Name: 心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぶ心筋細胞再生の定量化法。長期ヌクレオシド標識とフローサイトメトリーを用いて、DNA合成と倍数性を同時評価し、心筋細胞新生を正確に測定します。再生医療研究に有用です。

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この作業は、British Heart Foundationのプロジェクト助成金PG/13/69/30454によって支援されました。

動物の作業はニューカッスル大学の倫理審査委員会によって承認され、承認されました。全ての動物手順は、科学的な目的のために使用される動物の保護に関する欧州議会の指令63分の2010 / EUからのガイドラインに準拠して実施しました。 1. EDU管理<ol><li> 12.5ミリグラム/ mlの最終濃度で、滅菌生理食塩液中EDU（w / vの0.9％）を溶解させます。 <ol><li>完全に溶解するために40°Cと渦の溶液を加熱します。 6毎日の注射を可能にする研究にすべてのマウスを注入するために4℃で十分なEDU /生理食塩水を保管してください。 注：通常6以上のマウスが各実験群のために必要とされます。しかし、電力の計算は、独立した研究のために行われるべきです。 </li></ol></li><li>個々のマウスの重量を測定。各マウスにEDU /生理食塩水を100μg/グラム（グラムあたりの株式EDU液の8μl）を管理するために必要な量を計算します。 </li><li>適切なvolumを描きます25 G針を有するインスリン注射器へのEDU /生理食塩水の電子。 </li><li>承認された内務省の技法を用いてマウスを処理しながら、腹腔内（ip）注射を行います。 <ol><li>ケージの蓋の上にマウスを置きます。ゆっくり尾の付け根に引き戻し、しっかりと首筋によってマウスを把握します。 </li><li>ヘッドのベース近くに人差し指と親指でマウスを保持し、床に向かって後方に動物の頭を傾けて注入するための腹部を公開します。 </li><li> 70％アルコール溶液で腹部を拭いてください。動物の正中線と右下の象限の位置を確認します。右下の象限に動物にEDU /生理食塩水を注入します。 </li><li> EDU /食塩水をマウスに注射し、時刻を記録します。 </li></ol></li><li>繰り返して、6日間連続して、一日の同じ時間に1.4から1.2を繰り返します。 注：EDUネガティブコントロールは、フローサイトメトリー分析のためにゲートを設定するために必要とされるように、付加的な年齢、性別を注入し、実験的に一致EDUのない等量の生理食塩水とエドマウス。これは、必要な制御（無EDU制御）を提供します。この制御は、設定の試薬およびサイトメーターのバッチの変動を可能にするために、すべての研究のために含まれるべきです。 </li></ol> 2.収穫ハーツ<ol><li> 6 番目の EDUの注射後24時間で、頸椎脱臼（または1内務省は、認可済みの代替スケジュール法）を用いてマウスを生け贄に捧げます。 </li><li>仰臥位で犠牲に動物を置き、手術用ハサミで振動板に半ば腹部から皮膚切開を行います。 </li><li>横隔膜をカットし、心臓を露出するために、左右カット、体腔から離れて胸骨を保持しています。 </li><li>少し心を持ち上げ、胸腔から心臓を解剖する流出路の主要な血管を切ります。 </li><li>すぐにPBSを4℃に冷やした10ミリリットルを含む個々の15​​mlの遠心管に各心を置きます。 </li><li> 9月に心を移し矢状方向に二​​つにそれぞれの心をカットメスを用いて、10センチメートルペトリ皿をarate、静かにピンセットで圧搾することにより心を洗います。そして、できるだけ多くの血液を除去するためにPBSを交換してください。二回、この手順を繰り返します。 </li><li>同じ個体1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブにそれぞれの心の両方の部分を置きます。 </li><li> 3または代替的に店舗標本に進み-80℃〜ステップ2.9と2.10で説明するように。 </li><li> 25 G針を使用して、心臓が処理されるときにマイクロ遠心チューブのふたに小さな穴が原因でガスの膨張開口部から蓋を防止することを可能にします。 </li><li>凍結し、液体窒素の容器に各マイクロチューブや場所にラベルを付けます。 </li></ol> 3.核解離および心筋細胞核のラベリング注：この核解離および心筋細胞核の標識はバーグマンらのものから適合されている11注入すべてのサンプルでこの手順を実行します。EDUと注入された生理食塩水（無EDU制御）を陰性対照と。これらの手順を実行するために必要なソリューションのレシピについては、 表1を参照してください。 <ol><li>各心臓を分析するために、30分間インキュベートし、超遠心チューブに1％BSA / PBS溶液36 mlで配置溶液を捨て、次いで空気乾燥さ許します。 注：このチューブはステップ3.6で使用されています。 </li><li>心はミンチ処理中に解凍することを可能にメスを用いて氷とミンチに10ミリメートル皿に個々の冷凍心を置きます。 </li><li> 50mlの遠心チューブに細胞溶解バッファーの15ミリリットルに刻んだ心を置き、室温で25,000 rpmで15秒間プローブホモジナイザーで均質化します。 </li><li>遠心チューブに細胞溶解バッファーのさらに15ミリリットルを追加し、大きなクリアランス乳棒で40ミリリットルダウンスに移します。