Name: HPLC測定に基づいて近赤外分光法によるブルーベリーにおける成分含量の非破壊予測のためのモデルの構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶ ブルーベリーの総糖、有機酸、アントシアニン含量を近赤外分光法で非破壊予測するモデル構築法。HPLC測定との相関から品質評価モデルを構築し、農産物の迅速な品質管理に応用できます。

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この作業は、日本の農林水産省のプロジェクト「高度な先端技術の展開による被災地の農業と漁業の活性化スキーム」によって部分的に支援されました。

サンプルの1コレクション<ol><li>キャリブレーションモデルの対象に含まれるかを品種を決定します。 </li><li>十分な数と対象品種のサンプルブルーベリーの様々な種類を収集します。 <ol><li>構築したモデルの検証のために、好ましくは100キャリブレーションモデルの構築のためのブルーベリー、少なくとも10を収集します。強固なモデルを構築するために、様々な色、サイズ、および様々な熟成条件にして、すなわち 、様々なタイプのサンプルを収集します。 </li></ol></li><li>各ブルーベリーを計量。注：測定された重みは、各ブルーベリーの成分の含有率の計算のために後で使用されています。 </li></ol>スペクトルの2.測定<ol><li>ウォームアップの測定の前に分光光度計十分に（1時間以上）は、信頼性の高いスペクトルを取得します。 </li><li>分光光度計を設定します。条件はすべての測定を通じて一定であることを確認してください。アン測定のための典型的な条件の例を以下に示します。 <ol><li> 12,500-3,600 cmの測定値の範囲を設定-1。 </li><li> 16センチメートルにスペクトル分解能を設定-1。 </li><li> 32回に蓄積するのを設定します。 </li></ol></li><li>測定のモードとして拡散反射率を選択します。 </li><li>拡散反射率測定のための分光光度計の窓に標準反射板を置きます。 「背景単一チャネル」コマンドを使用して、自動的に後に測定試料ブルーベリーのスペクトルからの相対的な反射スペクトルの計算に使用されているバックグラウンドスペクトルを測定します。 </li><li>拡散反射率測定のための分光光度計のウィンドウの中央にブルーベリーのサンプルを置きます。 「サンプル単一チャネル」コマンドを使用することにより、好ましくは果実のいくつかの点で、各ブルーベリーのスペクトルを測定します。 注：クベルカ-ムンク変換6,7はまた、自動実行されますmaticallyスペクトル取得の条件がそうするように設定されている場合、サンプルブルーベリーの観測スペクトルのため。クベルカ - ムンク変換は、透過モードで測定し、高精度なスペクトルの分析に必要とされるものと同等のスペクトルを拡散反射モードで測定したスペクトルを変化させます。吸光度規模のスペクトルを分析するために使用されます。 </li><li>ブルーベリーのサンプルのスペクトルは、いくつかの点で測定された場合、MS Excelなどのデータ処理プログラムを使用して、各試料のスペクトルの平均スペクトルを計算します。分析のための平均スペクトルを使用してください。 </li></ol>糖および有機酸8のHPLC測定のための3の前処理注：次のように超純水を用いて、水溶性である糖および各ブルーベリーの有機酸を抽出します。各ブルーベリーの全体を分析するために使用されます。 <ol><li> FO -30°C準備以下の冷凍庫でブルーベリーを保ちます彼らはちょうどスペクトル測定後に分析されていない場合はr個の化学分析します。 </li><li>それは簡単に以下の手順で均質化することができるように、いくつかの断片にブルーベリーをカット。それが凍結されたときに解凍せずにブルーベリーをカットします。 </li><li> 50ミリリットルのビーカーに作品を配置。 </li><li>約を追加超純水をビーカーに（その電気伝導度が0.1未満μS/ cmである蒸留水）の10ミリリットル。 </li><li>分析中の糖を分解する可能性がある酵素を不活性化するために20秒間電子レンジ内の超純水でカットブルーベリーを加熱します。 </li><li>ビーカーに約に超純水10mlを追加します。 </li><li>標準軸と発電機を装備したホモジナイザーを用いて12,000rpmで5分間、混合物を均質化します。 </li><li>遠心分離を3,000rpm（2,000×g）で10分間均質化した混合物。 </li><li>図5Bの濾紙を用いて遠心分離し、試料を真空ろ過によりろ液を収集します。 </li><li>日に二回のステップ3.6から3.9を繰り返しますE濾過残渣は、すべての糖および有機酸を収集し、すべてのろ液を組み合わせます。 </li><li>濾液のpHを測定し、希塩酸（0.1と0.01モルL -1）で7に調整し、水酸化ナトリウム（0.1〜0.01モルL -1）の水溶液を希釈します。 </li><li>超純水で50mlにろ液を希釈します。 </li><li> 2に試料を分割し、有機酸の分析のための糖および他の分析のための1つ。 </li><li>顔料、カチオン、およびアニオンを除外するように直列に接続された列〜第試料溶液（2 C18、CMとQMA）を渡します。カラムからの試料溶液の最初の1ミリリットルを捨てます。その後、HPLCによる糖の分析のための列からの試料溶液を使用しています。 </li><li>顔料およびカチオンを排除するために直列に接続されたカラムを介して第2の試料溶液（二C18及びCM）を渡します。カラムからの試料溶液の最初の1ミリリットルを捨てます。次にCからのサンプル溶液を使用HPLCによる有機酸の分析のためolumns。 </li><li>遠心分離HPLCによる分析の前にミニ遠心機で0.45μmのフィルターを備えたマイクロチューブ中で10分間、6600 rpmで（5800×g）でステップ3.14と3.15からの各ソリューション、。 </li></ol>糖の4 HPLC測定注：この研究では、各ブルーベリーのスクロース、グルコースおよびフルクトースの合計含有量は、総糖含量とみなされます。したがって三糖類の各々についての検量線は、最初に取得され、その後それぞれのブルーベリー中の糖の合計含有量が得られます。標準的な内容は、0.3から0.4重量％（ショ糖）、3.8から4.8重量％（グルコース）、および4.2から5.3重量％（フルクトース）として報告されている。9 <ol><li>正確スクロースの約200mgを測定し、標準溶液を調製し50mlの超純水に溶解させます。第二の標準溶液を調製するために超純水で50mlに溶液5mlを希釈します。 3と同様のスタンドを準備第二の標準溶液からARDソリューション。 </li><li>同様に、ブドウ糖と果糖の標準溶液を調製します。 </li><li>次のようにHPLCシステムをアレンジ： <ol><li> 40℃のカラムオーブンでゲル浸透カラムを使用してください。 </li><li>溶出液0.1 ml /分の流速で脱気した超純水を用います。 </li><li>屈折率検出器を使用してください。 </li></ol></li><li>各測定のための20μlのアリコートを注入することにより、標準溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。注：ここでは、PAC溶液を測定するためのソフトウェアとして使用されています。 </li><li>マウスの右ボタンで「再分析」をクリックして、各標準溶液のクロマトグラムの糖のバンドの面積強度を取得します。 </li><li>式は面積強度との関係を示す濃度がfoが得られる場合、線形回帰によって各糖のための検量線を得るために、対応する濃度に対して面積強度をプロット各糖rを。 </li><li>各測定のための20μlのアリコートを注入することにより、試料溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。 </li><li>以前にステップ4.5で説明したように、各試料溶液のクロマトグラム上の糖のバンドの面積強度を取得します。 </li><li>ステップ4.6で得られた検量線に対応する方程式を用いて、溶液中の糖の濃度を得ます。 </li><li>前のステップと、試料溶液の全体積で得られた試​​料溶液の濃度から各ブルーベリー中の各糖の量を取得する（50mlのステップ3.12参照）。 </li><li> 3糖類の内容を合計することによって、各果実の全糖量を取得します。 </li><li>ステップ1.3で測定した重量を使用して、各ブルーベリーの全糖の含有量のパーセントを取得します。 </li></ol>有機酸の5 HPLC測定注：この研究では、クエン酸、キナ酸の合計含有量、リンゴ酸、およびコハク酸は、有機酸総含有量とみなされます。したがって、4個の有機酸のそれぞれのための検量線は、最初に取得され、その後それぞれのブルーベリー中の有機酸の含有量を測定します。標準的な内容は、0.42から0.62重量％（クエン酸）、0から0.15重量％（キナ酸）、0.08から0.23重量％（リンゴ酸）、および0.06から0.25重量％（コハク酸）として報告されている。9 <ol><li>正確クエン酸約5mgを測定し、標準溶液を調製し、50mLの超純水にそれを溶解します。第二の標準溶液を調製するために超純水で50mlに溶液5mlを希釈します。同様に、第二の標準溶液から三番目の標準液を調製します。 </li><li>同様に、キナ酸、リンゴ酸、コハク酸の標準溶液を準備します。 </li><li>次のようにHPLCシステムをアレンジ： <ol><li> 40℃のカラムオーブン内で直列に接続された2つの陰イオン交換カラムを使用します。 </li><li>使用は、リンの0.1％水溶液を脱気溶出液として0.02 ml /分の流速で酸。 </li><li> 210 nmに設定紫外可視検出器を使用してください。 </li></ol></li><li>各測定用標準溶液の20μlのアリコートを注入することにより、標準溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。 </li><li>マウスの右ボタンで「再分析」をクリックして、各標準溶液のクロマトグラム上の有機酸のバンドの面積強度を取得します。 </li><li>面積強度と濃度との関係を表す式は、各有機酸のために得られる線形回帰により、各有機酸のための検量線を得るために、対応する濃度に対して面積強度をプロットします。 </li><li>各測定用サンプルの20μlのアリコートを注入することにより、試料溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。 </li><li>ステップ5.5で前述したように、各試料溶液のクロマトグラム上の有機酸のバンドの面積強度を取得します。 </li><li>ステップ5.6で得られた検量線に対応する方程式を用いて、溶液中の有機酸の濃度を得ます。 </li><li>前のステップと、試料溶液の全体積で得られた試​​料溶液の濃度から各ブルーベリーの各有機酸の量を取得する（50mlのステップ3.12参照）。 </li><li> 4有機酸の含有量を合計することによって、各ブルーベリー中の全有機酸の量を取得します。 </li><li>ステップ1.3で測定した重量を使用して、各ブルーベリーの全有機酸の含有量のパーセントを取得します。 </li></ol>アントシアニンのHPLC測定のための6の前処理<ol><li>彼らはちょうどスペクトル測定後に分析されていないときは、化学については、以下の-80°C準備ができて冷凍庫にブルーベリーを保つ分析します。 </li><li> 12時間真空凍結乾燥機を用いて、各冷凍果実を乾燥させます。 </li><li> 1％メタノール溶液のOで乾燥ブルーベリーからアントシアニンを抽出Fトリフルオロ酢酸【ブルーベリーの重量（g）の溶液/体積（ミリリットル）= 1/10] 12時間4℃で冷蔵庫に混合物を残すこともできます。 </li><li>遠心分離機で-8℃と15,000回転（21,900×gで）°超遠心機を使用して、2ミリリットルマイクロチューブ中で15分間抽出。 </li><li> HPLC測定のためのサンプルを取得するために、0.45μmのフィルターを通して抽出液をフィルタリングします。 </li></ol>アントシアニンの7. HPLC測定注：約13種類のアントシアニンがブルーベリーに含まれています。それはすべてのアントシアニンの作業曲線を取得することは困難であるため、唯一のシアニジン-3-グルコシドOの塩化物、ブルーベリーの中で最も人気のあるアントシアニンのための検量線が得られます。検量線は、他のアントシアニンのおおよその定量に適用されます。 <ol><li>正確シアニジン-3-グルコシドO塩化約1.5 mgの測定、およびPRのトリフルオロ酢酸の1％メタノール溶液10ml中に溶解標準溶液をepare。第二の標準溶液を調製し、トリフルオロ酢酸の1％メタノール溶液で10mlに溶液5mlを希釈します。同様に、第3および第4の標準的なソリューションを順次用意しております。 </li><li>次のようにHPLCシステムをアレンジ： <ol><li> 40℃のカラムオーブンでC18逆相カラムを使用してください。 </li><li> 0.1ml /分の流速でアセトニトリル（溶出液B）を、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液（溶出液A）および0.5％トリフルオロ酢酸の溶出液を用いた勾配法を適用する場合、8％から15％の溶出液Bの増加の割合注射後50〜60分の間に注射後、および15％〜75％、0〜50分の間。 </li><li> 520 nmでフォトダイオードアレイ検出器の監視を使用します。 </li></ol></li><li>各測定のための10μlのアリコートを注入することにより、標準溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。 「LCソリューションは、「測定のためのソフトウェアとして使用されています。 </li><li>のバンドの面積強度を取得マウスの右ボタンで「再分析」をクリックして、各標準液のクロマトグラム上シアニジン-3- Oのグルコシド塩化。 </li><li>面積強度と濃度との関係を表す式はシアニジン-3-グルコシドO塩化に対して得られる線形回帰によってシアニジン-3-グルコシドO塩化ための検量線を得るために、対応する濃度に対して面積強度をプロットします。 </li><li>各測定のための10μlのアリコートを注入することにより、試料溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。 </li><li>以前にステップ7.4で説明したように、各試料溶液のクロマトグラム上の各アントシアニンのバンドの面積強度を取得します。 </li><li>ステップ7.5で得られた検量線に対応する式を用いて溶液中のアントシアニンの濃度を得ます。 </li><li>以前に得られた濃度から各ブルーベリーの各アントシアニンの量を取得ステップステップ6.3で使用される試料液の総体積。 </li><li> 13アントシアニンの内容を合計することによって、各ブルーベリーアントシアニンの総量を取得します。 </li><li>ステップ1.3で測定した重量を使用して、各ブルーベリーの総アントシアニンの含有量のパーセントを取得します。 </li></ol>成分量の予測のためのキャリブレーションモデルの8建設注：PLS回帰、潜在バリアントを使用して複数の回帰技術の一種である4,5を 、観測されたスペクトルおよび化学分析によって決定される成分の内容から各成分のためのキャリブレーションモデルの構築に使用されています。 PLS回帰は、市販のプログラムで、または自家製のプログラムのいずれかで行われます。モデルの構築の詳細な処理のための参考文献5,10を参照してください。 <ol><li>観測されたスペクトルのための前処理が正確に最も効果的である調べ、堅牢な予測。 <ol><li>以下の前処理の1または2を適用することにより、キャリブレーションモデルを構築：MSC（乗法散乱補正）、1,2,5 SNV（標準正規変量）、1,2,5 MMN（最小・最大正規化）、COE（定数オフセット除去）と、第1またはSG（サビツキー-ゴーレイ）法により第2の微分計算。1,2,5を構築したモデルで、そのスペクトルから設定検証の成分量を予測します。 注：最小値と最大値がそれぞれ0および1、となるようMMNにおいて、スペクトルは正規化されます。最小値がゼロになるようにCOEでは、スペクトルの縦軸がずれています。 </li><li>観察と観測されたスペクトルが最も効果的であるために前処理する調べるために検証セットの予測値との間で、決意、R 2、および残留予測偏差、RPDの係数を計算します。大きい与える前処理の組み合わせを選択してくださいR 2およびRPD。 </li></ol></li><li>効果的な領域を検索するために、波数領域は、例えば、適用することにより、正確かつ堅牢な予測に有効である移動窓のPLS法11を調べます。 注：手順は、スペクトルは予測に有効な情報が含まれていないか、予測を妨害する情報が含まれている波数領域を除去に相当します。 </li></ol>構築キャリブレーションモデルの9.検証注：構築されたモデルの検証の詳細な処理のための参考文献5,10を参照してください。 <ol><li>前処理の予測のための効果的な波数領域のための最高の組み合わせで構成されたキャリブレーションモデルとのスペクトルから検証セットの成分内容を予測します。5,10 </li><li>観察と予測との間のR 2及びRPDを計算検証セットの値。5,10 </li><li>一般的なキャリブレーションモデルの実用性能の基準、12,13 R 2&gt; 0.85とRPD&gt; 2.5かどうかを調べ、満足しています。基準が満たされない場合は、モデルの再構築を検討してください。 </li></ol>

