顕微鏡骨転移の効率的かつ選択的モデリングのためのイントラ腸骨動脈注入
2016年9月26日
この原稿は、骨を含む後肢組織にがん細胞を特異的に送達し、実験的な骨転移を確立する技術である腸骨内動脈（IIA）注射の詳細な手順を提供します。当初は乳房腫瘍モデルで確立されましたが、このプロトコルは他の種類のがんにも簡単に拡張できます。
この手順の全体的な目標は、腸骨内動脈注射を介してがん細胞を骨を含む後肢組織に直接送達することにより、実験的骨転移を確立することです。したがって、この方法は、乳がんの骨のコロニー形成に関する重要な質問、特にこのプロセスの初期段階で、乳がん細胞が骨の微小環境細胞とどのように相互作用するかに答えるのに役立ちます。今日は腸骨動脈注射を行いました。
この技術の主な利点は、局所的な組織損傷を引き起こすことなく、さまざまな種類の癌に対する実験的顕微鏡的骨転移モデルを効率的かつ選択的に確立することです。一般に、この方法に不慣れな人は、顕微鏡で正確な腸骨動脈注射位置を見つけるには、90%を超える注射成功率を達成するために練習が必要になる可能性があるため、苦労するでしょう。5〜6週齢の20グラムのマウスのつま先つまみで適切な鎮静レベルを確認することから始めます。
目の軟膏を塗布した後、剃った右鼠径部を70%イソプロピルエタノールに浸した綿棒で数回拭き、続いてベタジン手術用スクラブを順次滅菌します。次に、マウス全体を滅菌ドレープで覆います。次に、滅菌済みの10番の炭素鋼メスの刃と3番のハンドルを使用して、右下腹部の4番目と5番目の乳首の間に1〜1.2センチの皮膚切開を行います。
そして、動物を標準的な卓上解剖顕微鏡下に移します。4X対物レンズの下で、脂肪組織と腹膜の間の切開部に鈍い分離鉗子を挿入し、両側で組織を外側に押して腸骨血管と神経を明らかにします。次に、まっすぐで細い鉗子を使用して、血管と血管に最も近い神経との間の結合組織を突破します。
次に、角度の付いた鉗子を結合組織を通して腸骨血管の下にスライドさせ、まっすぐな鉗子を血管の反対側の結合組織に挿入して、角度のある鉗子を組織に導きます。このステップでは、腸骨縁と動脈を束として分離して持ち上げることをお勧めします。腫瘍細胞は動脈にのみ注入されますが、両方の血管を一緒に分離する時間と労力を節約できます。
角度のある鉗子が所定の位置に配置されたら、腸骨静脈と動脈を周囲の組織からさらに分離し、解剖中に血管を角度のある鉗子の上に保ちます。血管が透明なら、まっすぐな鉗子を使用して4-0シルク縫合糸の先端を角度のある鉗子に送り、縫合糸を血管の下にゆっくりと優しく引っ張ります。次に、腸骨総静脈と動脈血管の両方を縫合糸で支える必要があります。
血管の準備ができたら、腫瘍細胞を数回上下にピペットで動かして、腫瘍細胞を単一細胞溶液に再懸濁し、凝集塊を分解します。次に、マウスあたり100マイクロリットルの細胞を31ゲージのインスリン注射器に吸引します。次に、縫合糸をガイドとして使用して角度の付いた鉗子を血管の下にスライドさせ、血管が先端に優しく乗るように鉗子を開きます。
もう一方の手で、針の先端を斜めにして、鉗子の先端の間の動脈のセクションの内腔に挿入します。プランジャーをゆっくりと押し下げて、細胞を注入します。細胞懸濁液は血管を通して血液を洗い流します。
すべての細胞が送達されたら、出血を防ぐために血管を鉗子の上で持ち上げたまま、針をそっと取り外します。次に、縫合糸を引き離します。最後に、鉗子をすばやく取り外し、綿棒を切開部に5〜10分間押し付けて出血を止めます。
ここでは、第5のGFPルシフェリン標識MCF−7乳癌細胞に5回10回の腸骨内動脈注射を行った後、眼窩後洞注射によるd−ルシフェリン投与を行った後の代表的な全動物生物発光画像を示す。注射後14日目に、注入された腸骨内動脈からは強い生物発光シグナルが得られましたが、対側の対照骨からは得られませんでした。担腫瘍性骨のH&E染色を切片化すると、腸骨内動脈注入の14日後に骨組織に顕微鏡的なMCF-7転移性病変を示す大きな核を持つコンパクトな丸石状の細胞集団も示されました。