乳棒で10ストロークを実行し、50ミリリットルの遠心分離管に100ミクロンを介して、その後40μmのセルストレーナーをフィルタリングします。 </li><li> 10分aの遠心分離機トン700 4℃でXG、上清を除去します。 </li><li>ショ糖勾配溶液25mlに核ペレットを再懸濁し、3.1で製造した超遠心管中で新鮮なショ糖勾配溶液10mlの上に溶液を含む細胞核をレイヤー。 </li><li>スイングアウトチューブローターを用いて4℃で1時間13,000×gで遠心分離します。 </li><li>遠心分離後、上清を捨て、1.5 mlのマイクロ遠心チューブやラベルPCM1に核蓄積バッファの1300μlの核ペレットを再懸濁します。 </li><li>新しいマイクロチューブに懸濁液の300μlのを削除し、新たな核格納用バッファの700μlに追加します。 ISOコントロールとしてこのチューブにラベルを付けます。 </li><li> PCM1ラベルされたマイクロチューブにミリリットル8μgの/の最終濃度で抗PCM1を追加し、ISO制御ラベルされたマイクロチューブに8μgの/ mlの濃度でウサギIgGアイソタイプコントロール抗体を追加します。 </li><li> 4℃で一晩インキュベートします。次のincubエーション、10分間、700×gで遠心分離器は、700×gで10分間、再び新鮮な核格納バッファ、再懸濁と遠心1mlで置き換え、上清を捨てます。上清を捨て、新鮮な核貯蔵緩衝液1mlと交換してください。 </li><li> 2μg/ mlの最終濃度を達成するためのF（ab &#39;）ヤギ抗ウサギIgG（H + L）抗体（FITCまたは同等の緑色蛍光色素）の2断片の1μlを添加します。 注：F（AB &#39;）を使用する2フラグメント抗体は、マクロファージ及びB細胞を含む免疫細胞の非特異的標識の可能性を低下させます。 </li><li>アルミホイルでラップ管は光から保護し、4℃で1時間インキュベートします。 </li></ol> EDU定款4.検出<ol><li>希薄10xが脱イオン水でEDU反応バッファー1:10に濃縮しました。 </li><li>遠心機PCM-1およびISO制御標識核懸濁液10分間700×gで、上清を廃棄し、1mlの核ペレットを再懸濁1％BSA / PBS溶液。二回の核ペレットを洗浄します。 </li><li>最後の洗浄後、上清を破棄し、EDU固定液100μlと交換してください。 </li><li>光から保護し、室温で15分間インキュベートするアルミホイルでチューブを包みます。 </li><li> 700×gで1％BSA / PBS溶液を、遠心1mlで二回サンプルを洗浄し、室温で15分間、1Xサポニンベースの透過溶液でインキュベートします。 </li><li> 1×EDUのラベリングカクテル（ 表2）を準備します。 2反応を最小にはEDU制御を含まないために必要とされます。 </li><li>既に1×サポニンベースの透過性溶液100μlに核を含む各サンプルに直接1xのEDUのラベリングカクテルの500μlを添加して、30分間、光から保護し、室温でインキュベートします。 </li><li> 1％BSA / PBSの1ミリリットルで700×gで再懸濁で遠心分離し、このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li> 700×gで遠心分離し、上清を破棄し、4と交換DNA染色溶液の00μlの（ 材料の表を参照してください）。 </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td></tr><tr><td> 1.細胞溶解バッファー </td></tr><tr><td> 0.32 Mスクロース</td></tr><tr><td> 10mMトリス - 塩酸（pH値= 8） </td></tr><tr><td> 5 mMのCaCl 2を</td></tr><tr><td> 5 mMの酢酸マグネシウム</td></tr><tr><td> 2.0 mMのEDTA </td></tr><tr><td> 0.5mMのEGTA </td></tr><tr><td> 1mMのDTT </td></tr><tr><td> 2.Sucroseグラデーションソリューション </td></tr><tr><td> 2.1 Mスクロース</td></tr><tr><td> 10mMトリス - 塩酸（pH値= 8） </td></tr><tr><td> 5 mMの酢酸マグネシウム</td></tr><tr><td> 1mMのDTT </td></tr><tr><td> 3.核蓄積バッファ（NSB） </td></tr><tr><td> 0.44 Mスクロース</td></tr><tr><td> 10mMトリス - 塩酸（pH値= 7.2） </td></tr><tr><td> 70のKCl </td></tr><tr><td> 10のMgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5ミリモルのスペルミン</td></tr></tbody></table> 表1： 核単離緩衝液成分プロトコルセクション3（核解離と心筋細胞核標識）で使用されるすべてのバッファのためのレシピ。 5.フローサイトメトリー分析注：以前に7,11,15説明したように、単離された核のフローサイトメトリーを実行します。 <ol><li>まず、破片（ 図2A）からの核の識別を可能にするために、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）を記述するプロットを作成します。 </li><li>高さ対）4をプロットすることにより、凝集体（ 図2B）から単核を識別するためのプロットを作成&#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）エリア（3から405/450/50 A）（33から405/450 / 50-H）。 thaのを確認してくださいトン3から405/50分の450-信号は、DNA含有量の正確な決意を可能にするために、リニアスケールで収集されます。 </li><li> 535分の488/30 A（PCM-1）SSC対を記述したプロットを作成し、一集団中のPCM-1発現を評価するために、5.2で作成した一重ゲートからイベントのみを表示します。 </li><li> PCM-1陽性ゲート（ 図2C）を確立するために、アイソタイプコントロールサンプルを実行します。 PCM1の少量を実行しPCM1表現する人口とゲート位置を確認するために、サンプルを標識しました。 </li><li> （DAPIを検出するために）450分の405/50 A対SSC-Aを説明するプロットを作成します。このプロットでは、5.3で作成されたゲートを使用して、核を表現するだけシングレットPCM1を表示します。のみ2N核（ 図2D）が含まれている追加の階層ゲートを作成するには、このプロットを使用してください。 </li><li>心筋細胞集団を表現するPCM1のEDU標識の同定を可能にするために1から633/20分の660-A対535分の488/30 Aを説明するプロットを作成します。一重である核のみを表示し、P<html>上記のゲーティングを使用して、CM1 +および2N。 </li><li> EDU正のゲート（ 図2E）を設定していないEDUコントロールから心臓サンプルを実行します。 EDU +細胞のための適切なゲートを作成します。 </li><li>録音し定量シングレット、EDUが組み込まれているPCM-1を発現する、2N核。 </li><li>合計一、PCM1 +核の割合として、この人口を計算します。これは、全心筋細胞核の割合として、7日EDUパルス期間中に、ネオ心筋細胞核発生速度を提供します。 注：DAPIがDNAに結合する蛍光強度はDNAの量に比例した化学量論的であるように。以前に7説明したように、450分の405/50信号の強度に基づいて、倍数性を決定します。 </li><li>総心筋細胞集団内の倍数性を評価するために5.5に設立され、プロットし、DNA濃度7に基づいて、ゲート戦略を使用しています。 </li></ol>/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg &quot;/&gt; 図2：心筋細胞EDUの取り込みと倍数性を定量化するためのゲーティング戦略 （A）核は前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）に基づいて破片から区別されます。 （B）線形ゲートが作成され、一核集団をDAPI標識と領域信号対405/450/50高さに基づいて特定されます。 （C）蛍光ゲーティングは心臓組織からの心筋細胞の核（PCM-陽性1）と非心筋細胞（PCM-1陰性）核の分離を可能にします。 （D）DAPI信号の強度は、DNA濃度およびPCM1 +心筋細胞集団のそれによって核倍数性を決定するために使用されます。マウスでは&gt;心筋細胞核の80％は、二倍体（2n個）です。 （E）蛍光ゲーティングは2Nを分離することができ、2NからEDU（PCM + / EDU + = 0.9％）に組み込まれている心筋細胞核、EDU（PCM + EDU-）に組み込まれていない心筋。すべてのステップは、プロトコル5.0で詳述されています。 MDXから示す例- 。C57 / BL10の背景に/ A yマウス<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

正確に心筋細胞のターンオーバーと再生アッセイを定量化するために、真の心筋細胞の生成と非生産的DNA分裂を区別する必要があります。多くの研究はもっぱらサイクリンキネシスと細胞周期マーカーの発現により心筋細胞の増殖を定量化する、単にこれらの非生産的なイベントを無視し続けています。これらの非生産的なイベントのために制御することがほのめかしたまま心筋細胞のターンオーバーの正確な定量化を可能にする単一のメソッドを今日まで。特に、心筋細胞のDNA複製13の65％〜最大寄与心筋細胞の倍数体を考慮することは難しいままです。したがって、心筋細胞の生成の正確な定量化を支援するために、我々は増加倍数性をもたらすDNA複製を排除しながらネオ心筋細胞核の割合の堅牢な定量化を可能にするプロトコルを開発しました。このプロトコルは、ネオ心筋細胞の属間で差別することはできませんがンおよび心筋二核は、心筋細胞の生成（倍数性を占める）の上限値を算出し、迅速かつ正確に使用することができます。このプロトコルは、したがって、疾患モデルにおける心筋細胞の発生と倍数体の速度の潜在的な変化を評価するために、または治療薬の潜在的な効率を評価するためのスクリーニングツールを提供しています。ネオ心筋細胞の核生成速度の変化は、このプロトコルを使用して同定されると心筋細胞核数の心筋細胞の生成の変化によるこの、以前に2,13,17,18に記載のようにあればその後の研究では確認するのに使用することができます。これらは、単核および多核心筋細胞集団にEDUの取り込みを比較することでEDUパルス動物から得られたパルス周期または組織切片の解析中に組織学的定量心筋細胞核ダイナミクスの使用を含みます。 