初期の飢餓応答でCoronin Aの機能を調査

本実験手順の目的は、Dictyostelium discoideumのCoronin-A依存的な初期飢餓応答を調査することです。この手法は、Dictyostelium discoideumの初期発生に関与するシグナル伝達経路や因子の特定など、発生生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本技術の主な利点は、発生誘導因子や初期発生シグナルに関与するタンパク質の自動化およびハイスループットスクリーニングのためのツールを提供できる可能性があることです。

一般的に、この手法に不慣れな方は、細胞密度、接着時間、発色時間など、アッセイに固有の複数の変数があるため、習得に苦労します。本手順を開始するには、HL-5培地を含むエルレンマイヤーフラスコを用いて、DH1.10細胞またはcorA欠損細胞を、振盪インキュベーターにて22 °C、160 rpmで培養します。細胞密度は1 × 10⁴から2 × 10⁶ cells/mLの間に維持してください。

細胞凝集を調べるために、対数増殖期のDH1.10細胞またはDH1.10背景で作製したcorA欠損細胞を10〜50 mL回収する。400 ×gで3分間遠心分離し、次いでBSSで細胞を2回洗浄する。

その後、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。続いて、細胞を24ウェルプレートに播種します。BSS中、22 degrees Celsiusで1時間静置し、細胞を接着させます。

次に、タイムラプス顕微鏡を用いて細胞凝集を可視化し、135秒ごとに画像を撮影します。外部から投与したcyclic AMPパルスがDH1.10細胞またはDH1.10 corA欠損細胞の分化に及ぼす影響を調べるには、10〜50 mLの細胞を回収し、400 ×gで3分間遠心分離します。その後、BSSで2回洗浄します。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測する。続いて、細胞をBSSで1×10⁷ cells/mLの密度に再懸濁する。その後、パルスを印加する前に、培養物を22℃、160 rpmで2時間振とうする。

次に、タイマー制御のペリスタルティックポンプを用いて、cyclic AMPをパルス状に投与します。ポンプをプログラムし、5時間の期間にわたって、6分30秒ごとに5秒間のcyclic AMPパルスを投与するように設定します。重要なステップは、cyclic AMP注入用のチップが溶液に常に浸かっているのではなく、シェーカーによって発生する波によって周期的にのみ浸る状態にすることです。

サイクリックAMPを添加した後、ヘモサイトメーターを用いて再度細胞数をカウントします。次に、細胞を24ウェルプレートに播種し、BSS中で1時間静置して接着させます。16時間後、22 °Cにおいて、5倍の対物レンズを用いた明視野顕微鏡で細胞凝集を観察します。

本手順では、22 °CでHL5培地を用いて振盪培養した対数増殖期のDH1.10細胞またはDH1.10 corA欠損細胞を回収し、新鮮なコンディショニング培地を調製します。細胞を400 ×gで3分間遠心分離します。その後、PBMで3回洗浄します。

続いて、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。その後、細胞をPBMにて1×10⁷ cells/mLの密度で再懸濁し、22 °C、110 rpmで20時間振盪させます。次に、細胞を400 ×gで3分間遠心分離し、条件培地を回収します。その後、4 °Cで8,000 ×g、15分間の遠心分離を行い、培地を清澄化します。

次に、コンディショニング培地を0.45 µmフィルターでろ過し、PBMで3倍に希釈します。血球計数計を用いて細胞数をカウントし、24ウェルプレートに播種して、22 °Cで1時間静置し、細胞を接着させます。その後、細胞の上清を、あらかじめ調製しておいたコンディショニング培地に交換します。

16時間後、5倍の対物レンズを用いた明視野顕微鏡で細胞凝集を観察します。ここでは、Coronin-A欠損細胞が初期発生における欠陥を示し、Dictyostelium discoideumの発生サイクルの初期段階である多細胞凝集体を形成できなかったことがわかります。この図では、栄養細胞の野生型およびcorA欠損細胞を洗浄し、2時間飢餓状態にした後、懸濁状態で15 µMのcAMPを5時間にわたり6分30分おきにパルス添加した、または添加せずに観察しました。

外因性のサイクリックAMPパルスを適用することで、野生型の表現型が完全に回復しました。この図では、対数増殖期の野生型およびcorA欠損細胞をPBMで洗浄し、マルチウェルプレートに播種し、野生型またはcorA欠損の飢餓細胞から得られたコンディショニング培地でインキュベートしました。画像は細胞の播種から16時間後に撮影されました。

corA欠損Dictyostelium discoideumは、発生誘導に必要なすべての因子を産生することができましたが、それらに反応することはできませんでした。この手法を習得すれば、適切に実施することで、培養時間を含めて20時間で完了させることができます。この手順を行う際は、菌株によって、細胞密度、接着時間、発生時間などのアッセイにおける複数の変数を調整する必要があることに留意することが重要です。

本手順に続いて生化学的分画およびその後のプロテオーム解析を行うことで、Dictyostelium discoideumの初期飢餓応答に関与する因子を特定することができます。この動画を視聴することで、コンディショニング培地またはサイクリックAMPパルスを用いて、浸漬条件下でDictyostelium discoideumの初期発生を誘導する方法を十分に理解できるはずです。