Name: ダブル蛍光を組み合わせますその場でマウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ マウス脳切片における3遺伝子発現検出法。ダブル蛍光in situハイブリダイゼーションと免疫標識を組み合わせ、ASPA遺伝子のオリゴデンドロサイト特異的発現パターンを解明する手法です。抗体がなくても特定細胞型への遺伝子発現定位が可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者の研究室での作業は、UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1)、Wellcome Trust (WT100269MA)、European Research Council (ERC, "Ideas" Programme 293544)の支援を受けました。 SJは、EMBOの長期フェローシップによって支援されました。著者は、技術支援を提供してくれた Stephen Grant に感謝します。

倫理の声明： マウスの飼育と取り扱いは、動物（科学的手順）イギリスとその改正規則2012年の法1986に準拠し、英国内務省の規制やUCL倫理委員会のガイドラインに従っています。 注：すべての溶液をジエチルピロカーボネート（DEPC）で作られるべきである - あらゆる残留のRNaseを破壊するために処理された水。 DEPC処理のため、すべてのDEPC球はDEPCを分解するために、オートクレーブ後、消失するまでDEPC（リットル当たり1ミリリットル）を追加し、勢いよく振ります。 1. RNAプローブ合成<ol><li>注意：ホルムアミドを取り扱う際は、個人用保護具（P​​PE）を着用し、安全キャビネットを使用します。 50％（v / v）の脱イオン化ホルムアミド、200mMのNaClをDEPC処理した脱イオン水、5mMのEDTA、10mMのトリス塩酸pH7.5で、5mMののNaH 2 PO 4、5mMのの Na 2 HPO 4、：ハイブリダイゼーション緩衝液を調製します0.01 mg / mlで酵母tRNA、1×デンハルトsoluti上、およびデキストラン硫酸w / vの10％。 </li><li> RNAポリメラーゼプロモーターを有するプラスミド中の目的の遺伝子のcDNA配列を含むDNAクローンを選択します。この例では、 アスパためのT7およびSP6 RNAポリメラーゼプロモーター（ 補足図1）と、のpCMV-SPORT6クローン、IRAVp968C0654D（ジェンaccessionBC024934）を使用します。 </li><li>テンプレートとして線状化プラスミドDNAを準備します。 <ol><li> T7およびSP6のユニバーサルプライマーを用い、製造業者のプロトコルおよびシーケンスに従って小規模プラスミド精製キットでプラスミドを抽出し、DNAクローンを成長させます。 </li><li> cDNAのセンス鎖の5 &#39;末端で切断する制限酵素で1020μgのプラスミドDNAを消化。この例では、のpCMV-SPORT6- アスパプラスミドを消化するために100単位のSal Iを使用します。 37 O℃で1.5時間インキュベートします</li><li>プラスミドが完全に直線化されていることを確認するためにアガロースゲル上で少量を実行します。 </li></ol></li><li>浄化しますフェノール - クロロホルムを用いて線状化プラスミド。 <ol><li> 3 M酢酸ナトリウム1/10容量の、10mMのトリスHCl（pH8.0）での1ボリュームを追加 - 平衡化フェノールおよびクロロホルム/イソアミルアルコール（IAA）の1ボリューム（24：1）。 </li><li>室温で1分間、16,000×gで遠心分離（20から25°C、RT）と、上部の水相を抽出します。 </li><li> 1分間16,000×gでクロロホルム/ IAA、遠心分離機の1ボリュームを追加し、上部の水相を抽出します。 </li><li>手順を繰り返し1.4.3。 </li><li> 2容量のエタノールを加え、1時間またはO / N -20 O Cで残します。 </li><li> 10分間、4℃、16,000×gで遠心分離します。上清を捨てます。 </li><li> 70％冷エタノールでペレットを洗浄し、TE中2.51μl当たり近似的1μgのcDNAを（10mMのトリス-HCl、1mM EDTA pH7.5）をで再懸濁します。 </li></ol></li><li>二つのプローブ、ジゴキシゲニン（DIG）で標識した1およびフルオレセインイソチオシアネート（FITC）で他を合成します。 <ol><li>抗SEを作るために適切なRNAポリメラーゼを選択しますNSEプローブ（標的mRNAに相補的な）。この例では、 アスパプローブを作製するためにT7 RNAポリメラーゼを使用します。 </li><li> in vitro転写反応を準備します。1線形化μgのDNA、4.0μlの5×転写バッファー、100mMのDTTの6.0μlを、10倍DIGまたはFITC RNA標識ミックス含むdNTPの2.0μlを、1μlのRNase阻害剤、および20追加- 40 RNAポリメラーゼのユニット。 DEPC処理水で20μlの最終容量を構成しています。 </li><li> 1.5時間、37°C ​​のでインキュベートします。 </li></ol></li><li> 1.0％アガロースゲル上で転写反応のRUN1μlを、反応が働いていることを確認します。ゲルは、直鎖状鋳型とプローブの明るいバンドを示すべきです。 </li><li>ハイブリダイゼーション緩衝液で100μlにボリュームを構成し、-80℃で10μlのアリコートを保存します。 </li></ol> 2.潅流、固定および組織のコレクション<ol><li>注意：固体と両方、パラホルムアルデヒド（PFA）を取り扱います水性、PPEを着用し、安全キャビネットを使用します。熱（55℃）を用いて、PFA 1Xにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（w / v）の4％を溶解して、ホルムアルデヒド溶液を調製します。ろ紙とのホルムアルデヒド溶液をフィルタリングします。 </li><li>蒸留水中のスクロース（w / v）の20％を溶解させてスクロース溶液を調製し、0.1％（v / v）のDEPC溶液を加えます。緩い蓋をした後、オートクレーブを室温でO / Nのままにしておきます。 </li><li>末端ペントバルビタールの腹腔内注射（50mg / kgの）によって、マウスをanaesthetize。つま先のピンチによって麻酔の深さを評価し、引っ込め反射の不在は深い麻酔を示しています。 </li><li>マウスは深い麻酔下になると、胸郭の下に切開を行い、心臓を露出するためにそれを持ち上げ、両側の肋骨を切断。 </li><li>心臓の左心室に25-G針を挿入します。心臓の右心房内の小さな切開を行います。 </li><li> 20 mlのPBSと40mLをホルムアルデヒド溶液で動物を灌流。 