心筋細胞のターンオーバーこの低レベルへプロトコルは、7日間にわたってEDUの複数回の注射を使用しています。これはまた、心筋細胞の生成のすべての潜在的な細胞源の &quot;追いかける&quot;と、この期間にわたって累積的な心筋細胞の核生成の定量化を可能にすることができます。研究によって、この時間枠は、心筋細胞の発生予測レベルに合わせて調節することができます。心筋細胞核におけるEDUの取り込みの正確な定量化のためには、PCM-1反応性を検出するために使用される二次抗体と核の非特異的標識が存在しないことが肝要です。したがって、このプロトコルで示唆した以外の二次抗体を使用する場合は特に、プロトコルのこの側面を最適化するために付加的な二次抗体を滴定実験を行うことが賢明であろう。ここで説明するプロトコルは、心筋細胞の核を識別するために、PCM-1の発現を使用しています。これは、確立された心筋細胞のマーカーであるが、代替的なマーカーは、検証するために使用することができデータ;これらは、心筋細胞核1に部分的にローカライズされたとして同定された心筋トロポニンTに対する特異的な抗体が含まれます。同様に、代替的な核局在化タンパク質は、心筋以外の核の集団にEDUの取り込みを同定および定量するために使用され得ます。このDNA合成の運命は未知であり、細胞分裂又は増加倍数性のいずれかをもたらすことができるように積極的に有糸分裂を受けているすべての心筋細胞核が、分析から除外されていることが重要です。 PCM1は、したがって、有糸分裂を受けた心筋細胞は、PCM1式によって識別されることはありません、細胞周期のM期の間に解体されています。加えて、細胞周期のS期における全ての核は、その後の分析から除外されるべきです。これは2Nと4N集団間のDAPI強度を有するものを含む2N人口上記DAPI強度で全ての核をゲートすることによって達成することができます。 それはますますあるが心臓が正常な老化と次の急性損傷時の心筋細胞を交換する能力を有することが認められ、この電位源と程度は依然として議論の余地があります。また、心筋細胞のターンオーバーの異種率が1,7,20-22を報告されています。これは、正確ネオ心筋世代19を識別し、定量化の困難に一部であってもよいです。大多数の研究とデートするには、心筋細胞のターンオーバーと更新2,4,23,24の定量化のために、筋節のタンパク質を含む、唯一の組織学的分析の使用および細胞質タンパク質の発現を介した心筋細胞の同定に依存してきました。これらの方法の使用は、増殖マーカーの発現を検出するため、またはここで示されているように、チミジン類似体の組み込みを容易に心筋のような他の心臓の細胞タイプの誤認をもたらすことができます。 3D共焦点イメージングの使用は、第これらの問題を軽減するのに役立つことができるがESEの方法は、高価で時間がかかります。興味深いことに、ここで説明するプロトコルは、ネオ心筋細胞の核生成は週に0.17パーセントの割合で発生示しています。これは、最大0.13％5の毎週の離職率を実証する他のフローサイトメトリーベースの研究と一致しています。それは以前の研究2,5,25,26のように、このデータに基づいて、年間離職率を推定することは魅力的ですが、離職率が動物13のライフタイム中に動的であるため、これは不適切です。 この方法は、心筋細胞の再生を増強するために潜在的な治療薬を評価または心筋細胞のターンオーバーと心筋細胞の倍数体の速度に心臓疾患の影響を調査するなど、潜在的なアプリケーションの数を持っています。

近年では、心臓が最終分化、有糸分裂後の臓器1,2であるという仮定に挑戦する証拠の蓄積がありました。しかし、心筋細胞のターンオーバーと再生の定量化は依然として厳しいです。 正確に、標準的な免疫組織化学的技術を使用して、希少な心筋細胞の生成を特定の難しさはよく3を報告しています。また、心筋細胞の世代の細胞源は、心筋細胞の増殖によってだけでなく、幹細胞の分化4-6の貢献のための証拠が不明です。したがって、心筋細胞前駆細胞表現型の知識を必要と系譜トレースモデルの使用が不可能と心筋細胞を含む単一集団、中の増殖の定量化され、不適切です。さらに、心筋細胞は、倍数体の車の中で得られた（核分裂せずに内部複製のための可能性を秘めていますdiomyocyte）または細胞質分裂（二核心筋細胞を生じる）7,8の不在下で核分裂。心筋細胞のターンオーバーの正確な定量化は、これらのイベントと真ネオ心筋世代区別する能力に依存しています。心筋細胞におけるDNA複製及びサイクリン依存性キナーゼの発現は、もっぱら真細胞分裂9,10を示さないので、これはユニークな合併症を作り出します。 バーグマンらによって記載されているようにネオ心筋細胞世代の定量化を支援するために、我々は、確立された核の分離技術、および心筋細胞核を識別するための中心体周辺物質1（PCM1）の免疫学的標識を組み合わせている。長期の新規な方法で7,11 DNA標識および倍数性分析。 PCM-1は、分化、非サイクリング筋細胞の核表面に蓄積中心体タンパク質です。以前の研究では、に対する抗体ことが実証されていますPCM-1は、具体的に心筋細胞核7,11と、このようなPCM1が心筋細胞1,12,13を識別するために、独立したグループの数によって使用されているようにラベルを付けます。さらに、我々はPCM1発現は、TNT CREトランスジェニックマウスモデル14（ 補足図1）における遺伝的に標識された心筋細胞の核にマップすることが実証されています。 同時に解析（ 図1CおよびD）からによる倍数体にヌクレオシド標識化を排除しながら、ここで説明されたプロトコルにかかわらず、携帯の起源（ 図1AおよびB）の、マウス心臓におけるネオ心筋細胞核の生成の正確かつ敏感な識別を可能にします。