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開示するものは何もありません。

プロトコル上のいくつかの追加のコメントがここで説明されています。まず、ステップ1.1においては、ターゲットに含まれる品種を決定するために記載されています。それは多くの品種から、または品種を指定せずにブルーベリーをカバーするモデルを構築することが可能であるが、モデルとの予測精度は、時々、単一品種のため、限られた品種のモデルのものよりもはるかに低いです。また、キャリブレーションモデルは、異なる生産現場で回収ブルーベリーが予測性能に影響を与える異なる特性を有するため、高い予測性能を得るために各生産拠点からブルーベリーのために構成されるべきであることに留意すべきである。1 次に、ステップ2.3においては、スペクトルの測定のための拡散反射モードを選択することが記載されています。送信モードは、分光光度計での測定のために準備されます。透過モードで測定したスペクトルであるが較正モデルの構築に使用可能なLSO、より正確で、より堅牢なモデルは、ほとんどの場合、拡散反射モードで測定したスペクトルを用いて構成することができます。全有機酸含量は、透過モードで測定したスペクトルを用いて予...

近赤外（NIR）分光法は、広く様々な種類の果物や野菜の内容を分析する非破壊技術として適用される。1,2非破壊は、近赤外分光法により分析保証品質を有する唯一のおいしい果物や野菜の出荷を可能にします。近赤外分光法は、まだ上のTSC（総固形分）、総糖含有量に対応し、その糖度、酸度を知っているように、オレンジ、リンゴ、メロン、チェリー、キウイフルーツ、マンゴー、パパイヤ、桃とに適用される、とされてきました。最近、我々は、ブルーベリーの品質評価への近赤外分光法の適用を報告している。3当社は、全糖含量と酸味に対応する全有機酸含量だけでなく、総アントシアニン含有量だけでなく、を測定しました。アントシアニンは、ヒトの健康を改善すると考えられている生物活性成分です。彼らは糖度、交流の保証でおいしいブルーベリーを購入することができた場合には、消費者にとって便利ですidity、およびアントシアニン含量。 果物や野菜のNIR吸収スペクトルでは、唯一の広い吸収帯が観察されます。彼らは主に繊維や水分に起因するバンドです。非破壊対象の様々な成分には多くの弱いバンドが同時に観察されるが、観察されたバンドは、ほとんどの場合、ターゲットの特定のコンポーネントの特定の振動モードに割り当てることはできません。したがって、ランベルト - ベールの法則を使用して特定の成分の含有量を決定するための従来の技術は、NIRスペクトルのために有効ではありません。代わりに、観測されたスペクトルからの標的成分の含有量を予測するためのキャリブレーションモデルは、観測されたスペクトルとのスペクトルに対応する成分の内容との相関関係を調べることにより、ケモメトリックスを使用して構築される。4,5なお、モデルを構築し、検証するプロトコル全糖含量、acidiに対応する全有機酸含量を予測するためTY、およびNIRスペクトルからブルーベリーの総アントシアニン含量が提示されます。 図1は、信頼性の高い強固な較正モデルを構築するための一般的なフローチャートを示します。十分な数のサンプルが収集されます。他の構築モデルの検証に使用されている間、それらのいくつかは、モデルの構築に使用されます。収集したサンプルのそれぞれについて、NIRスペクトルを測定し、その後、標的成分は、従来の破壊的な化学分析法を用いて定量的に分析されます。ここで、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、糖、有機酸、およびアントシアニンの化学分析のために使用されます。部分最小二乗は、（PLS）回帰は、化学分析によって決定し、観察されたスペクトルと成分含有量との相関を調べる較正モデルの構築に使用されます。最良の予測能力、obserの前処理と堅牢なモデルを構築するためにVEDスペクトルを予測するために使用される波長領域も検討されています。最後に、構築したモデルは、それらの十分な予測能力を確認するために検証されます。検証では、コンテンツは、構築したモデル（予測値）を観測スペクトルから予測化学分析（観測値）によって決定した内容と比較されます。十分な相関が予測と観測値との間で見つけることができない場合は、十分な相関が得られるまで、キャリブレーションモデルを再構築する必要があります。同図（外部検証）に示すように、モデルの構築および検証のための試料の異なるグループを使用することが好ましいが、同じグループ内のサンプルは、建設および検証（クロスバリデーション）の両方に使用される場合の数サンプルは十分な大きさではありません。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53981/53981fig1.jpg" /> Fキャリブレーションモデルの構築と検証のためigure 1.フロー・チャート。青と緑の線で囲ま手順は、キャリブレーションモデルとその検証の建設に、それぞれ対応している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53981/53981fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>FT-NIR分光光度計</td><td>Bruker Optics GmbH</td><td>MPA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー</td><td>島津製作</td>所 <td>228-45041-91, 228-45000-31, 228-45018-31</td><td>糖分析</td></tr><tr><td></td><td></td>用 <td>223-04500-31, 228-45010-31, 228-45095-31</td><td>屈折率検出器</td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー</td><td>島津製作</td>所 <td>228-45041-91, 228-45003-31, 228-45000-31</td><td>有機酸分析用</td></tr><tr><td></td><td></td><td>228-45018-31、228-45010-31、223-04500-31</td><td>紫外可視検出器</td></tr><tr><td>高速液体クロマトグラフィー</td><td>島津製作</td>所 <td>228-45041-91、228-45018-31、228-45000-31</td><td>アントシアニン分析</td></tr><tr><td></td><td></td>用 <td>228-45012-31、228-45119-31、228-45005-31</td><td>フォトダイオードアレイ検出器</td></tr><tr><td></td><td></td><td>228-45009-31</td><td></td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>メトラー・トレド</td><td>30019028</td><td>S220、自動温度補正</td></tr><tr><td>超純水処理装置</td><td>オルガノ株式会社</td><td>ORG-ULXXXM1;PRA-0015-0V0</td>ピ<td>ュアラボウルトラ;ピュアライト</td></tr><tr><td>バイオメディカルフリーザー&nbsp;</td><td>SANYO</td><td>2-6780-01</td><td>MDF-U338</td></tr><tr><td>超低温冷凍庫</td><td>パナソニック ヘルスケア株式会社</td><td>KM-DU73Y1-80</td> <td>&deg;C</td></tr><tr><td>真空凍結乾燥機</td><td>岩木硝子有限公司</td><td>119770</td><td>DRC-3L;FRD-82M</td></tr><tr><td>ホモジナイザー</td><td>マイクロテック株式会社&nbsp;</td><td>Physcotron</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>日立工機株式会社</td><td>S204567</td><td>CF15RXII</td></tr><tr><td>ミニ遠心分離</td>機<td>LMS株式会社</td><td>KN3136572</td><td>MCF-2360</td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>国産工業株式会社</td><td>2-5534-01</td><td>H-103N</td></tr><tr><td>濾紙&nbsp;</td><td>Advantec</td><td>1521070</td><td>5B, Equatent to Whatman 40</td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 カラム</td><td>Waters Corporation Milford</td><td>WAT020515</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak CM カラム</td><td>Waters Corporation Milford</td><td>WAT020550</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak QMA カラム</td><td>Waters Corporation Milford</td><td>WAT020545</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Filter Unit</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>R2SA18503</td><td>PVDF, 0.45&mu;m</td></tr><tr><td>マイクロチューブ</td><td>アズ・ワン 株式会社</td><td>1-1600-02</td><td>PP 2ml</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>GEヘルスケア株式会社</td><td>6788-1304</td><td>PP、0.45 &MU;m</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td>194-00011</td><td>試薬級</td></tr><tr><td>グルコース</td>和<td>光純薬工業株式会社</td><td>049-31165</td><td>試薬級</td></tr><tr><td>果糖</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td>123-02762</td><td>試薬級</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td>036-05522</td><td>試薬級</td></tr><tr><td>リンゴ酸</td><td>和光純薬工業(株</td>) <td>355-17971</td><td>試薬グレードの</td></tr><tr><td>コハク酸&nbsp;</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td>190-04332</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>キナ酸</td><td>アルファ Aesar, A Johnson Matthey Company</td><td></td><td>10176328 試薬グレード</td></tr><tr><td></td><td>リン酸 和光純薬工業株式会社</td><td>162-20492</td><td>HPLC級</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td>208-02746</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>和光純化学工業株式会社</td><td>131-01826</td><td>試薬グレード</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td>015-08633</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>シアニジン-3-O-グルコシド塩化</td>物 <td>和光純薬工業株式会社</td><td>306-37661</td><td>HPLCグレード</td></tr><tr><td>分析用ソフトウェア</td><td>Bruker Optics GmbH</td><td>OPUS ver. 6.5</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア前処理</td><td>Microsoft</td><td>Excel powered by Visual Basic for Applications</td><td></td></tr><tr><td>モデル</td><td></td>構築ソフトウェア <td>Freemat 4.0</td><td>http://freemat.sourceforge.net/</td></tr></tbody></table>