P30および古いのためのマウスは12 ml /分の灌流速度を使用するが、若い動物は、より低いレートの使用のために（7 - 10ml /分）を。 </li><li>脳を解剖。 <ol><li>耳から切断された後部を行うことで、手術用ハサミでマウスの頭部を切断。皮膚中の尾側正中切開を行い、頭蓋骨から皮膚を削除する吻方働きます。 </li><li>尾の部分から出発し、正中線に沿って頭蓋骨の上部を通って、アイリスハサミで目の間で切断。骨板の片面毎に傾けるとピンセットでそれをスナップすることにより頭頂および前頭骨プレートを取り外します。 </li><li>静かにピンセットで前眼部から上方に脳を傾け、視神経およびその他の脳神経を切りました。静かに頭蓋骨から脳を持ち上げます。 </li></ol></li><li>マウス冠状脳マトリックス中に脳を置きます。フェザーカミソリで3約4mm片に脳をスライス。 </li><li> 4％PFA溶液にスライスを移し、4℃でO / Nインキュベートします。 </li><li>転送脳スライスDEPC処理した20％スクロース溶液に4℃でO / Nインキュベート</li><li>ドライcryomouldに各脳スライスを置き、最適な切削温度（OCT）培地で囲み、ドライアイス上で凍結。 -80℃で保管してください。 </li></ol> 3.凍結切片<ol><li>クライオスタットで凍結組織の15μmのセクションをカットし、顕微鏡スライド上にセクションを集めます。必要な場合は、DEPC処理PBSでセクションを濡らし、微細な絵筆でそれらを平らに。 </li><li>組織がスライドに付着することを確実にするために約1時間乾燥させるためにスライドを残します。 </li></ol> 4.ハイブリダイゼーション<ol><li> 150mMのNaCl、15mMののNa 3 C 3 H 5 O（COO）3（= 1×食塩水クエン酸ナトリウム）、50％（v / v）のホルムアミド、0.1％（v / v）のTween- 65℃の洗浄緩衝液を調製します20。 </li><li> 100 mMのマレイン酸、150mMのNaCl、0.1％（v / v）のトゥイーン20、pHが7.5：MABTバッファを準備します。 </li><li>二つのプローブ（DIG標識およびFITC-ラブレを希釈ハイブリダイゼーション緩衝液中のd）1 /千65℃にあらかじめ温め、よく混ぜます。 </li><li> 、各スライド上にハイブリダイゼーション混合物の約300μLを適用coverslipwithオーブン焼き（200°Cの ）カバースリップし、加湿チャンバー内で65℃でO / Nインキュベートします。 </li><li>予熱した洗浄緩衝液を含むコプリンジャーにスライドを転送します。洗浄緩衝液で65℃で二回30分間スライドを洗浄します。 </li><li> RTで10分間MABTで3回スライドを洗浄します。 </li></ol> FITCプローブの5可視化<ol><li> ISHは、ブロッキング緩衝液の準備：2％ブロッキング試薬及び10％熱不活性化ヒツジ血清とMABTを。 </li><li>オプション：必要な抗体溶液の量を減らすために、スライド上の組織切片の周りに円を描くように疎水性のペンを使用します。 </li><li> ISHは、加湿チャンバー内でブロッキング緩衝液で室温で1時間のためのスライドをインキュベートします。 </li><li>西洋ワサビペルオキシダーゼ（POD）で4℃でスライドO / Nインキュベート - コンジュゲートD抗FITC抗体を1/500（v / v）のISHでブロッキング緩衝液に希釈しました。 </li><li> 0.1％（v / v）のTween-20を（PBST）を含むPBSを含むコプリンジャーにスライドを配置します。 PBSTで10分間3回洗浄し、新鮮なPBSTで毎回交換してください。 </li><li>使用直前に、増幅希釈剤に100倍に希釈して蛍光チラミドを準備します。この例では、FITC-チラミドを使用します。 </li><li>スライドにこれを追加し、室温で10分間放置します。 </li><li>コプリンジャーにスライドを置き、10分間PBSTで3回洗浄します。 </li></ol> DIGプローブの6.可視化<ol><li> 0.1 Mトリス塩酸pHが8.2を準備します。 </li><li> ISHを室温で1時間ブロッキング緩衝液でスライドをインキュベートします。 </li><li>アルカリホスファターゼ（AP）と4℃でスライドO / Nインキュベート1 / 1,500希釈した抗DIG抗体が（v / v）のISHでブロッキング緩衝液抱合。 </li><li> 10分間MABTで3回洗浄します。 </li><li> RTで5分間、0.1Mトリス-HCl pHは8.2で二回洗浄します。 </li><li>使用直前に、0.1 MトリスpHを8.2に錠剤を溶解することによりファストレッド溶液を調製。 0.22μMのフィルターを通してソリューションをフィルタリングします。 </li><li>加湿チャンバー内のファストレッド溶液を用いて37℃でスライドをインキュベートします。最適な開発のための時間が変化すると、沈殿物の形成を監視するために、蛍光顕微鏡を用いて定期的にスライドを確認してください。 3時間 - この例では、2の後に反応を停止。 </li><li> 10分間PBSTで3回洗浄します。 </li></ol> 7.免疫組織化学<ol><li> IHCブロッキング緩衝液を準備します：10％PBSTで（一次抗体のホストに異なる種の）（v / v）の血清を。 </li><li> IHCは、加湿チャンバー内で室温で1時間ブロッキング緩衝液でスライドをインキュベートします。 </li><li>一次抗体を準備します（一次抗体のホストに異なる種の）5％血清をPBST中の適切な希釈で一次抗体を希釈します。この例では、1/400（v / v）の希釈でウサギ抗OLIG2抗体を使用しています。 </li><li>4°CO / Nで一次抗体溶液中でインキュベートします。 </li><li> 10分間PBSTで3回洗浄します。 </li><li>二次抗体を調製する：この例では、0.1％（v / v）のヘキスト33258（異なる一次抗体の宿主への種の）5％PBST中の適切な希釈で（v / v）の血清フルオロフォア結合二次抗体を希釈、1 /千（v / v）の希釈で二次抗体Alexa647ロバ抗ウサギを使用します。 </li><li>室温で1時間、二次抗体溶液中でインキュベートします。 </li><li> 10分間PBSTで3回洗浄します。 </li></ol> 8.取り付け<ol><li>部分的に室温でスライドを乾燥させ、そして蛍光マウンティング培地でマウントします。ファストレッドための570nmで、FITC用の488nm、OLIG2の免疫標識のための647 nmおよびヘキスト用の350nmで：10X下の共焦点顕微鏡では、その後、20X、次の励起波長で4つの異なるチャネルを使用して63X目標を画像を乾燥し、するスライドを残します。 </li></ol>

