP波の開始は、細胞により感知され、集計センタ5に向かって移動する走化性信号を提供します。これらのcAMP波は飢えDをパルスすることによって実験的に模倣することができます...

タンパク質のcoroninファミリは、高度真核生物を通じて保存されています。これらのタンパク質は、カルボキシ末端のコイルドコイルドメイン13,14（ 図1）に接続されたユニークな領域が続くアミノ末端トリプトファン、アスパラギン酸（WD）リピート含有領域が存在することを特徴とします。 Coroninsは、細胞骨格調節およびシグナル伝達12を含む、種々の細胞機能に関与しています。哺乳類では、最大6つの短いcoronin分子（coronin 1-6）と同様に7をcoronin「タンデム」は、12,15を共発現させることができます。 Coronin 1は、最​​も広く研究ファミリーのメンバーであり、病原体の破壊、T細胞の生存および神経伝達に関与することが示されました。どのように、正確に、coronin 1は、これらの活動は不明なままで行います。 coroninながら1は、CAを調節することが示さ2+およびcAMP依存性シグナル伝達だけでなく、F-アクチン細胞骨格の調節16-18、潜在的な共同ました哺乳類で最大7家族の-expressionは、それが困難なこれらのシステムにcoroninsの分子機能を研究するために潜在的な冗長性のために作られました。哺乳類の生物とは異なり、下等真核生物細胞性粘菌は明らかに非冗長機能15,19,20と2つだけcoronin家族（coroninのA、哺乳類coronin 1とcoronin Bのオルソログ、哺乳類coronin 7のオルソログ）を表します。この事実は、 細胞性粘菌に coroninsの機能を研究するための強力なモデルになります。 細胞性粘菌でcoronin Aの役割を研究するために、我々は、10 coronin欠く野生型細胞または細胞のいずれかを用いて平衡塩類溶液（BSS）緩衝液を含む組織培養プレート中で飢餓によって発達サイクルを誘導しました。私たちはcoronin Aを欠く細胞が飢餓時に多細胞凝集体を形成することができなかったことがわかりました。この表現型の正確な定量的評価のためのこのプロトコールに記載の自動化生細胞イメージングは​​不可欠なツールです。 coronin欠く細胞における早期の飢餓応答の開始における欠陥は、cAMPカスケードの上流の行為をcoroninことを示唆し、cAMPのパルスを供給することによって救出することができます。開発の開始をシミュレートするためのcAMPパルスの外因性の適用は、過去8,9にいくつかの研究室で利用されてきました。しかしながら、この手順は、細胞密度及びタイミングに大きく依存することが知られています。したがって、ここで説明するプロトコルは、再現性の高い度合いを保証するために、これらの変動性を低減することを目的とします。まとめると、これらの研究に利用技術は、 細胞性粘菌の発達サイクルの初期段階でのタンパク質の機能を調査するために強力なツールを提供し、アップ識別だけでなく、機能をcoroninの下流エフェクター可能性を秘めています。

<table><tbody><tr><td>HL-5培地(1L用:プロテオースペプトン5g、チオトンEペプトン5g、グルコース10g、酵母抽出物5g、Na2HPO4*2H2O、0.35g KH2PO4、 0.05 g ジヒドロストレプトマイシン-硫酸塩、pH 6.6)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>プロテオース ペプトン</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>チオトン E ペプトン</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>AppliChem</td><td>A3666</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4*2H2O</td><td>Fluka</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>AppliChem</td><td>A1043</td><td></td></tr><tr><td>ジヒドロストレプトマイシン-硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1954000</td><td></td></tr><tr><td>PBM (0.02 M リン酸カリウム、10 &mu;M CaCl2、およびl mM MgCl2、pH 6.1)</td><td></td><td></td><td>自作</td></tr><tr><td>BSS(10 mM NaCl、10 mM KCl、2.5 mM CaCl2、pH 6.5)</td><td></td><td></td><td>自作</td></tr><tr><td>0.45-&mu;m Filtropure S フィルター</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-well 組織培養プレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1H</td><td></td></tr><tr><td>Cellobserver 顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td>カスタムビルド</td></tr><tr><td>AxioVision ソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPC マイクロプロセッサ&ndash;制御ディスペンシングポンプ</td><td>ISMATEC</td><td>ISM 931</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 135M 顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>491237-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーションシェーカー</td><td>Inforst HT Minitron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

