ダブル蛍光を組み合わせますその場でマウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

この実験の全体的な目標は、二重蛍光in situハイブリダイゼーションとそれに続く免疫染色を使用して、脳切片における3つの異なる遺伝子の発現を同時に検出することです。この方法は、どの細胞タイプが目的の遺伝子を発現しているかなど、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、目的の遺伝子の発現を特定の細胞タイプに局在化させるために、優れた抗体を必要としないことです。

この手順を要約すると、初日に、固定組織切片を切断し、2つの異なる標識RNAプローブと一晩でハイブリダイズします。2日目には、切片をFITC標識プローブを標的とする抗体と一晩インキュベートします。この抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼと結合しており、3日目に蛍光チラミドの添加を触媒します。

次に、アルカリホスファターゼ標識抗体を使用して、DIG標識プローブを標的とします。4日目に、この酵素はFast Red溶液とインキュベートすると、蛍光沈殿物の形成を触媒します。次に、切片を目的のタンパク質を標的とする一次抗体と一晩インキュベートします。

最後に、5日目に、このタンパク質を蛍光色素標識二次抗体で可視化します。この手順を開始するには、RNAポリメラーゼプロモーターを含むプラスミドに目的の遺伝子のcDNA配列を含むDNAクローンを選択します。次に、DNAクローンを増殖させ、小規模プラスミド精製キットでプラスミドを抽出し、T7およびSP6ユニバーサルプライマーでシーケンシングします。

10〜20 μgのプラスミドDNAを、cDNAのセンス鎖の5つのプライムエンドで切断する制限酵素で消化します。摂氏37度で1.5時間インキュベートします。次に、アガロースゲルに少量のアリコートを泳動して、プラスミドが完全に直鎖化されていることを確認します。

直鎖状プラスミドを精製するには、3モル酢酸ナトリウムの容量の1/10、10ミリモルのTris-HCl平衡フェノールの容量、および1容量のクロロホルムイソアミルアルコールを添加します。室温で1分間16, 000Gで遠心分離し、上部水相を抽出します。次に、クロロホルムIAAを1容量追加します。

16, 000 Gで1分間遠心分離し、上部水相を抽出します。この手順をもう一度繰り返します。次に、2容量のエタノールを加え、摂氏マイナス20度で1時間または一晩保ちます。

その後、摂氏4度で16, 000Gで10分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを70%の冷たいエタノールで洗います。次に、2.5 マイクロリットルあたり 1 マイクログラムの cDNA の濃度で TE に再懸濁します。

2つのプローブを合成するには、まず適切なRNAポリメラーゼを選択します。次に、in vitro転写反応を調製し、DEPC処理水で最終容量を最大20マイクロリットルにします。摂氏37度で1.5時間インキュベートします。

その後、転写反応の1マイクロリットルを1%アガロースゲル上で実行し、反応が機能したかどうかを確認します。ゲルは、プローブの線形テンプレートと明るいバンドを示す必要があります。この手順では、凍結組織の厚さ15マイクロメートルの切片をクライオスタットで切断します。

切片を顕微鏡スライドに集め、スライドを1時間乾燥させて、組織がスライドに付着することを確認します。この手順がうまく機能するための最も重要な要素は、セクションの品質です。これは、一部は十分に灌流され固定された組織を持っていること、および一部はRNase汚染のない平らな切片を得るための切片作成技術に依存します。

次に、2つのプローブを摂氏65度に予め加温したハイブリダイゼーションバッファーで希釈し、よく混合します。300マイクロリットルのハイブリダイゼーション混合物を各スライドに塗布し、オーブンで焼いたカバースリップで覆います。その後、加湿チャンバー内でスライドを摂氏65度で一晩インキュベートします。

翌日、スライドを予め温めた洗浄バッファーを含むCoplinジャーに移し、スライドを摂氏65度で30分間、2回洗浄します。その後、スライドをMABT洗浄液で室温で10分間3回洗浄します。このステップでは、疎水性ペンを使用して、ティッシュ切片の周りに円を描きます。

次に、加湿チャンバー内でISHブロッキングバッファーを使用して、スライドを室温で1時間インキュベートします。次に、スライドを4°Cで一晩インキュベートし、西洋ワサビ過酸化標識抗FITC抗体とインキュベートします。次に、スライドをPBSTが入ったコプリンジャーに入れます。

毎回PBSTで3回10分間洗い、毎回新しいPBSTと交換します。その後、スライドに蛍光チロミドを加え、室温で10分間放置します。スライドをコプリンジャーに入れ、PBSTで10分間3回洗います。

その後、スライドをISHブロッキングバッファーと室温で1時間インキュベートします。次に、スライドをアルカリホスファターゼ標識抗DIG抗体と摂氏4度で一晩インキュベートします。その後、MABTで3回、10分ずつ洗います。

次に、スライドを pH 8.2 の 0.1 モルトリス HCL で室温で 5 分間 2 回洗浄します。高速赤色溶液をろ過し、スライドを摂氏37度で高速赤色溶液と加湿チャンバー内でインキュベートします。最適な現像にかかる時間は異なるため、蛍光顕微鏡でスライドを定期的にチェックし、沈殿物の形成を監視します。

その後、PBSTで3回、毎回10分間洗います。免疫組織化学を行うには、スライドをIHCブロッキングバッファーと室温で1時間、加湿チャンバー内でインキュベートします。次に、スライドを一次抗体溶液中で摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、スライドをPBSTで10分間3回洗浄します。二次抗体溶液中で室温で1時間インキュベートします。その後、PBSTで毎回10分間、3回洗浄します。

その後、スライドを室温で部分的に乾燥させ、蛍光封入剤で封入します。スライドを乾燥させてから、共焦点顕微鏡でイメージングします。ここに示されているのは、ASPAとMbpのISHの代表的な画像と、それに続くOLIG2の免疫染色とフック染色を組み合わせたものです。

Aspaは、皮質および脳梁の一部のMBP陽性OLIG2陽性細胞で発現していました。一部のMbp陽性OLIG2陽性細胞はAspaを発現しません。この手順を実行する際には、スライスとすべての溶液にRNase汚染がないように注意することが重要です。

このビデオを見れば、N-シトリン阻害と免疫組織化学による遺伝子発現パターンの研究方法について十分に理解できるはずです。この技術は、さまざまな起源や発生段階のさまざまな組織に適応できます。