さらに、骨切片の免疫蛍光染色により、MCF-7細胞と骨芽細胞および骨芽細胞前芽細胞との共和解も明らかになりました。一度習得すると、このテクニックは10分から15分で完了することができます。これらの手順に従って、他の方法を使用して追加の質問に答えることができます。
例えば、RNA-Seqを用いて、転移ニッチの微小環境細胞をプロファイリングし、正常細胞と比較することができます。この技術は、乳がん研究者や前立腺がん研究者が動物の骨微小転移を研究するための1つの方法を提供します。このビデオを見れば、腸骨内動脈注射による乳がん骨転移モデルの確立方法についてよく理解できるはずです。
ケタミンとキシラジンの取り扱いは非常に危険ですので、適切な予防策を講じてください。
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概要
本稿では、実験的な骨転移を確立するために、がん細胞を骨を含む後肢組織に届ける内腸骨動脈（IIA）注入法について詳述します。この手法は、乳がん細胞と骨微小環境との相互作用を研究する際に特に有用です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 実験手法
背景
- 骨転移は癌患者における一般的な合併症です。
- 骨における癌細胞の定着メカニズムを理解することは、治療法の開発において極めて重要です。
- 内腸骨動脈注入法を用いることで、癌細胞を標的部位に配送することが可能です。
- この手法は、他の方法と比較して局所的な組織損傷を最小限に抑えることができます。
研究の目的
- 骨転移を研究するためのモデルを構築すること。
- 乳がん細胞と骨微小環境細胞の間の相互作用を調査すること。
- 注入技術の精度と成功率を向上させること。
使用した手法
- がん細胞の内腸骨動脈への注入。
- 5〜6週齢のマウスモデルの使用。
- 足指へのピンチ刺激による鎮静レベルのモニタリング。
- 高い成功率を達成するための注入手技の習熟。
主な結果
- この手法により、骨転移モデルを効率的に構築することが可能です。
- 習熟することで、高い成功率を達成できます。
- 本手法では、局所組織への損傷が最小限に抑えられます。
- 乳がん細胞の定着の初期段階に関する知見が得られます。
結論
- 腸骨内動脈注射は、がん研究において有用な手法である。
- 本手法は、乳がん以外のさまざまながん種にも適応させることが可能である。
- さらなる研究により、がん細胞と骨の相互作用への理解を深めることができる。
よくある質問
業界における実用的な関連性
早期段階の骨転移の信頼性の高いモデルを確立することは、特に微小転移のコロニー形成を標的とした治療介入を評価する上で、腫瘍学の薬剤探索における極めて重要な課題です。内腸骨動脈注入法を用いることで、がん細胞の後肢骨への時空間的に同期した播種が可能となり、播種がん細胞の確実な定量化が実現し、処置による組織損傷に起因する炎症反応という混在要因を低減できます。このアプローチは、全身的な臓器転移を伴わずに緩徐に進行する骨病変の継続的なモニタリングを可能にすることで、前臨床研究における予測の信頼性を高め、標的バリデーションおよびリード化合物同定における骨転移モデルのトランスレーショナルな妥当性を向上させます。
バイオファーマ研究開発における戦略的活用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値：骨芽細胞や前骨芽細胞などの骨微小環境成分と初期がん細胞の相互作用をモデル化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 実用的価値：がん細胞を後肢の骨へ送達するための選択的かつ効率的な手法を提供し、実験群全体で一貫したモデル作成を促進する。
- 戦略的価値：バイオルミネッセンスおよび組織学的読み取りを通じて、単一細胞から多細胞病変に至る微小転移の進行を可視化させ、骨転移経路のメカニズム的なリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 生物発光信号強度や組織学的病変密度などの定量可能な出力を生成し、転移負荷の標準化された評価を可能にする。