初期の飢餓応答でcoronin aの機能を調査<em&gt;細胞性粘菌</em&gt;凝集アッセイによって

Investigating the Function of Coronin A in the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Aggregation Assays

細胞性粘菌のアメーバは細菌を餌に、土壌中に発見されています。食料源が不足になると、それらは、単一の細胞が凝集中心1-4向かっ走化その間多開発プログラムを開始する因子を分泌します。このプロセスは、環状アデノシン一リン酸（cAMP）5のリリースに依存しています。 cAMPは、アデニル酸シクラーゼ、およびホスホジエステラーゼの協調作用によって電波で産生され、Gタンパク質共役受容体のcAMP 6,7に結合されています。広く使用されているアッセイは、水没条件8,9における細胞凝集の観察に基づいている下等真核生物細胞性粘菌の発達サイクルに関与するメカニズムを分析します。このプロトコルは、平衡塩溶液（BSS）10の中に沈め組織培養プレート中で飢餓によって発達サイクルのcoronin Aの役割の分析を記載します。 Coronin Aは広く保存された広報のメンバーであります活動11,12の多種多様に関与しているcoroninsの家族otein。coronin Aを欠く細胞性粘菌の細胞は、多細胞凝集体を形成することができない、そしてこの欠陥が上流の行為をcoroninことを示唆し、cAMPのパルスを供給することによって救出することができますcAMPは10をカスケード。これらの研究に記載された技術は、cAMPカスケードの上流細胞性粘菌の発達サイクルの初期段階中にタンパク質の機能を調べるための強力なツールを提供します。したがって、この凝集アッセイを利用して機能をcoroninのさらなる研究を可能にし、coronin生物学の我々の理解を進めることができます。

ショーを開発の初期段階で欠陥をcoroninにおける欠損細胞（ 図2）。細胞をcoroninの不在下では細胞性粘菌の発達サイクル中の初期段階である多細胞凝集体を形成することができません。したがって、coronin Aは初期の飢餓応答および/またはcAMPシグナル伝達の際に役割を果たしていると思われます。実際、coronin Aの非存在下で、多細胞凝集体形成の欠如が減少したcAMPが10をシグナリングすることによって達成されます。しかし、外因性cAMPのパルスの印加は、完全野生型の表現型（ 図3）を復元します。これはcoronin、直接ではなくcAMPシグナル伝達、cAMPのカスケードの上流の機能（ 図5）に関与していることを含意します。 細胞性粘菌の細胞が飢え条件にさらされている場合、それらは初期の飢餓の分泌が22,23因子誘導します。最高のキャラの一つ早期の飢餓応答に関与cterized要因...

社会的なアメーバであるDictyostelium discoideumは、飢餓状態になると多細胞生物への発達移行を経験します。進化的に保存されたタンパク質であるコロニンAは、発生の開始に重要な役割を果たしています。アグリゲーションアッセイを主な手法として、初期開発におけるコロニンAの役割の解明を目指しています。

初期の飢餓応答でCoronin Aの機能を調査<em&gt;細胞性粘菌</em&gt;凝集アッセイによって

Dictyostelium discoideum amoeba are found in soil, feeding on bacteria. When food sources become scarce, they secrete factors to initiate a multicellular ...

