Name: 複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶTIRF-SIM顕微鏡の構築と調整法。高速ライブセル超解像イメージングを実現し、細胞生物学の動的プロセスを多色で観察可能にします。研究者が独自の装置を再現できる詳細なプロトコルを提供します。

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この作品はLeverhulmeトラスト、工学物理科学研究会議からの助成金によってサポートされていました[EP / H018301 / 1、EP / G037221 / 1];アルツハイマー病研究UK [ARUK-EG2012A-1];ウェルカム・トラスト[089703 / Z / 09 / Z]および医学研究審議会[MR / K015850 / 1、MR / K02292X / 1]。我々は、HEK293培養物の調製のために、それぞれLifeAct-GFPのトランスフェクションおよび細胞質-GFP細胞のためのE. AvezovとM.呂に感謝し、そしてW.陳。また、有益な議論や提案のための顕微鏡の設計の支援のためのK. O&#39;Holleranに感謝し、そしてL.シャオとR. Heintzmann。

<ol><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+modulated+excitation+microscopy%3A+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22BiOS+Eur%22%5BJournal%5D)">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li>
<li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121(2015).</li>
<li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980(2015).</li>
<li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li>
<li>Esbjörner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+amyloid+%CE%B2+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A%CE%B2%281-40%29+and+A%CE%B2%281-42%29+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li>
<li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li>
<li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Super-Resolution+Imaging+of+%CE%B2-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo%3A+Method+and+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Biol.+Alzheimer%27s+Dis.+SE+-+6%22%5BJournal%5D)">Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li>
<li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+resolution+wide-field+optical+imaging%3A+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945(2006).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li>
<li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li>
<li>Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li>
<li>Förster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663(2014).</li>
<li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastSIM%3A+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001(2015).</li>
<li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+internal+reflection+microscopy%3A+super-resolution+imaging+of+bacterial+dynamics+and+dark+field+imaging%22">Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging</a>. , University of Freiburg. (2012).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Meadowlark Optics Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Polarization+Techniques+and+Devices%22">Basic Polarization Techniques and Devices</a>. , (2005).</li>
<li>O'Holleran, K., Shaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effects+on+contrast+in+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy.</a> Opt. Lett. 37 (22), 4603(2012).</li>