<ol><li>Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+as+intrinsic+components+of+non-cell-autonomous+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).</li>
<li>Baslow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylaspartate+in+the+vertebrate+brain%3A+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function.</a> Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).</li>
<li>Hoshino, H., Kubota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canavan+disease%3A+clinical+features+and+recent+advances+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Int%22%5BJournal%5D)">Canavan disease: clinical features and recent advances in research.</a> Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).</li>
<li>Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+human+aspartoacylase+cDNA+and+a+common+missense+mutation+in+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease.</a> Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).</li>
<li>Divry, P., Mathieu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+deficiency+and+N-acetylaspartic+aciduria+in+patients+with+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease.</a> Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).</li>
<li>Bartalini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+diagnosis+of+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Childs+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Biochemical diagnosis of Canavan disease.</a> Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).</li>
<li>Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylaspartate+in+the+CNS%3A+from+neurodiagnostics+to+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology.</a> Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).</li>
<li>D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+occurrence+of+N-acetylaspartate+amidohydrolase+%28aminoacylase+II%29+in+the+developing+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat.</a> J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).</li>
<li>Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+regional+distribution+of+aspartoacylase+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue.</a> J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).</li>
<li>Sommer, A., Sass, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+aspartoacylase+%28ASPA%29+and+Canavan%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan.</a> Gene. 505 (2), 206-210 (2012).</li>
<li>Klugmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+distribution+of+aspartoacylase+in+the+postnatal+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain.</a> Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).</li>
<li>Madhavarao, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+of+aspartoacylase+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system.</a> J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).</li>
<li>Hershfield, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+a+regulated+nuclear-cytoplasmic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme.</a> Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).</li>
<li>Moffett, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+aspartoacylase+expression+in+the+rat+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system.</a> Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartoacylase+is+restricted+primarily+to+myelin+synthesizing+cells+in+the+CNS%3A+therapeutic+implications+for+Canavan+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease.</a> Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).</li>
<li>Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+of+aspartoacylase+in+oligodendrocytes+parallels+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination.</a> Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルは、免疫染色に続いてin situハイブリダイゼーション二重RNAのためのステップバイステップの手順を提供します。我々は、 アスパは、いくつかの脳の領域で成熟したオリゴデンドロサイトに発現していることを確認するために、このプロトコルを使用しています。 この多段階の手順は、感度に影響を与えることができ、避けるべきである多くの潜在的な落とし穴を有します。まず、転写反応のためのすべてのソリューションおよびストレージ・バッファはRNaseフリーである必要があります。第二に、cDNA鋳型の選択が重要であり、我々は長さが約1キロバイトのテンプレートを好みます。 in vitro転写の前にフェノール/クロロホルム抽出とcDNA鋳型をクリーンアップすることが必要であると再沈殿それら。また、プローブの転写を最適にする必要があります。プローブは十分な量で産生されていない場合には、ISHの品質を低下させます。プローブの品質は、アガロースゲル上でそれを調べることによって確認することができ、良好な品質は次のようになりますテンプレートバンド（...