hplc測定に基づいて近赤外分光法によるブルーベリーにおける成分含量の非破壊予測のためのモデルの構築

Construction of Models for Nondestructive Prediction of Ingredient Contents in Blueberries by Near-infrared Spectroscopy Based on HPLC Measurements

農産物の成分含有量の非破壊予測は、保証された品質で製品を出荷し販売するのに役立ちます。ここでは、近赤外分光法を使用して、各ブルーベリーの総糖、全有機酸、および総アントシアニン含有量を非破壊的に予測します。この技術により、収穫されたすべてのブルーベリーから美味しいブルーベリーだけを選べることが期待されます。ブルーベリーの近赤外吸収スペクトルは、萼(がく)上にない位置で拡散反射モードを用いて測定されます。高速液体クロマトグラフィーによって決定されたブルーベリーの成分含有量は、観測されたスペクトルから成分含有量を予測するモデルを構築するために使用されます。偏最小二乗回帰は、モデルの構築に使用されます。観測されたスペクトルの前処理と、解析に用いるスペクトルの波長領域を適切に選択する必要があります。構築されたモデルが、成分含有量が実用的な精度で予測されていることを確認するためには、検証が必要です。ここでは、近赤外分光法によるブルーベリーの成分含有量の非破壊予測モデルを構築し、検証するためのプロトコルを紹介します。

