心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

このプロトコルの全体的な目標は、長期ヌクレオシド標識とフローサイトメトリーを使用して心筋細胞の代謝回転を定量化し、核の倍数体化を考慮しながら新心筋細胞の核を定量化することです。この方法は、心筋細胞再生の分野における重要な問題に対処するために使用でき、心筋細胞生成のダイナミクスの変化を定量化するためのスクリーニングツールとして使用できます。このプロトコルの主な利点は、細胞源や倍数体の制御に関係なく、新心筋細胞の生成を高感度かつ正確に定量化できることです。

6回目のEdU注射の24時間後、治療した動物を仰臥位に置き、手術用ハサミを使用して腹部中央部から横隔膜までの皮膚切開を行います。次に、胸骨を体腔から離して、横隔膜を両側に切断して心臓を露出させます。次に、心臓を少し持ち上げ、流出路の主要な血管を切断して、胸腔から心臓を解剖します。

収穫後すぐに、心臓を摂氏4度に冷やしたPBS10 mLが入った個々の15 mL遠心分離チューブに入れます。次に、サンプルを個々の10cmのシャーレに移し、メスを使用して各心臓を矢状方向に2つに切断します。次に、鉗子でハートピースをそっと絞ります。

両方のハートピースを取り出し、20mLの新鮮なPBSが入ったシャーレに入れます。新しいシャーレと20mLの新鮮なPBSでもう一度繰り返します。心臓の両方の部分を同じ1.5mLの微量遠心チューブに入れ、25ゲージの針を使用して各チューブの蓋に小さな穴を開け、心臓が処理されたときに蓋が開かないようにします。

次に、各チューブにラベルを付け、液体窒素の容器で心臓組織を凍結します。分析する各心臓について、1パーセントBSAおよびPBSの36 mLを超遠心チューブ内でインキュベートします。30分後に溶液を廃棄します。

チューブが風乾したら、各チューブに10 mLのショ糖勾配溶液を追加します。液体窒素凍結心臓サンプルをメスで個別にミンチした後、各心臓の組織片を15 mLの細胞溶解バッファーを含む個々の50 mLコニカルチューブに移します。サンプルを25, 000 rpmで15秒間均質化し、プローブホモジナイザーを室温で使用します。

次に、さらに15 mLの溶解バッファーを各チューブに加え、サンプルを一度に1つずつ、大きなクリアランス乳棒で40 mLのオンスに移します。乳棒で10回のストロークを行い、100ミクロンのストレーナーで細胞スラリーをろ過し、続いて40ミクロンの細胞ストレーナーで個々の50 mL遠心分離チューブにろ過します。次に、遠心分離によって核心臓ペレットを回収し、細胞をそれぞれ25 mLのショ糖勾配溶液に再懸濁します。

調製した超遠心チューブ内の核を含まないショ糖勾配の上に細胞を層状にし、スイングアウトチューブローターを使用して層を遠心分離します。遠心分離に続いて、核ペレットを1,300マイクロリットルの核貯蔵緩衝液に再懸濁し、核をPCM1と標識された1.5mLの微量遠心チューブに移します。各懸濁液の300マイクロリットルをPCM1チューブから新しいマイクロ遠心チューブに移し、700マイクロリットルの新鮮な核貯蔵バッファーを追加し、ISOコントロールをラベル

次に、PCM1核を抗PCM1抗体で標識し、ISOコントロール核を迅速IGGアイソタイプコントロール抗体で摂氏4度で一晩標識します。翌日、サンプルをスピンダウンし、ペレットを1 mLの新鮮な核保存バッファーに再懸濁して、同じ条件下で2回目の遠心分離を行います。2回目のスピン後、ペレットを1 mLの新鮮な核保存バッファーに再懸濁し、ヤギ抗狂犬病IGG抗体由来の適性結合F(ab'2フラグメント1マイクロリットルと核をインキュベートします。暗所で摂氏4度で1時間インキュベートします。

EdUの取り込み度を評価するには、PCM1およびISOコントロールで標識された核懸濁液を遠心分離し、ペレットを1 mLの1%BSA PBSに再懸濁して2回連続して洗浄します。2回目の洗浄後、上清を100マイクロリットルのEdU固定液と交換し、サンプルを室温で暗所で15分間インキュベートします。固定終了時に、核を1 mLのPBS BSAでさらに2回洗浄し、サンプルを100マイクロリットルのサポニンベースの透過化溶液と室温でインキュベー

15分後、500マイクロリットルの作りたてのEdUラベリングカクテルを各チューブに加えて、室温で30分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、サンプルを3回スピンダウンし、2回目の遠心分離で1 mLのPBS BSAで核を洗浄します。最後に、400マイクロリットルのDNA染色溶液でサンプルを標識します。

パルス心臓の免疫組織学的分析は、EdUを組み込んだPCM1発現心筋細胞の存在を示しています。しかし、免疫組織学的方法を用いて得られたデータは、EdUを組み込んだ他の細胞種が心筋細胞と誤認される可能性があるため、誤って解釈される可能性があります。mdxおよび対照マウスの研究では、このプロトコルで詳述されているフローサイトメトリー分析により、新心筋細胞の核生成を迅速に定量化しながら、EdUを脱倍数化に組み込んだ細胞を除外することができます。

以前に発表されたデータと同様に、この代表的な実験では、年齢を一致させた対照と比較して、mdxマウスの心臓における新心筋細胞の核生成速度の増加が観察されました。このテクニックを習得すると、2日間で4時間で完了することができます。この手順を実行するときは、解析中にゲートを正確に設定できるように、EdUとPCM1の両方のネガティブコントロールを覚えておくことが重要です。

この技術は、多くの追加の下流免疫組織学的技術とも互換性があり、多くの異なる心臓細胞タイプにおける核細胞の取り込みを定量化することができます。この手法は、非虚血性心筋症のmdxモデルにおける心筋細胞再生の変化を研究するために、心血管研究の分野で使用されています。このビデオを見た後、新心筋細胞の核を迅速に定量化する方法を十分に理解し、倍数性のカウントを見て心筋細胞の再生とターンオーバーの変化をスクリーニングする方法を理解できるはずです。