この方法は、心筋細胞の二核性のために制御することはできませんが、それは心筋細胞のターンオーバーの正確な定量化のために必要とされるネオ心筋細胞核の迅速かつ堅牢な定量化を可能にします。また、それは、心筋細胞の生成のダイナミクスの潜在的な変化を評価するための迅速なスクリーニングツールを提供しています。 DNAの標識化は、通常、チミジン類似体として、5-ブロモ-2&#39;-デオキシウリジン（BrdU）を含むが、ここで説明するプロトコルは、より迅速なため、より少ない処理工程を必要とする5-エチニル-2&#39;-デオキシウリジン（EDU）ベースのアッセイを使用して入れスルーと、免疫検出のためのDNAの変性、他の免疫染色のプロトコルと互換性作り、それによって方法の潜在的な下流のアプリケーションを増やす必要はありません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" /> 図1：EDU による連続パルス化は関係なく、それらの前駆細胞のネオ心筋細胞を標識します 。 （A）EDUは、細胞分裂の間に心筋細胞のDNAに組み込まれます。心筋細胞集団における増殖はresulます心筋細胞の中で増加、または交換におけるtとは、したがって、生産的なDNA合成は、（組織のメンテナンスや修理に貢献する）です。 （B）EDUは、細胞分裂の間に心臓前駆細胞のDNAに組み込まれます。これは、心筋細胞系譜への分化中の細胞内に保持されます。この幹細胞の分化はまた、心筋細胞の数の増加をもたらし、したがって、組織の維持および修復に寄与するであろう。 （C）心筋細胞は、心筋細胞肥大や心筋リモデリングに関連付けられている増加した心筋細胞の倍数性、結果として「非生産的」DNA複製を受ける可能性を持っていますが、失われた心筋細胞を置き換えるものではありません。それは2つの相同染色体（&gt; 2N）の4組以上含む単一の核を有する心筋細胞になるよう倍数体のプロセスは、二核性とは異なります。連続核Pに続いて（D）ulse、このプロトコルは、心筋細胞の倍数性とEDUの取り込みの両方の定量化を可能にするためにPCM1の発現による心筋細胞核の核の単離および同定を記載します。 PCM1発現とフローサイトメトリーを用いて検出されたEDUの取り込み。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>0.32 M スクロー</td>ス <td>Σ</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td>Σ</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl2</td><td>Σ</td><td>c5086</td><td></td></tr><tr><td>5 mM 酢酸マグネシウム</td><td>σ</td><td>M-5661</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td>Σ</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td>Σ</td><td>63779</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>Σ</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td>Σ</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM スペルミン</td><td>Σ</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>アイソタイプ ウサギ IgG- ChIP グレード</td><td>abcam</td><td>abc7415</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗 PCM-1 抗体</td><td>Σ</td><td>HPA023374</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 F(ab')2 ヤギ抗ウサギIgG(H+L)抗体のフラグメント&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>A-11070</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー&nbsp; 70 &mu;m と 100 &mu;m&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11597522、11517532</td><td></td></tr><tr><td>ガラスドンス(40 ml)および乳棒の大きなクリアランス</td><td>シグマ</td><td>D9188-1SET</td><td></td></tr><tr><td>EdU(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーA10044</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdUアレクサフロー647フローサイトメトリーアッセイキット</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーC10634</td><td>このキットに含まれるもの&nbsp;切片、EdU反応バッファーに必要な試薬、&nbsp;EdU固定剤、サポニンベースの透過化溶液、およびEdUラベリングカクテルに必要な試薬。