<li>Brankner, S. Z., Hobson, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrankner%2C+SZ+%22Synchronization+and+Triggering+with+the+ORCA-Flash4.0+Scientific+CMOS+Camera%22">Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera</a>. , <a target="_blank" href="http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf">http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf</a> (2013).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692(2013).</li>
<li>Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-smooth+convex+optimization+for+an+efficient+reconstruction+in+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%222014+IEEE+11th+Int.+Symp.+Biomed.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy.</a> 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).</li>
<li>Ströhl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002(2015).</li>
<li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li>
<li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723(2013).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915(2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

<html>例えば、このプロトコルで詳述設定として特注TIRF-SIMシステムは、市販の顕微鏡に比べて高速で多色超解像度イメージングが可能です。超解像技術としてSIMの固有の利点は、単一分子局在顕微鏡（SMLM）、または誘導放出の枯渇顕微鏡（ある点走査法などの他の方法に比べて、時間分解能は、フルオロフォアの光物理によって限定されるものではないということですSTED）。多色イメージングが簡単であるように、これらの他の技術とは異なり、SIMはphotoswitchableまたは枯渇蛍光団を必要としません。ここで報告された2倍の改善とは対照的に、SIMおよび多焦点SIMを区画などの光などの非TIRF-SIMシステムは、通常、実際には1.7倍以下の解像度の向上を達成することができ、および商用システムは、システムよりも頻繁に遅く、あまり柔軟性がありますこのプロトコルで提示。 &quot;&gt;この技術を実装する2つの主要な困難は、まずSIMが高いパターンのコントラストを生成するために、第二光学アライメント手順を消費労力と時間を必要とする目的の背面開口部のTIRゾーン内梁6の正確な位置決めのために必要ですサンプルにおいて、偏光回転は、低NA 2D-SIMシステムでは、偏光回転を直線偏光の向きを注意深く選択することによって回避することができる。必須であるが、これはTIRF-SIM 25は不可能になる。高速多色画像化のために、電気光の偏光制御が必要であり、これは、システムの複雑さおよび費用を増加させます。 技術の制限事項 TIRF-SIMは、従来のTIRFように、自然に生物学的構造とエバネッセント場の150-200 nmの侵入深さによって照明することができる基底細胞膜に位置するプロセスの観察に制限されています。同時にSIMは、多くの場合、STEDまたはSMLMのいずれかよりも細胞に対してよりphotodamagingものとして引用され、横方向の解像度の倍増は、依然として従来のTIRF顕微鏡と比較して少なくとも4倍5により光子の必要数を増やすん。短い露光時間で高フレームレートで撮影するために、この光子の増加は、増加した照明強度の使用を必要とします。任意のフルオロフォアが固定または低速で移動サンプルのSIMイメージングのために使用することができるが、強化された光安定性と高輝度蛍光タンパク質または次世代合成染料は、生細胞イメージングのために推奨されています。 この実装では、20ヘルツを超えるSIMフレームレートで、単一の色を撮像することができるが、提示システムにおける多色画像は電動発光フィルタホイールのスイッチング時間により制限されます。 sCMOSカメラチップのサイズが大きいため、多帯域発光フィルターと画像分割光学系の使用が可能であると同時に私を可能にしますなしスピードペナルティで複数の波長でmaging。別の可能性は、異なる励起レーザを交互に励起光を拒絶するためにマルチバンドノッチフィルタを使用することです。この実装ではバイナリ強誘電体SLMの使用も最適ではありません。そのようなSLMの回折効率は非常に低いので、入射光の大部分は、空間マスクによってフィルタリングされたゼロ次反射です。非常に高いフレームレートを必要とするアプリケーションの場合、イメージング速度は、従って、レーザダイオードの出力パワーによって制限されます。 SLMはまた、離れた画素はとして理想的な半波長板を動作させてください550 nmの設計波長からの波長に対する偏光のいくつかの楕円率を導入しています。この追加のLCVRを使用することによって補償することができるが、理想的な解決策は、パターン発生器などのデジタルマイクロミラーデバイス（DMD）を使用することができます。 