中枢神経系（CNS）において最も豊富な細胞であるグリア細胞は、希突起膠細胞（CNSのミエリン形成細胞）、オリゴデンドロサイト前駆体（以下、「NG2細胞」としても知られているオプス）、アストロサイト及びミクログリアを含みます。グリア細胞と神経疾患1におけるそれらの潜在的な役割の機能への関心の高まりがあります。例えば、カナバン病（CD）は、年齢2,3の10年前に、通常は死に至る、海綿状白質ジストロフィーとニューロンの進行性の喪失と乳児期早期での出発遺伝性神経変性疾患です。大幅CDにASPAアクティビティ4を減少につながるAspartoacyclase（ASPA）遺伝子の変異が同定されています。 ASPAは、酢酸およびアスパラギン酸5-7を生成し 、N-アセチルアスパラギン酸（NAA）の脱アセチル化を触媒する酵素で、非常に脳に集中する分子です。多くのCD患者起因ASPA ACの欠如にNAAのより高いレベルを示しますtivity。いくつかの研究は、NAA由来の酢酸は、開発やCD 3,5,6を破壊するNAAの故障による開発中に減少ミエリン合成に起因する時の脳内の脂肪酸/脂質の主要な供給源であり得ることが推測しています。 ASPAは、主に脳の腎臓、肝臓および白質で発見され、そしてCDで南極特別保護地区の重要な役割を与えられた、脳におけるこの酵素の細胞発現は、いくつかの研究室によって研究されてきました。脳内ASPA酵素活性を調べることによって、以前の研究では、脳の発達の間ASPA活性の増加は、髄鞘形成8-10の時間経過に匹敵することを見出しました。細胞レベルでは、酵素活性のためだけでなく、in situハイブリダイゼーション（ISH）および免疫組織化学（IHC） でのアッセイは、ASPAは、主に脳内のオリゴデンドロサイトではなく、ニューロンやアストロサイト11月16日に発現していることを示唆している分析します。 ASPAはまたかもしれないことがわかった少数の研究CNS 12,14にミクログリアで発現させること。 OPでASPA発現に対するこれまでのデータは限られています。ニューロン、アストロサイト、OPは、新たに形成されたオリゴデンドロサイト、ミエリンオリゴデンドロサイト、ミクログリア、内皮細胞、および周皮細胞などのマウス大脳皮質における異なる種類の細胞のトランスクリプトームは、RNAの塩基配列決定17で分析した最近の研究によると、 南極特別保護地区はもっぱらオリゴデンドロサイトに発現しています、特にオリゴデンドロサイトのミエリン中（http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html）。脳内のASPA発現パターンに、これらの研究にもかかわらず、不確定要素の数が残っています。 別の技術は、遺伝子発現パターンを研究するために使用することができます。 IHCは、組織切片における遺伝子発現の機能的産物（ すなわち、タンパク質）を検出するために一般的に使用される方法です。そのアプリケーションおよび特異性は、対象トンであるため、その大きな有用性にもかかわらず、この手法には限界があります必要な抗体の利用可能性と特異O。比較により、ISHは、mRNAレベルでの任意の遺伝子の発現を明らかにすることができるという利点を有します。しかしながら、特定の細胞型への遺伝子の発現を局在化するために、同時に複数のプローブを使用することは技術的に困難であることができます。この記事では、我々は、タンパク質の蛍光免疫標識とin situハイブリダイゼーション二重蛍光RNAを合成するプロトコルを記述します。我々は、マウス脳におけるアスパの発現パターンを調べるために、技術のこのセットを使用しています。この方法は、共焦点顕微鏡を用いた遺伝子発現の正確な研究を可能にします。