</td></tr><tr><td>CyStain DNA 2ステップキット、</td><td>シスメックス パルテックス</td><td>05 5005</td><td>このキットに含まれる&nbsp; DAPI標識に必要な試薬(DNA染色液)</td></tr><tr><td>プローブホモジナイザー、例えば、TissueRuptor</td><td>Qiagen</td><td>9001273</td><td></td></tr><tr><td>TissueRuptor ディスポーザブルプローブ</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Sorvall&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facscanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ、薄壁、ポリプロピレン 38.5 ml、25 x 89 mm</td> ベ<td>ックマン・コールター</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

心筋細胞のdna合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

それは心臓が損傷後の心筋細胞を再生するための限られた可能性を秘めていると心筋細胞のターンオーバーの低レベルは正常な老化の間に発生することがことが認められているが、これらのイベントの定量化は依然として厳しいです。これは、プロセスの希少性と複数の細胞源は、心筋の維持に寄与しているという事実に一部です。さらに、心筋細胞内のDNAの複製は、多くの場合、倍数体、心筋細胞につながり、まれにしか細胞分裂によって新たな心筋細胞につながりません。正確にこれらのプロセス間の心筋細胞のターンオーバーの差別を定量化するためには不可欠です。ここで説明するプロトコルは、核の単離およびその後のPCM1の免疫標識を利用することによって同定されたDNAの複製および心筋細胞核の結果として発生したすべての核を標識するために、長期的なヌクレオシドラベリングを採用しています。一緒にこれはCのヌクレオシド標識の正確かつ敏感な同定を可能にします核人口をardiomyocyte。また、4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニル標識および核倍数性の分析は、倍数体の間ヌクレオシド組み込んだ核からネオ心筋細胞核の識別を可能にします。この方法は、心筋細胞の二核性のために制御することはできませんが倍数体を考慮しながら、それはネオ心筋細胞核の迅速かつ堅牢な定量化を可能にします。この方法は、心筋細胞の再生を増強するために潜在的な治療薬を評価または心筋細胞のターンオーバーと倍数性に心臓疾患の影響を調査するなど、下流のアプリケーションの数を持っています。この技法は、すべての心臓細胞型においてヌクレオシドの取り込みの定量化を可能にする付加的な下流の免疫組織学的技術と互換性があります。

増加倍数体のために制御しながら、この方法が原因心筋細胞核の分裂に増加EDUの取り込みの定量化を可能にします。 BrdUのベースアッセイを使用して、我々は以前に、哺乳動物の心臓が新しい心筋細胞の再生と、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのmdxマウスモデルにおいて、慢性心筋細胞の損失に応答することを実証しました。我々はさらに、当社の公開調査結果を検証するために、プロトコルの有用性を実証するために、ここで説明する方法を使用しています。記載されたプロトコルに従って、成人（12週齢） のmdxと制御BL10マウスは7日間EDUの1日1回の注射でパルスした、実験群5,13間の静的解析を可能にするために、以前に報告されました。パルス状の心の免疫組織学的分析は、EDU（ 図3A）に組み込まれている心筋細胞を表現PCM1の存在を示しています。しかし、データが取得usinEDUが組み込まれている他の細胞型は、心筋細胞と誤認することができるように、G免疫組織学的方法は、誤って解釈することができます。この例では補足図1A及びBに示されています。さらに、免疫組織学的方法は、原子力部門の倍数体を区別しません。倍数体にEDUを組み込まれた細胞を除外しつつ、このプロトコルで詳述フローサイトメトリー分析は、MDXと対照マウスでは心筋細胞の核分裂の急速な定量化を可能にします。以前に公表されたデータ13と同様に、分析は、コントロールと一致した年齢に比べてmdxマウス心臓におけるネオ心筋細胞核発生率の増加を明らかにした（0.17％に対し1.2％; 図3BおよびC）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" /> 図3： </strong&gt; EDUの定量化は、野生型および MDX 心の 中で心筋細胞を標識した 。MDX心の40μmの厚さの切片から取られたZ-スタック投影の（A）の画像。 PCM-1を発現する心筋細胞核EDU（赤）を組み込んでいる（緑）。黄色の矢印は、EDUは、心筋細胞を標識した示しています。 IおよびIIは、個々のEDUは、Z平面に示した心筋細胞を標識した示しています。 （ - C57 / BL10の背景に/ yの MDX）核はDAPI（青）（BおよびC）フローサイトメトリー、単離された核の流れ12-13週齢の野生型（C57 / BL10）とmdxマウスからの代表的なプロットを示すで標識しました。 （B）ヒストグラムは2Nと&gt; 2N核との間のDAPI強度や差別を示します。このプロトコルで詳述されるように分析した場合、2Nの心筋細胞核集団におけるEDUの取り込みを示す（C）プロット。すべてのマウスについてエドゥは1から1週間投与しました生後2週間。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 補足図1：PCM-1は、心筋細胞核の特異的マーカーであるプロトコルを使用するには、核がROSA NT / NG CRE敏感なレポーターライン16とTNT-CREマウス14を交配することによって生成さ二重トランスジェニックマウスから単離した説明しました。トロポニンT（TNT）プロモーターの制御下で、得られたマウスのCREの活性化では核に局在するとGFPの不可逆的な発現をもたらします。核はアイソタイプコントロール（ISO）で標識された心筋細胞核集団を（530分の488/30 A）を発現するGFPを特定する能力を示しています。抗PCM1（二次抗体633から660/20-Aによって検出される）との核の標識は、GFPを発現するcardiomyocyとPCM1発現の相関関係を示していますTE核人口。この例では、TNTのプロモーター活性によって識別されるように心筋細胞核の98.8パーセントは、PCM1抗体によって標識されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">補足図1をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> 補足図2： 免疫組織学的手法により心筋細胞の再生を定量化するための課題 （A）2DイメージもEDU（ ​​赤）のために標識されるように表示される2つのPCM-1を発現する心筋細胞の核（緑）を示しています。黄色の矢印は、EDUが組み込まれている心筋細胞と思われるものを示しています。これは、PCM1発現とEDUのラベリング2次元イメージングを用いて可視化の見かけの共局在化にあります。 （B）この画像の3次元投影は、EDUは、細胞が心筋細胞ではなく、PC上に重なる非心筋細胞である、標識を識別するM1は、心筋細胞の核を表現します。 C57 / BL10マウス実験のために使用生後12週で。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">補足図2Aをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">補足図2Bをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> 反応成分 </td><td colspan="2"> 反応数 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PBS </td><td> 875μlの</td><td> 2.19ミリリットル</td></tr><tr><td>銅の保護</td><td> 20μlの</td><td> 50μlの</td></tr><tr><td>蛍光色素ピコリルアジド</td><td> 5μlの</td><td> 12.5μlの</td></tr><tr><td>希釈した反応4.1で調製した緩衝液</td><td> 100μlの</td><td> 250μlの</td></tr><tr><td>全反応容量</td><td> 1ミリリットル</td><td> 2.5ミリリットル</td></tr></tbody></table> 表2：EDU カクテル成分 。プロトコルセクション4（EDUの取り込みの検出）に必要なEDUのラベリングカクテルのレシピ。

心筋細胞の代謝回転の定量化は困難です。ここで説明するプロトコルは、新心筋細胞の核生成と核倍数性の正確で高感度な定量を可能にすることにより、この課題に重要な貢献をします。

心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

Although it is accepted that the heart has a limited potential to regenerate cardiomyocytes following injury and that low levels of cardiomyocyte turnover ...

本プロトコルの全体的な目的は、長期的なヌクレオシド標識とフローサイトメトリーを用いて、核のポリプロイド化（多倍体化）を考慮しつつ、新生心筋細胞核を定量化することで、心筋細胞のターンオーバーを定量することです。この手法は、心筋細胞再生の分野における重要な課題に取り組むために利用でき、また、心筋細胞生成のダイナミクスの変化を定量化するためのスクリーニングツールとして活用できます。本プロトコルの主な利点は、細胞源にかかわらず、ポリプロイド化を制御しながら、新生心筋細胞の生成を感度良く正確に定量化できる点にあります。6回目のEdU投与から24時間後、処置した動物を仰向けに配置し、手術用ハサミを用いて腹部中央から横隔膜にかけて皮膚を切開します。次に、胸骨を体腔から両側に広げながら横隔膜を切断し、心臓を露出させます。その後、心臓を軽く持ち上げ、流出口の主要血管を切断して、心臓を胸腔から摘出します。採取後すぐに、4°Cに冷却した10 mLのPBSを含む個別の15 mL遠心チューブに心臓を入れます。次に、サンプルを個別の10 cmシャーレに移し、メスを用いて各心臓を正中矢状面に沿って2等分に切断します。