可能な修飾セットアップpresaの複数形ここnted柔軟性があり、より簡単に修正された市販の装置よりも、このような3D-SIM、高速2D-SIMように、他の画像診断法、多焦点SIM（MSIM）および非線形SIM（NL-SIM）は21,34,35を実装することができます。 2D-SIMは、末梢小胞体などの比較的平坦な、動きの速い構造を画像化するのに適しすることができます。周辺ERは、TIRFエバネッセント場を使用して照明することができるが、原因で、そのフラットな構造に無視できるピンボケ背景に、標準的な2D-SIMを使用して画像化することができるよりも細胞内の深くにあります。さらに、改良された光学セクショニング再構成アルゴリズムの使用は、光が光学的に厚いサンプルは、いえ軸方向分解能倍増が21必要とされないため、2D-SIMの使用を拡張するピンボケ抑制することができます。 MSIMでは、サンプルは、励起焦点36の疎な格子によって照明されます。この様式は、SM（単に空間マスクを除去することによって実現することができます）と偏光子によってそれを置き換えます。 SLMは現在、振幅変調器として動作します。 SLM上に表示されたバイナリSIM格子像面における回折限界の焦点の大きさに等しくなるように選択されたスポットのサイズが、スポットの2次元格子で置き換えることができます。 図7Aでは、4×4ピクセルの正方形の格子は13.62ミクロンの物理的なSLMのピクセルサイズを考えると、試料上に縮小時150×150nmの回折限界の焦点を生成するSLM（挿入図）に表示されます。励起の焦点は、次に、SLM上の格子パターンをシフトすることによって変換することができ、これは、視野全体を照明するために複数回繰り返されます。画像は各翻訳パターン位置とスタックのために取得されている倍までの解像度向上と再構成画像を得るために、ポスト処理され、 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" />そして、同等の広視野画像と比較して、アウト・オブ・フォーカス光減少30。取得時間を伴う生フレームの数が多いに増加させるが、この様式は、例えば、染色された赤血球（ 図7C）のような低コントラスト構造を標準SIMは不向きであるため厚く、高密度のサンプルを撮像するために有用であり得ます（この場合はN = 168）の視野ごとに必要。 Li らによって最近提示最後に、セットアップは、高NAリニアTIRF-SIMまたはパターン化された活性化非線形SIM（PA NL-SIM）のいずれかを有効にするように変更することができる。、超高1.7 NAの客観的または付加を使用することによって405 nmの光活性化レーザとSLM格子パターン35の慎重な最適化。 将来の応用 SIMはまだ急速に進化技術であり、生命科学の多くのアプリケーションは、将来的に有効になります。技術のスピード、解像度、コントラストの強化と標準フルオロフォアメートルを使用する能力バイオイメージングのために、SIMは、例えば、共焦点及び広視野プラットフォームのような従来の多くの顕微鏡システムを置き換えるために設定されているEAN。商業用SIMシステムが決定的に、彼らは分野の最新の研究開発を実施するように変更し、開発される柔軟性がない、しかし、彼らは多くの研究機関の財務範囲を超えている、優れた技術仕様で、すでに今日利用可能である、と。彼らはまた、「手元の実験のために適合させる」ために必須の能力、エッジ生命科学研究を切削しばしば重大なボトルネックを欠いています。ここで説明するシステムは、再構成された二層系のインビトロ研究、材料、物理科学、表面の化学的性質を研究するために、 例えば 、細胞表面の近くに動的プロセスを研究するために特によく適しているであろう。 2Dの材料、および他の多くのアプリケーション。

最後の5年にわたり、超解像顕微鏡は成熟しており、生物学者の手に専門光学研究室から移動しました。商業用顕微鏡ソリューションは、光超解像を実現するための3つの主要なバリアントのために存在する：単一分子の局在顕微鏡（SMLM）、排出量の枯渇顕微鏡（STED）を刺激し、構造化照明顕微鏡（SIM）1,2。 SMLMは、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）と確率的光学再構成顕微鏡（STORM）のような容易にダウンして20 nmまで、主として光学セットアップの簡単さと高空間分解能の約束に、最も人気のある技術となっています。しかし、単一分子の局在化を介した超解像顕微鏡は、本質的なトレードオフが付属しています：空間分解能の達成可能では時間分解能を制限するため、個々のフルオロフォアローカライズの十分な数を蓄積に依存しています。イメージング動的プロセス1が適切にも画像を再構成するためにその時間内に十分なローカライズイベントを取得しながらモーションアーチファクトをpreventする関心のある構造の動きをサンプリングしなければならないため、生細胞におけるESは、したがって、問題となります。これらの要件を満たすために、生細胞SMLMデモが大きく励起パワーを増加させることによって、フルオロフォアphotoswitching率の必要な増加が得られており、これにより、サンプルの生存時間および生物学的関連性3制限毒性および酸化ストレスに順番につながります。 SIMとSMLM両方を超えるSTEDの明確な利点は、それは厚い試料中の超解像度の画像は、例えば60nm程度の横方向の解像度は、最大120ミクロン〜4の深さで器官脳スライスで達成されたことができますされていること。 SMLMまたはSIMの単一目的の実装と、そのような深さでのイメージングが実現不可能であるが、単一分子光シートまたは格子光シートマイクのどちらかで可能になりますroscopy 5。これまでのところ、これは図6の小さなフィールドを撮像するために制限されているが、ビデオレートSTEDはまた、実証及びシナプス小胞の移動をマッピングするために使用されてきました。 細胞生物学および分子の自己集合反応7における用途のために-それは特定の蛍光の光物理的特性に依存しないように、多くの時間点にわたって高時間分解能でイメージングを必要とする12、構造化照明顕微鏡（SIM）よく適合することができますプローブ。 SIMのこの固有の利点にもかかわらず、今までその使用は、主に固定された細胞または動きの遅いプロセスを画像化するために限定されています。これは、市販されているSIMシステムの限界によるものである。