- 運用の価値： 局所組織の損傷およびそれに伴う創傷治癒の混在要因を回避し、アッセイの再現性を向上させ、後続解析におけるばらつきを低減する。
- 戦略的価値： オフターゲット臓器への転移を最小限に抑えた疾患関連システムを構築し、スクリーニングキャンペーンにおける用量反応およびタイミング研究のための長期的な観察期間を確保できる。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値： 骨における播種性腫瘍細胞から微小転移への進展という、臨床上の主要なボトルネックを捉えることで、疾患に関連する系と整合させています。
- 運用的価値： 縦断的イメージングおよびH&E染色や免疫蛍光染色などのエンドポイント解析をサポートすることで、創薬から前臨床検証までの継続性を可能にします。
- 戦略的価値： 骨微小環境における癌細胞とストロマの混在やニッチ形成を阻害する化合物について、早期に有効性のシグナルを提供し、リスク調整後の開発推進の意思決定に寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
内腸骨動脈注入法は、ターゲットのバリデーションからリード化合物の同定、そして前臨床有効性試験に至る創薬のプロセスに適合します。特に、早期転移モデルがメカニズムの解明や治療ウィンドウの決定に寄与する骨標的治療薬において有用です。
- 探索生物学：腫瘍細胞を骨部位に制御して導入することを可能にし、がん細胞と骨微小環境の相互作用に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：ハイコンテンツスクリーニングプラットフォームに適した、定量的なバイオルミネッセンスおよび組織病理学的読み取りが可能な、アッセイ準備完了済みの生物学的システムを提供します。
- 分析：バイオルミネッセンスからの光子束、組織切片における病変領域、および腫瘍細胞と間質細胞の共局在指数を含む、測定可能な従属変数を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：臨床的な骨転移における骨溶解性または骨形成性の進行に先立つ、無血管の微小転移相をモデル化することで、前臨床での連続性を確保します。
- 企業での再利用：さまざまながん種や研究室で適応可能な標準化された手術手技を提示し、骨転移モデル作成におけるプロジェクト間の整合性を促進します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 手技に伴う炎症によるノイズを低減し、表現型の変化を薬剤のメカニズムに明確に帰属させることが可能になるため、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性が向上します。
- 運用上の価値： 定義された解剖学的指標と縫合糸を用いた血管分離により、標準化と再現性が向上し、術者の習熟度に起因するばらつきが最小限に抑えられます。
- 戦略的価値： 予期せぬ骨親和性による後期の失敗を減らす、早期の臓器特異的な転移リードアウトを提供することで、go/no-go判定の効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 同系または異種移植モデルにおいて、治療群間で転移負荷を直接比較することを可能にし、骨標的候補薬のリスク調整後の優先順位付けを促進します。
実施上の留意点
- 解剖顕微鏡下での血管隔離および縫合結紮を含む、微小外科手技への習熟が必要です。
- 滅菌済みの解剖顕微鏡、精密ピンセット、インスリン用注射器、および等張細胞懸濁液の調製設備へのアクセスが不可欠です。
- 動物福祉とモデルの整合性を確保するため、麻酔プロトコル（例：ケタミン/キシラジン）および術後モニタリングのチーム間での標準化が必要です。
- 適応上の検討事項として、癌細胞株の悪性度やマウス系統の個体差に基づいた、注入量および細胞濃度の調整が含まれます。
- 実務上の制限として、90%以上の注入成功率を達成するための習得期間が必要であること、および鼠径部切開時の腹膜汚染を防ぐための無菌操作が必要であることが挙げられます。