続いて、ピンセットで心臓の断片を軽く圧迫します。心臓の2つの断片を取り出し、20 mLの新鮮なPBSが入ったペトリ皿に入れます。新しいペトリ皿と20 mLの新鮮なPBSを用いて、もう一度この操作を繰り返します。心臓の両方の部位を同じ1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れ、25ゲージの針を用いて各チューブの蓋に小さな穴を開けます。これは、心臓の処理時に蓋が開くのを防ぐためです。次に、各チューブにラベルを貼り、心臓組織を液体窒素容器内で凍結させます。分析する心臓1つにつき、1% BSAおよびPBSを36 mL、超遠心管に入れます。30分後にこの溶液を廃棄します。チューブが風乾したら、各チューブに10 mLのスクロース密度勾配溶液を加えます。液体窒素で凍結した心臓サンプルをメスで個別に細切し、各心臓から得られた組織片を、15 mLの細胞溶解バッファーを含む個別の50 mLコニカルチューブに移します。プローブ型ホモジナイザーを用い、室温にて25,000 rpmで15秒間、サンプルをホモジナイズします。次に、各チューブに溶解バッファーをさらに15 mL加え、サンプルを1つずつ、クリアランスの大きいペッスルを備えた40 mLのダウンスホモジナイザーに移します。ペッスルで10回ストロークし、細胞スラリーを100 µmのストレーナー、次いで40 µmのセルストレーナーでろ過し、個別の50 mL遠心チューブに回収します。その後、遠心分離により心核ペレットを回収し、細胞をそれぞれ25 mLのスクロース密度勾配溶液に再懸濁します。準備した超遠心管に、核を含まないスクロース密度勾配の上に細胞を積層し、スイングアウトローターを用いて遠心分離します。遠心分離後、核ペレットを1,300 µLの核保存バッファーで再懸濁し、PCM1とラベルした1.5 mLマイクロ遠心管に移します。PCM1チューブの懸濁液から各300 µLを新しいマイクロ遠心管に移し、700 µLの新鮮な核保存バッファーを加えて、ISO controlとラベルします。次に、PCM1核をanti-PCM1抗体で、ISOコントロール核をrapid IGG isotype control抗体で、4°Cで一晩ラベルします。翌日、サンプルを遠心分離し、ペレットを1 mLの新鮮な核保存バッファーに再懸濁して、同じ条件下で2回目の遠心分離を行います。2回目の遠心分離後、ペレットを1 mLの新鮮な核保存バッファーに再懸濁し、1 µLのfitzy結合 goat anti rabbit IgG F(ab'2)フラグメントとともに、4°Cの暗所にて1時間インキュベートします。EdUの取り込み度合いを評価するため、PCM1およびISOコントロールでラベル付けした核懸濁液を遠心分離し、1%BSA含有PBS 1 mLで2回連続で洗浄してペレットを再懸濁します。2回目の洗浄後、上清を100 µLのEdU固定液に交換し、室温・暗所にて15分間サンプルをインキュベートします。固定終了後、核を1 mLのPBS BSAでさらに2回洗浄し、その後100 µLのサポニンベースの透過化溶液を用いて室温でサンプルをインキュベートします。15分後、新鮮に調製したEdU標識カクテルを各チューブに500 µL加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション終了後、サンプルを3回遠心分離し、2回目と3回目の遠心時に1 mLのPBS BSAで核を洗浄します。最後に、400 µLのDNA染色液でサンプルを標識します。パルス刺激した心臓の免疫組織学的解析により、EdUを取り込んだPCM1発現心筋細胞の存在が示されます。しかし、免疫組織学的な手法で得られたデータは、EdUを取り込んだ他の細胞型が心筋細胞と誤認される可能性があるため、誤解を招く恐れがあります。mdxマウスおよび対照マウスを用いた研究において、本プロトコルで詳述するフローサイトメトリー解析により、脱ポリプロイド化のためにEdUを取り込んだ細胞を除外しながら、新生心筋細胞核の生成を迅速に定量することが可能になります。以前に公表されたデータと同様に、この代表的な実験において、年齢を一致させた対照群と比較して、mdxマウスの心臓における新生心筋細胞核の生成率の上昇が観察されました。この手法に習熟すれば、2日間にわたって合計4時間で完了させることができます。この手順を実施する際は、解析時にゲートを正確に設定できるよう、EdUおよびPCM1の両方のネガティブコントロールを必ず準備することが重要です。この手法は、多くの追加的なダウンストリーム免疫組織学的手法とも併用可能であり、さまざまな心臓細胞型における核細胞の取り込みを定量化することができます。この手法は心血管研究の分野において、非虚血性心筋症のmdxモデルにおける心筋細胞再生の変化を研究するために用いられてきました。このビデオを視聴することで、新生心筋細胞核を迅速に定量化する方法や、心筋細胞の再生およびターンオーバーの変化をスクリーニングするために倍数化のカウントを観察する方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞におけるカルシウムおよび収縮性パラメータのリアルタイム測定

学ぶ心筋細胞再生の定量化法。長期ヌクレオシド標識とフローサイトメトリーを用いて、DNA合成と倍数性を同時評価し、心筋細胞新生を正確に測定します。再生医療研究に有用です。

心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

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