これらの商品の獲得フレームレートが必要と正弦波照明パターン並びに光学偏光維持を生成するために使用される回折格子の回転速度によって制限されました。商業SIMの最新世代機器は、高速撮像が可能であるが、彼らは中央イメージング施設が、すべてに非常に高価です。 このプロトコルは、薄い試料中の生細胞の基底面付近で高速処理を撮像するための柔軟なSIMシステムの構築へのガイドを提示します。それは非常にフォーカス背景信号のうちを減少させ、サンプル13にノー深く約150 nm未満を貫通照明パターンを生成するために、全反射蛍光（TIRF）を採用しています。 TIRFでSIMを組み合わせるという発想は、SIM自体14とほぼ同じくらい古いですが、2006年15前に実験的に実現しなかった。TIRF-SIMで得られた第一のin vivo画像がチューブリンとキネシンを視覚化するために11ヘルツのフレームレートを達成2009年16で報告されましたダイナミクス、2色TIRF-SIMシステムは17,18を提示されました。最近では、単一色2ビームSIM秒の構築および使用のためのガイドystemは最大18 Hzの19,20のフレームレートをフィーチャー発表されました。 ここに提示され、セットアップは、TIRF-SIMで動作することができる2つのうちの3色で20HzでSIM超解像度イメージングが可能です。システム全体は、倒立顕微鏡のフレームの周りに構築され、ピエゾ作動Zステージと電動式のXY移動ステージを使用しています。 TIRF-SIMに必要な正弦波励磁パターンを生成するために、提示システムは、強誘電体空間光変調器（SLM）を使用します。バイナリ格子パターンがSLM上に表示され、結果の±1回折次数は、フィルタリング中継され、対物レンズのTIRリングに重点を置いています。必要な位相シフト及び格子の回転は、表​​示されたSLMの画像を変更することによって適用されます。このプロトコルは、このような励起パスを構築し、位置合わせする方法について説明し、排出路の位置合わせを詳述し、最適なアラインメントを確保するための試験サンプルを提示します。また、デ<html>スクライブ偏光制御とコンポーネントの同期に関する高速TIRF-SIMに特定の問題や課題を。 設計上の考慮事項と制約このプロトコルで提示TIRF-SIMシステムを組み立てる前に、光学部品の選択を決定考慮すべきいくつかの設計上の制約があります。光学部品の全ての略号は図1を参照してください。 空間光変調器（SLM） それは、サブミリ秒パターン切替が可能であるようにバイナリ強SLMは、この設定で使用されています。階調ネマチックのSLMを使用することができるが、これらはスイッチング時間を大幅に提供減少しました。二位相のピクセルをオンまたはオフに各SLMは、入射面波面にオフセットπまたは0相のいずれかを付与する周期的な格子パターンがSLM上に表示されている場合はそのためには、位相回折格子として動作します。 ENT &quot;&gt;全反射（TIR） TIRを達成し、エバネッセント場を生成するために、ガラスサンプル界面における励起ビームの入射角が臨界角よりも大きくなければなりません<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" /> 。また、これは、したがって、エバネッセント照明パターンの最大間隔または期間を、必要とされる最小の入射角を設定し、。最大入射角<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> （受光角）を定義から計算することができ、対物レンズの開口数（NA）によって制限されます<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" /> 。これは、アッベ式に従って達成間隔の最小パターンを決定します<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" /> NAと波長をリンクします<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" />最小パターン間隔に<imgALT = &quot;式&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg&quot; /&gt;。実際には、1.49のNA油浸TIRF対物レンズは、約79°の最大入射角と488nmでの励起波長を用いて164 nmでのサンプルの最小限のパターン周期をもたらします。これら二つの角度は、（TIRリング。 すなわち ）機器がTIR照明を実現する上で、対物レンズの後部開口部のリングを定義し、2つの励起焦点を正確に位置決めして正確に各照明パターンを生成するために回転する必要があります。 TIRF-SIMの画像の再構成は、パターン回転あたり3位相シフトの最小の買収は、したがって、SLMパターン期間は3で割り切れる必要があります必要があります（ 図1を参照）。例えば、488nmの照明用の9画素と640 nmの照明のための12ピクセルの期間。剪断された格子を用いたパターン間隔のサブピクセル最適化などのSLMパターン設計の包括的な議論については、、16及びLu-ヴァルターら ら Knerの前の仕事を参照してください。2つの励起焦点の20位置は全ての波長のためのTIRリングの内側にある必要があります、しかし、SLMからの±1次数の回折角は波長であります依存。標準SIMため、多色画像は、最長波長に対する格子周期を最適化し、より短いチャンネルに対する性能の損失を許容することによって達成することができます。 TIRF-SIMの場合はしかし、一つの波長を最適化すると、他の波長の焦点は、もはやTIRリング内であることを意味しません。病巣バック開口部の直径の95％で、およびTIRリング内にあるが、640nmのため、この期間外焦点を配置と同じように、例えば、9画素の格子周期を使用して、488 nmのためのTIRFを提供するのに十分ですアパーチャ。この理由のために、異なるピクセルパターンの間隔は、各励起波長のために使用されなければなりません。 TIRF-SIM励起経路のアラインメントはるかので、従来のSIMよりも、顕微鏡本体内のダイクロイックミラーの位置における小さな変化（ 図1中のDM4）に非常に敏感です。