<table><tbody><tr><td>QIAprep Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr>脱<td>イオンホルムアミド</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>ISH ブロッキングバッファー用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>VWR International</td><td>20252.290</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性無水物</td><td>シグマ</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性二水和物</td><td>シグマ</td><td>30435</td><td></td></tr><tr><td>酵母 tRNA</td><td>ロシュ</td><td>10109495001</td><td></td></tr><tr><td>50x デンハルトの溶液</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>750018</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸</td><td>シグマ</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>アスパcDNAクローン</td><td>出典 バイオサイエンス</td><td>IRAVp968C0654D</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>平衡フェノール</td><td>Σ</td><td>P4557</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>イソアミルアルコール</td><td>Aldrich</td><td>496200</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR International</td><td>20821.321</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNAポリメラーゼ</td><td>プロメガ</td><td>P4074</td><td></td></tr><tr><td>転写バッファー</td><td>プロメガ</td><td>P118B</td><td></td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>プロメガ</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>UTP-DIG NTP ミックス</td><td>ロシュ</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>ルナシン</td><td>プロメガ</td><td>N251B</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>濾紙</td><td>フィッシャー科学</td><td>005479470</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma</td><td>59378</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート</td><td>Σ</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbitone</td><td>Animalcare Ltd</td><td>BN43054</td><td></td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>World Precision Instruments</td><td>15922</td><td></td></tr><tr><td>25ゲージ針</td><td>テルモ</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>Cole-Parmer Instrument Co., Ltd</td><td>WZ-07522-30</td><td></td></tr><tr><td>アイリスハサミ</td><td>ヴァイス</td><td>103227</td><td></td></tr><tr><td>No.2ピンセット</td><td>ワールドプレシジョンズ</td><td>500230</td><td></td></tr><tr><td>コロナルブレインマトリックス</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメン</td>ツ <td>RBMS-200C</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>ペルソナメディカル</td><td>PERS60-0138</td><td></td></tr><tr><td>OCT 中</td><td>ティッシュテック</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット/ミクロトーム</td><td>ブライト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト プラス スライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>S4641</td><td>65 °C;Cウォッシュバッファー</td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7503</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>VWR International</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Smith Scientific Ltd</td><td>2959</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化羊血清</td><td>Sigma</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>疎水性ペン</td><td>Cosmo Bio</td><td>DAI-PAP-S</td><td>1:500</td></tr><tr><td>&-FITC POD 標識抗体</td><td>Roche</td><td>11426346910</td><td></td></tr><tr><td>TSA&trade;プラスフルオレセインシステム</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL741001KT</td><td>1:1,500</td></tr><tr><td>&alpha;-DIG AP共役ロ</td><td>シュ</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>高速赤色錠剤</td><td>ロシュ</td><td>11496549001.22</td><td></td></tr><tr><td>&マイクロ;M フィルター</td><td>Millex</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>&-Olig2 ウサギ アリ体</td><td>ミリポア</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; 647-コンジュゲート &α;-ウサギ抗体</td><td>ライフサイエンス</td><td>A-31573</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>ビスベンズイミド H 33258</td><td>σ</td><td>B2883</td><td></td></tr><tr><td>実装媒体</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>ライカ SP2 共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections

脳細胞の異なるタイプ、例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体およびミクログリアにおける遺伝子発現の検出は、免疫染色のために特異的な一次または二次抗体の不足によって妨げられることができます。ここでは、第三の遺伝子によってコードされるタンパク質に対する高い特異性の抗体を用いて免疫染色に続いて2遺伝子特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーション二重蛍光を使用して、同じ脳切片における三つの異なる遺伝子の発現を検出するためのプロトコルを説明します。 Aspartoacyclase（ASPA）遺伝子の突然変異は稀な人間白質疾患につながることができます-カナバン病は-オリゴデンドロサイトとミクログリアではなく、星状細胞およびニューロンにおいて発現されると考えられています。しかし、脳内ASPAの正確な発現パターンは、まだ確立されていません。このプロトコルは、ASPAは、成熟オリゴデンドロサイトaのサブセットに発現していることを決定することができましたNDは、一般に、遺伝子発現パターンの研究に広く適用することができます。

この記事では、マウス脳切片における免疫標識に続いて二重蛍光ISHのための方法を説明します。このプロトコルの簡単な説明は、最初のステップは、 アスパおよびMBP（ミエリン塩基性タンパク質 ）に特異的なプローブを合成することで、図1に示されています。プローブが合成されたことを確認するには、各反応の小アリコートをアガロースゲルに流しました。かすかな線状鋳型とRNAプローブの大量（ 図2）を見ることができます。 OLIG2の免疫標識およびヘキスト核染色に続いアスパとMBP のための二重蛍光ISHは、マウスの脳切片上で実施しました。我々は、共焦点顕微鏡で脳切片をスキャンし、脳における遺伝子発現シグナルの分布を明らかにするために一緒に画像をステッチ。MBPの陽性（MBP +）細胞におけるアスパ発現は、ブラジャー全体に観察されました<html> <strong...

特定の細胞タイプへの遺伝子発現の局在化は、特異的な抗体がないために困難な場合があります。ここでは、ダブル蛍光 RNA in situ ハイブリダイゼーションと免疫染色を組み合わせることにより、遺伝子発現を 3 回同時に検出するプロトコールについて説明します。

Detection of gene expression in different types of brain cells e.g., neurons, astrocytes, oligodendrocytes, oligodendrocyte precursors and microglia, can ...