例として、70ブルーベリーのスペクトルが同時に示されているブルーベリーの近赤外吸収スペクトルのセットを図2に示す図 。糖、有機酸、またはアントシアニンに確実に割り当て可能な帯域がNIRスペクトルで観察されていないので、従来のランベルト・ベールの法則は、成分量を定量化するためには適用されません。したがって、成分内容を予測するためのモデルの構築が必要です。 図3は、ブルーベリー中の糖の定量分析のための典型的なクロマトグラムを示します。上から3つのパネルは、それぞれ、スクロース、グルコース、およびフルクトースの標準溶液のクロマトグラムです。下のパネルは、ブルーベリーの抽出物、すなわち試料溶液のクロマトグラムを示します。試料溶液中の糖の種類と濃度は保持時間から知られています観察されたピークの面積強度をND。総糖含量は、スクロース、グルコース...

ここでは、近赤外分光法による個々のブルーベリーの総糖分、全有機酸、および総アントシアニン含有量の非破壊予測のためのモデルを構築し検証するためのプロトコルを提示します。

HPLC測定に基づいて近赤外分光法によるブルーベリーにおける成分含量の非破壊予測のためのモデルの構築

Nondestructive prediction of ingredient contents of farm products is useful to ship and sell the products with guaranteed qualities. Here, near-infrared ...

