HPLC測定に基づいて近赤外分光法によるブルーベリーにおける成分含量の非破壊予測のためのモデルの構築

この手順の全体的な目標は、近赤外分光法により、個々のブルーベリーの総糖、全有機酸、および総抗シアニン含有量の非破壊予測モデルを構築し、検証することです。この手法は、果物や野菜などの農産物の評価分野における重要な問題に答えるものです。私にとって、この手法の利点は、多くの製品を分光法で非破壊でチェックできることです。

そして、ここに示す手順で構築されたモデル。近赤外分光法は、農産物の非破壊評価のための強力なツールです。予測モデルは、各ターゲットの化学分析によって決定された内容とスペクトルとの相関を調べることによって構築されます。

この手順を実演するのは、私の研究室の卒業生である木村祐介さんと、このプロトコルの著者の一人である大学の崔静彦さんです。対象品種から十分な数とさまざまな種類のサンプルブルーベリーを収集します。キャリブレーションモデルの構築のために、できれば100個のブルーベリーを収集します。

また、構築されたモデルの検証には少なくとも 10 個あります。ロバストなモデルを構築するには、さまざまな色、サイズ、さまざまな熟成条件など、さまざまな種類のサンプルを収集します。各ブルーベリーの重さを量ります。

測定された重量は、後で各ブルーベリーの成分の含有量パーセントの計算に使用されます。次に、近赤外分光光モーターの窓の中央にブルーベリーのサンプルを置き、拡散反射率を測定します。sample single channelコマンドを使用して、各ブルーベリーのスペクトルを測定します。

できれば果物のいくつかのポイントで。ブルーベリーは、スペクトル測定の直後に分析しない場合は、マイナス30°C以下で冷凍庫に保管してください。前処理を開始するには、ブルーベリーをいくつかの部分にカットして、簡単に均質化できるようにします。

ブルーベリーを冷凍時に解凍せずにカットします。ピースを50ミリリットルのビーカーに入れます。ビーカーに約10ミリリットルの超純水を加えます。

カットしたブルーベリーを超純水で電子レンジで20秒間加熱し、分析中に糖を分解する可能性のある酵素を不活性化します。ビーカーに約10ミリリットルの超純水を加えます。混合物を12, 000 RPMで5分間均質化し、標準シャフトと発電機を装備したホモジナイザーを使用します。

均質化された混合物を3, 000 RPMで10分間遠心分離します。次に、5つのBペーパーフィルターを使用して遠心分離されたサンプルの真空ろ過によりろ液を収集します。均質化のステップを2回繰り返した後、濾液のpHを測定し、希塩酸と水酸化ナトリウムの希水溶液で7に調整します。

濾液を超純水で50ミリリットルに希釈します。サンプルを2つに分けます。1つは糖の分析用、もう1つは有機酸の分析用です。

最初のサンプル溶液を直列に接続されたカラムに通し、顔料、陽イオン、陰イオンを除外します。サンプル溶液の最初の1ミリリットルをカラムから捨てます。次に、カラムからのサンプル溶液を使用して、高速液体クロモトグラフィーまたはHPLCによる糖の分析を行います。

HPLCによる分析の前に、ミニ遠心分離機を備えた0.445ミクロンフィルターを装備したマイクロチューブ内で、6, 600RPMで10分間溶液を遠心分離します。カラムオーブン内のゲル浸透カラムを使用して、摂氏40度のHPLCシステムを配置します。溶離液には、毎分0.1ミリリットルの流量で脱気した超純水を使用してください。

また、屈折率検出器も使用してください。標準溶液のHPLCスペクトログラムを測定するには、測定ごとに20マイクロリットルのアリコートを注入します。ここでは、測定にパックされたソリューションソフトウェアが使用されます。

各標準溶液のクロマトグラム上の糖バンドの面積強度を取得するには、マウスの右ボタンで再分析をクリックします。次に、対応する濃度に対する面積強度を差し込んで、線形回帰によって各糖の作業曲線を取得します。この曲線から、各糖について面積強度と濃度の関係を表す方程式が得られます。

標準曲線を取得した後、各測定ごとに20マイクロリットルのアリコートを注入して、サンプル溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。前回と同様に、各サンプル溶液のクロマトグラム上の糖のバンドの面積強度を取得します。有機酸のHPLC測定の実施手順については、テキストプロトコールを参照してください。

ブルーベリーは、スペクトル測定の直後にアントシアニンを分析しない場合は、マイナス80°C未満で冷凍庫に保管してください。アントシアニンのHPLC測定の前処理を行うには、各冷凍果実を真空凍結装置で12時間乾燥させます。乾燥ブルーベリーからトリフルルオセチン酸の1パーセントメタノール溶液でアントシアニンを抽出し、混合物を摂氏4度の冷蔵庫に12時間放置します。

抽出物を2ミリリットルのマイクロチューブで15分間遠心分離し、超遠心分離機を使用してマイナス8°C、15, 000RPMで遠心分離します。次に、0.45ミクロンフィルターで抽出物をろ過し、HPLC測定用のサンプルを取得します。C18逆相カラムを使用して、摂氏40度のカラムオーブンでHPLCシステムを配置します。

0.1%のトリフルオロ酢酸水をLUNAとして使用したグラジエント法を適用します。また、LUNBとしてアセトニトリルに0.5%のトリフルオロ酢酸が含まれています。1分あたり0.1ミリリットルの流量を使用し、注入後ゼロから50分の間にLUNBの比率が8%から15%に増加します。

そして、注射後50〜60分で15%から75%まで。520ナノメートルでモニタリングするフォトダイオードアレイ検出器を使用します。標準溶液のHPLCスペクトログラムを測定するには、測定ごとにオートサンプラーに10マイクロリットルのアリコートを注入します。

測定にはLCソリューションソフトウェアを使用してください。最後に、各測定にオートサンプラーを介して10マイクロリットルのアリコートを注入することにより、サンプル溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。この時点で、成分含有量を予測するためのキャリブレーションモデルの構築と、それに続くこれらの構築されたモデルの検証は、テキストプロトコルに記載されているように実行されます。

予測モデルは、観測されたスペクトルと、ここに示す手順で決定された成分含有量を使用して構築されます。ここでは、総糖度を予測するために構築されたモデルの交差検証の結果の例を示します。近赤外分光法で予測された値とHPLCで求められた値との相関関係は十分です。

同様の結果は、総アントシアニン含有量のモデルの交差検証でも観察されます。ここでも、予測値と観測値との間の相関関係は満足のいくものです。このビデオを見た後、HPLCでブルーベリーの含有量の以前の値を取得する方法をよく理解しているはずです。

破壊化学分析で測定されたプリセット内容に基づいて適切に構築されたモデルを使用することによってのみ、異なる評価が可能になります。つまり、これまでのターゲットの化学分析では、高性能な予測モデルを構築するのは謎であるということです。この動画で紹介されていない予測モデルの構築手順については、テキストプロトコルを参照してください。

適切に構築されると、予測用のモデルは、砂糖、有機酸、およびブルーベリーの任意の含有量の予測に適用できます。ここに示すように、近赤外分光法は、多くの種類の農産物の相関に適用できると期待されています。近赤外分光法を農産物の評価に適用する場合、優れたモデルを構築するためには、化学分析を通じてコンテンツの事前設定された障壁を取得する必要があることを忘れないでください。