この実験の全体的な目的は、2重蛍光in situハイブリダイゼーションとそれに続く免疫染色の組み合わせを用い、脳切片における3つの異なる遺伝子の発現を同時に検出することです。この手法は、「目的の遺伝子がどの細胞型で発現しているか」といった神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、目的の遺伝子に対する優れた抗体がなくても、特定の細胞型におけるその発現部位を特定できることです。この手順をまとめると、1日目に固定した組織切片を作製し、2種類の異なるラベルを付加したRNAプローブを用いて一晩ハイブリダイゼーションを行います。2日目に、FITCラベルプローブを標的とする抗体とともに一晩インキュベートします。この抗体には西洋ワサビペルオキシダーゼが結合しており、3日目に蛍光チラミドの添加を触媒します。次に、DIG標識プローブを標的とするアルカリフォスファターゼ標識抗体を使用します。4日目に、Fast Red溶液でインキュベートすると、この酵素が蛍光沈殿物の形成を触媒します。その後、切片を目的のタンパク質を標的とする一次抗体で一晩インキュベートします。最後に、5日目に、蛍光色素標識二次抗体を用いてこのタンパク質を可視化します。この手順を開始するには、RNAポリメラーゼプロモーターを持つプラスミドに目的遺伝子のcDNA配列を含むDNAクローンを選択します。次に、そのDNAクローンを培養し、小スケールプラスミド精製キットを用いてプラスミドを抽出して、T7およびSP6ユニバーサルプライマーを用いてシーケンシングを行います。10～20 µgのプラスミドDNAを、cDNAのセンス鎖の5'末端を切断する制限酵素で消化します。37 °Cで1.5時間インキュベートしてください。その後、少量をアガロースゲルで電気泳動し、プラスミドが完全に直線化しているかを確認します。線状化したプラスミドを精製するために、3 M 酢酸ナトリウムを液量の1/10、10 mM Tris-HClで平衡化したフェノールを1容量、およびクロロホルム・イソアミルアルコールを1容量加えます。室温で16,000 Gで1分間遠心分離し、上層の水相を回収します。その後、クロロホルムIAAを1容量加えます。16,000 Gsで1分間遠心分離し、上層の水相を回収します。この手順をもう一度繰り返します。その後、2倍量のエタノールを加え、-20 °Cで1時間または一晩保持します。その後、4°Cで10分間、16,000 Gsで遠心分離します。上清を除去し、ペレットを70%の冷エタノールで洗浄します。次に、cDNA濃度が1 µg / 2.5 µLとなるようにTEで再懸濁します。2種類のプローブを合成するには、まず適切なRNAポリメラーゼを選択します。次に、in vitro転写反応液を調製し、DEPC処理水を用いて最終容量を20 µLにします。37 °Cで1.5時間インキュベートします。続いて、転写反応液を1 µL、1%アガロースゲルで電気泳動し、反応が正常に行われたかを確認します。ゲル上には、線状のテンプレートとプローブの明瞭なバンドが認められるはずです。この手順では、クライオスタットを用いて凍結組織を15 µmの厚さで切片化します。切片を顕微鏡スライドに回収し、組織がスライドに十分に adhere するよう、1時間放置して乾燥させます。この手順を成功させるための最も重要な要因は、切片の品質です。これは、組織が十分に灌流・固定されていること、および RNase 汚染がなく平坦な切片を得るための切断技術に依存します。次に、2種類のプローブを65 °Cに予熱したハイブリダイゼーションバッファーで希釈し、十分に混合します。ハイブリダイゼーション混合液を各スライドに300 µLずつ滴下し、オーブンで焼成したカバーガラスで覆います。その後、加湿チャンバー内でスライドを65 °Cで一晩インキュベートします。翌日、スライドをあらかじめ温めておいた洗浄バッファーを入れたコプリンジャーに移し、65 °Cで30分間の洗浄を2回行います。その後、室温でMABT洗浄液を用いて10分間の洗浄を3回行います。このステップで、疎水性ペンを使用して組織切片の周囲に円を描きます。次に、スライドをISHブロッキングバッファーと共に加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。続いて、西洋わさびペルオキシダーゼ（HRP）標識抗FITC抗体を用いて、スライドを4 °Cで一晩インキュベートします。その後、スライドをPBSTを含むコプリンジャーに入れます。PBSTで10分間ずつ3回洗浄し、その都度新しいPBSTに交換します。その後、スライドに蛍光チロミドを添加し、室温で10分間静置します。スライドをコップリンジャーに入れ、PBSTで10分間ずつ3回洗浄します。続いて、スライドをISHブロッキングバッファーで室温で1時間インキュベートします。次に、アルカリフォスファターゼ標識抗dig抗体とともに、4 °Cで一晩インキュベートします。その後、MABTで10分間ずつ3回洗浄します。次に、pH 8.2の0.1 molar tris HCLを用いて、室温で5分間、スライドを2回洗浄します。fast red溶液をろ過し、加湿チャンバー内でfast red溶液を用いてスライドを37 degrees Celciusでインキュベートします。最適な発色の時間は変動するため、蛍光顕微鏡で定期的にスライドを確認し、沈殿物の形成をモニタリングしてください。その後、PBSTで10分間ずつ3回洗浄します。免疫組織化学染色を行うには、スライドをIHCブロッキングバッファーとともに、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。次に、スライドを一次抗体溶液中で4°Cにて一晩インキュベートします。翌日、スライドをPBSTで10分間、3回洗浄します。室温で二次抗体溶液中で1時間インキュベートします。その後、PBSTで10分間ずつ3回洗浄します。その後、スライドを室温で部分的に乾燥させ、蛍光封入剤で封入します。共焦点顕微鏡で撮像する前に、スライドを乾燥させておきます。ここでは、AspaおよびMbpのISHによる代表的な画像と、それに続くOLIG2の免疫染色およびフックス染色を併用した画像を示します。皮質および脳梁において、Aspaは一部のMBP陽性OLIG2陽性細胞で発現していました。一方、Aspaを発現していないMBP陽性OLIG2陽性細胞も存在します。この手順を行う際は、切片およびすべての溶液をRNase汚染のない状態に保つことが重要です。このビデオを視聴することで、N-citrine阻害および免疫組織化学を用いて遺伝子発現パターンを研究する方法について十分に理解できるはずです。この手法は、異なる由来や発生段階にあるさまざまな組織に適応させることができます。