本手順の全体的な目的は、近赤外分光法を用いて、個々のブルーベリーに含まれる総糖量、総有機酸量、および総アントシアニン含有量を非破壊的に予測するためのモデルを構築し、検証することです。この手法は、果物や野菜などの農産物評価の分野における重要な課題を解決します。この技術の利点は、多くの産品を分光法によって非破壊的に検査できる点にあります。また、本手順を通じて構築されたモデルについても説明します。近赤外分光法は、農産物の非破壊評価に有効な手法です。各サンプルのスペクトルと、化学分析により決定された含有量との相関を調べることで、予測モデルを構築します。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の卒業生である木村勇介氏と、大学所属で本プロトコルの共著者の一人であるJingai Che氏です。対象となる品種から、十分な数および多種類のアオイブルーベリー試料を採取してください。校正モデルの構築には、好ましくは100粒のブルーベリーを採取してください。そして、構築したモデルの検証用に少なくとも10個用意します。堅牢なモデルを構築するために、色やサイズが異なるものや、異なる熟度にあるものなど、様々なタイプのサンプルを収集してください。各ブルーベリーの重量を測定します。測定した重量は、後に各ブルーベリーの成分含有率を算出するために使用します。次に、拡散反射測定を行うため、ブルーベリーのサンプルを近赤外分光光度計のウィンドウの中央に配置します。サンプルシングルチャネルコマンドを使用して、各ブルーベリーのスペクトルを測定します。できれば果実の数箇所で測定してください。スペクトル測定後すぐに分析しない場合は、ブルーベリーを−30°C以下の冷凍庫で保存してください。前処理を開始するには、ブルーベリーを数片に切り分け、均質化しやすくします。冷凍状態でブルーベリーを解凍せずに切断します。切断した断片を50 mLビーカーに入れます。ビーカーに超純水を約10 mL加えます。分析中に糖を分解させる可能性のある酵素を不活化させるため、カットしたブルーベリーを超純水に入れ、電子レンジで20秒間加熱します。ビーカーに超純水を約10 milliliters加えます。標準的なシャフトとジェネレーターを備えたホモジナイザーを用いて、混合物を12,000 RPMで5分間ホモジナイズします。均質化した混合物を3,000 RPMで10分間遠心分離します。次に、遠心分離したサンプルを5B濾紙を用いて吸引ろ過し、ろ液を回収します。均質化の手順を2回繰り返した後、ろ液のpHを測定し、希塩酸と水酸化ナトリウム希水溶液を用いてpH 7に調整します。ろ液を超純水で50 millilitersまで希釈します。サンプルを2等分し、一方は糖の分析に、もう一方は有機酸の分析に使用します。最初の試料溶液を、色素、陽イオン、および陰イオンを除去するために直列に接続されたカラムに通します。カラムから得られた試料溶液の最初の1 mLは廃棄してください。その後、このカラム通過後の試料溶液を、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による糖分析に使用します。HPLC分析の前に、0.445 micronフィルター付きのマイクロチューブに入れ、ミニ遠心分離機を用いて6,600 RPMで10分間遠心分離します。カラムオーブン内を40 °Cに設定し、ゲルろ過カラムを用いたHPLCシステムを準備します。溶離液には、脱気した超純水を流量0.1 mL/minで使用します。また、屈折率検出器を使用します。各測定につき 20 µL の分注量を注入し、標準溶液の HPLC スペクトログラムを測定します。ここでは、測定に packed solution ソフトウェアを使用しています。マウスの右ボタンで再解析（re-analysis）をクリックし、各標準溶液のクロマトグラムにおける糖のバンドの面積強度を求めます。次に、得られた面積強度を対応する濃度に対してプロットし、線形回帰により各糖の検量線を作成します。この曲線から、各糖の面積強度と濃度の関係を示す方程式が得られます。標準曲線を求めた後、1回につき20 µLずつ注入し、試料溶液のHPLCスペクトグラムを測定します。前述と同様に、各試料溶液のクロマトグラムにおける糖のバンドの面積強度を算出します。有機酸のHPLC測定手順については、本文のプロトコルを参照してください。スペクトル測定後すぐにアントシアニンの分析を行わない場合は、ブルーベリーを-80°C以下のフリーザーで保存してください。アントシアニンのHPLC測定のための前処理を行うには、凍結させた各果実を真空凍結乾燥機で12時間乾燥させます。乾燥させたブルーベリーから、トリフルオロ酢酸1%メタノール溶液を用いてアントシアニンを抽出し、混合液を4°Cの冷蔵庫で12時間静置してください。超遠心機を用い、-8°C、15,000 RPMの条件下で、2 mLマイクロチューブに入れた抽出液を15分間遠心分離します。次に、抽出液を0.45 µmフィルターでろ過し、HPLC測定用のサンプルを得ます。C18逆相カラムを用い、カラムオーブンを40°Cに設定してHPLCシステムを構成します。0.1%トリフルオロ酢酸水溶液をLUNAとして、0.5%トリフルオロ酢酸含有アセトニトリルをLUNBとしてグラジエント法を適用します。流速は0.1 mL/minとし、注入後0分から50分にかけてLUNBの比率を8%から15%まで増加させます。また、注入後50〜60分かけて15%から75%まで変化させます。520ナノメートルでモニタリングするフォトダイオードアレイ検出器を使用してください。各測定において、オートサンプラーを介して10µLのアリコートを注入し、標準溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。測定にはLCソリューションソフトウェアを使用します。最後に、オートサンプラーを用いて各測定につき10 µLの分注量を注入し、試料溶液のHPLCスペクトログラムを測定します。この時点で、成分含有量予測のための校正モデルの構築と、それに続く構築済みモデルのバリデーションを、テキストプロトコルに記載の方法で実施します。得られたスペクトルと、本手順で決定した成分含有量を用いて予測モデルを構築します。ここでは、総糖含量の予測のために構築したモデルのクロスバリデーション結果の例を示します。近赤外分光法による予測値とHPLCによる測定値との相関性は良好です。総アントシアニン含量のモデルのクロスバリデーションにおいても、同様の結果が観察されます。ここでも、予測値と実測値の間の相関性は良好です。このビデオを視聴することで、HPLCを用いてブルーベリーの成分の従来値を算出する方法について十分な理解が得られたはずです。破壊的な化学分析によって測定されたあらかじめ設定されたコンテンツに基づき、適切に構築されたモデルを用いることでのみ、異なる評価が可能になります。つまり、高性能な予測モデルを構築するためには、対象の事前の化学分析が不可欠であるということです。本ビデオでは示されていない予測モデルの構築手順については、テキストプロトコルを参照してください。適切に構築された予測モデルは、ブルーベリーの糖分、有機酸、およびその他の成分の予測に適用可能です。ここで示した近赤外分光法は、多くの種類の農産物の相関分析に適用できると考えられます。近赤外分光法をあらゆる農産物の評価に適用して良好なモデルを構築する場合、化学分析によって成分の基準値をあらかじめ取得しておく必要があることに留意してください。

construction-models-for-nondestructive-prediction-ingredient-contents

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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ピュアシフト核磁気共鳴:植物メタボロミクスのための新しいツール

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学ぶ ブルーベリーの総糖、有機酸、アントシアニン含量を近赤外分光法で非破壊予測するモデル構築法。HPLC測定との相関から品質評価モデルを構築し、農産物の迅速な品質管理に応用できます。

HPLC測定に基づいて近赤外分光法によるブルーベリーにおける成分含量の非破壊予測のためのモデルの構築

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