回転フィルタキューブターレットの使用は、固定位置に保持され、使用される励起波長のために特別に設計されたシングル、マルチバンドダイクロイックミラーを使用する代わりに、推奨されません。最高品質のダイクロイックミラーを使用することが必須です。これらは、少なくとも3mmの厚さの基板を必要とし、多くの場合、製造業者によって「撮影フラット」として指定されます。他のすべての基板は、TIRF-SIMに耐え難い収差や画像劣化につながります。 偏光制御 TIRF-SIMを達成するために、それが光軸に対して対物レンズの瞳面内の方位角方向に偏光ままであるように照明パターンと同期して励起光の偏光状態を回転させることが不可欠である（ すなわち。 s偏光）。偏光制御光学系の位置合わせは、電動式回転ステージ22、例えば、使用される特定の光学素子のポッケルスセル21、または半波長板を左右される。このプロトコルでは、カスタム液晶可変リターダ（LCVR）は、それが高速（〜ミリ秒）のスイッチングを可能にするように640 nmの波長範囲488を完全に波（2π）リターダンスを提供するように設計、使用されています。液晶リターダを使用する場合には、高品質のコンポーネントを使用することが必須である：標準部品は、典型的には、照明パターンと低い変調コントラストのうち、ぼけにつながるカメラの露光時間の長さにわたって一定のリターダンスを与えるのに十分安定ではありません。液晶リターダは、また、温度に強く依存し、温度制御に内蔵必要。 同期レーザーは、SLMと同期する必要があります。バイナリ強誘電体のSLMは、内部のでバランスされていますオン状態とオフ状態の間魔術。ピクセルは、いずれか一方のみでそれらの状態をオンまたはオフではなく、時間を切り替えインターの間に半波長板として作用します。したがって、レーザーはのみによるピクセルの中間状態にパターンコントラストの低下を防止するために、SLMからの信号を有効にLEDを介してオン/オフ状態の間にオンにする必要があります。レーザをデジタル変調することができない場合、音響光学変調器（AOM）を交互に高速シャッターとして使用することができます。 レンズの選択これらの制約に基づいて、所望の照明パターンを生成するために試料面上にSLM面の必要な縮小を決定することができます。これは、画像中継望遠鏡励起集光レンズL5に2つのレンズL3とL4の焦点距離を計算することができます。このシステムでは100X / 1.49NAの油浸対物レンズ488 nmおよび640 nmの励起で使用され、従って300および140ミリメートルの焦点距離を使用してL4およびL3のための、およびL5のための300ミリメートル、試料面での38ナノメートルのSLMの画素サイズに相当357Xの合計縮小を与えます。レンズの組み合わせを使用して、SLMは、それぞれ70°と67°の入射角に対応し、488 nmの照明とサンプルで172および229 nmでのパターン間隔を与えるnmの640のための12画素について9の期間を格子。ガラス - 水界面の場合、臨界角は、したがって、これらの2つのパターンの間隔は、両方の波長のためのTIRF励起を可能にする、61°であり、かつ波長とは無関係です。 37℃で動作する場合、または補正環を備えた対物レンズは、カバーガラスの厚さの変動によって導入される球面収差の補正のために有用です。 画像再構成生SIMデータが取得されると、それは、2段階のプロセスで超解像を生成するための計算量の問題です。まず、照明パターンのために決定されなければなりませんすべての画像および第二に、SIMスペクトルの構成要素は、（ 図6、インセットを参照してください）効果的なOTF支援を倍増するように適切に分離して再結合する必要があります。 超解周波数成分が重複する成分の残留部分によって引き起こされるアーティファクトを防止するためにできるだけ正確に純粋でなければならないように投影された照明パターンの正確な知識は、最も重要です。我々は、照明パターンのそれぞれについて発見されたグスタフソンら要するに23、正規化された二次元の正弦波を記述する照明パラメータのセットによって導入された手順に従って、生の画像データから事後パラメータ決定します<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" />励起パターン<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> ： <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" />これによって<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" />縞コントラストとそれぞれ個別の画像メートルのフェーズを開始するパターンを記述しています。波数ベクトルの成分<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" />そして<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" /> 、唯一の異なる向きに変更<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" />パターンと缶のそれ以外の場合は一定であると仮定。粗重なりを最適化するように相互相関のイメージのいずれかにサブピクセルシフトを適用することによって、精製された原画像のスペクトルの相互相関が実行される波数ベクトルの成分を決定します。これは、実空間位相勾配の乗算を介して行われます<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" />それがfreにおけるサブピクセルシフトを誘発します波数空間。前に実際のパターン推定に波ベクトルの良好な推定値を有することが有用であり、これは蛍光ビーズ層を画像化することにより求めることができることに注意してください。 シフトパターンとの間の位相ステップがあるように<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" /> 、 すなわち 。 <img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" /> 、周波数成分の分離は、「相軸」に沿ってフーリエ変換することにより行うことができます。大域的位相<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" />フリンジのコントラスト<img alt="方程式" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" />次いで、異なる成分の複雑な線形回帰を用いて決定することができます。個々の分離された成分は、その後、一般的なウィーナーフィルタを使用して合成されます。一般化ウィナーフィルタの両方のパラメータ抽出と実装の詳細については、我々はグスタフソンに読者を参照してください。ら 23と同じアルゴリズムが使用されています。