combining-double-fluorescence-situ-hybridization-with-immunolabelling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、非放射性の関係...

二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

マウス組織からのデータ収集を最大にするために異なる技術の組み合わせが提示される。...

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

出典:Jolly, S., et.al.二重蛍光In Situハイブリダイゼーションと免疫標識を組み合わせて、マウス脳切片における3つの遺伝子の発現を検出します。J. Vis. Exp. (2016).このビデオでは、ダブル蛍光in...

マウス脳切片における遺伝子発現を検出するための二重蛍光In Situハイブリダイゼーションの実施

出典:Baleriola, J., et.al.、高解像度In Situハイブリダイゼーションを使用した脳切片における軸索局在mRNAの検出。 J. Vis. Exp. (2015)このビデオは、蛍光in...

蛍光In Situハイブリダイゼーション後のマウス脳切片におけるニューロンの免疫染色

この入門レベルのプロトコルは、ミクログリアとニューロン要素のマーカーを例に、げっ歯類の脳の免疫組織化学的染色を完了するために必要な試薬、機器、および技術を説明しています。...

ミクログリアとニューロンのための例染色：凍結切片ラット脳組織の免疫組織化学のためのプライマー

我々は、色の沈殿物を対照することによって三つの異なるmRNAの分布パターンの同時および特定の検出を可能にする、完全なショウジョウバエの胚におけるマルチターゲット発色性ホールマウントin situハイブリダイゼーション （MC-WISH）の手順を説明します。...

マルチターゲット発色ホールマウント<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーションにおける遺伝子発現のドメインを比較します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

このプロトコルは、IBA1およびTMEM119の免疫蛍光コシャリンのための段階的なワークフローを記述し、ミクログリア密度、分布、および形態の分析に加えて、ならびにマウス脳組織における末梢骨髄細胞浸潤の分析を説明する。...

マウス脳における微小グリア密度、形態および末梢骨髄細胞浸潤解析のためのIBA1およびTMEM119を用いた免疫蛍光染色

このプロトコルはmultilabel FISHおよび蛍光性のIHC信号を達成することを目標に、新しい凍結および固定マウス頭脳セクションの蛍光性in situ の交配(魚)および蛍光性のimmunohistochemistry...

マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)

誘導性トランスジェニック系統トレースマウス系統を用いて幹細胞およびその子孫を蛍光色素で恒久的にマーキングする能力は、...

成体マウス脳における誘導性蛍光標識幹細胞の系統追跡

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

学ぶ マウス脳切片における3遺伝子発現検出法。ダブル蛍光in situハイブリダイゼーションと免疫標識を組み合わせ、ASPA遺伝子のオリゴデンドロサイト特異的発現パターンを解明する手法です。抗体がなくても特定細胞型への遺伝子発現定位が可能です。

ダブル蛍光を組み合わせます

さらに動画を探す