本実験手順の目的は、Dictyostelium discoideumのCoronin-A依存的な初期飢餓応答を調査することです。この手法は、Dictyostelium discoideumの初期発生に関与するシグナル伝達経路や因子の特定など、発生生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本技術の主な利点は、発生誘導因子や初期発生シグナルに関与するタンパク質の自動化およびハイスループットスクリーニングのためのツールを提供できる可能性があることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、細胞密度、接着時間、発色時間など、アッセイに固有の複数の変数があるため、習得に苦労します。本手順を開始するには、HL-5培地を含むエルレンマイヤーフラスコを用いて、DH1.10細胞またはcorA欠損細胞を、振盪インキュベーターにて22 °C、160 rpmで培養します。細胞密度は1 × 10⁴から2 × 10⁶ cells/mLの間に維持してください。細胞凝集を調べるために、対数増殖期のDH1.10細胞またはDH1.10背景で作製したcorA欠損細胞を10〜50 mL回収する。400 ×gで3分間遠心分離し、次いでBSSで細胞を2回洗浄する。その後、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。続いて、細胞を24ウェルプレートに播種します。BSS中、22 degrees Celsiusで1時間静置し、細胞を接着させます。次に、タイムラプス顕微鏡を用いて細胞凝集を可視化し、135秒ごとに画像を撮影します。外部から投与したcyclic AMPパルスがDH1.10細胞またはDH1.10 corA欠損細胞の分化に及ぼす影響を調べるには、10〜50 mLの細胞を回収し、400 ×gで3分間遠心分離します。その後、BSSで2回洗浄します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測する。続いて、細胞をBSSで1×10⁷ cells/mLの密度に再懸濁する。その後、パルスを印加する前に、培養物を22℃、160 rpmで2時間振とうする。次に、タイマー制御のペリスタルティックポンプを用いて、cyclic AMPをパルス状に投与します。ポンプをプログラムし、5時間の期間にわたって、6分30秒ごとに5秒間のcyclic AMPパルスを投与するように設定します。重要なステップは、cyclic AMP注入用のチップが溶液に常に浸かっているのではなく、シェーカーによって発生する波によって周期的にのみ浸る状態にすることです。サイクリックAMPを添加した後、ヘモサイトメーターを用いて再度細胞数をカウントします。次に、細胞を24ウェルプレートに播種し、BSS中で1時間静置して接着させます。16時間後、22 °Cにおいて、5倍の対物レンズを用いた明視野顕微鏡で細胞凝集を観察します。本手順では、22 °CでHL5培地を用いて振盪培養した対数増殖期のDH1.10細胞またはDH1.10 corA欠損細胞を回収し、新鮮なコンディショニング培地を調製します。細胞を400 ×gで3分間遠心分離します。その後、PBMで3回洗浄します。続いて、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。その後、細胞をPBMにて1×10⁷ cells/mLの密度で再懸濁し、22 °C、110 rpmで20時間振盪させます。次に、細胞を400 ×gで3分間遠心分離し、条件培地を回収します。その後、4 °Cで8,000 ×g、15分間の遠心分離を行い、培地を清澄化します。次に、コンディショニング培地を0.45 µmフィルターでろ過し、PBMで3倍に希釈します。血球計数計を用いて細胞数をカウントし、24ウェルプレートに播種して、22 °Cで1時間静置し、細胞を接着させます。その後、細胞の上清を、あらかじめ調製しておいたコンディショニング培地に交換します。16時間後、5倍の対物レンズを用いた明視野顕微鏡で細胞凝集を観察します。ここでは、Coronin-A欠損細胞が初期発生における欠陥を示し、Dictyostelium discoideumの発生サイクルの初期段階である多細胞凝集体を形成できなかったことがわかります。この図では、栄養細胞の野生型およびcorA欠損細胞を洗浄し、2時間飢餓状態にした後、懸濁状態で15 µMのcAMPを5時間にわたり6分30分おきにパルス添加した、または添加せずに観察しました。外因性のサイクリックAMPパルスを適用することで、野生型の表現型が完全に回復しました。この図では、対数増殖期の野生型およびcorA欠損細胞をPBMで洗浄し、マルチウェルプレートに播種し、野生型またはcorA欠損の飢餓細胞から得られたコンディショニング培地でインキュベートしました。画像は細胞の播種から16時間後に撮影されました。corA欠損Dictyostelium discoideumは、発生誘導に必要なすべての因子を産生することができましたが、それらに反応することはできませんでした。この手法を習得すれば、適切に実施することで、培養時間を含めて20時間で完了させることができます。この手順を行う際は、菌株によって、細胞密度、接着時間、発生時間などのアッセイにおける複数の変数を調整する必要があることに留意することが重要です。本手順に続いて生化学的分画およびその後のプロテオーム解析を行うことで、Dictyostelium discoideumの初期飢餓応答に関与する因子を特定することができます。この動画を視聴することで、コンディショニング培地またはサイクリックAMPパルスを用いて、浸漬条件下でDictyostelium discoideumの初期発生を誘導する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

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生物学

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初期の飢餓応答でCoronin Aの機能を調査

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