<table><tbody><tr><td>488 nmレーザー</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>デジタル変調付き</td></tr><tr><td>561 nmレーザー</td><td>Coherent</td><td>OBIS LS</td><td>デジタル変調付き</td></tr><tr><td>640 nmレーザー</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>デジタル変調付き</td></tr><tr><td>ロングパスダイクロイックミラー&nbsp;</td><td>励起ビームを組み合わせるための</td><td>Thorlabs</td><td></td></tr><tr><td>クワッドバンドダイクロイックミラー</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>厚さ3mm、TIRFイメージングフラット、オリンパスBXフィルターキューブに搭載</td></tr><tr><td>クワッドバンドダイクロイックミラー</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>上記と同じバッチから、25 x 25 mm</td></tr><tr><td>1インチスクエアキネマティックマウント</td><td>エドモンドオプティクス</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>グランテイラー方解石偏光子</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>LCVRのアライメント用</td></tr><tr><td>Glan-Taylor マウント</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>アクロマティック半波長板</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 nm</td></tr><tr><td>回転ケージマウント</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>HWP</td></tr><tr><td>液晶可変遅延剤</td>用 <td>Meadowlark Optics</td><td>SWIFT</td><td>488 〜 640nmの範囲でフルウェーブリターダンスを提供するようにカスタム構築されています。</td></tr><tr><td>LCVRコントローラー</td><td>Meadowlark Optics</td><td>D3060HV</td><td>液晶リターダー用2チャンネル高電圧コントローラー</td></tr><tr><td>アクロマティッククォーター波長板</td><td>Meadowlark Optics</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>回転ケージマウント</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>QWP</td></tr><tr><td>用 10mmアクロマティックダブレット</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>ビームエキスパンダー用</td></tr><tr><td>200mmアクロマティックダブレット</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>ビームエキスパンダー</td></tr>用 <tr><td>ケージ XYトランスレーター</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>強誘電体 空間光変調器</td><td>Forth Dimension ディスプレイ</td><td>M0787-00249&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>SXGA-3DM (IFF) M249型マイクロディスプレイ 1,280 x 1,024画素 ドライバーボード付</td></tr><tr><td>SLMの土台フレーム</td><td>第四次元は</td><td>M0787-10014</td><td>を特注のアルミニウムmount</td></tr><tr><td>&Oslashに固定表示する;50.8 mm ジンバル ミラー マウント</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>SLM マウント用</td></tr><tr><td>回転プラットフォーム付き 2 軸リニア トランスレーション ステージ</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>SLM マウント用</td></tr><tr><td>レールキャリア</td><td>ニューポート</td><td>M-PRC-3</td><td>SLM マウント用</td></tr><tr><td>精密オプティカルレール</td><td>ニューポート</td><td>PRL-6</td><td>SLM マウント用</td></tr><tr><td>300 mm アクロマティック ダブレット レンズ</td><td>Qioptiq</td><td>G322273 322&nbsp;</td><td>f = 300 mm、直径31.5 mm</td></tr><tr><td>140 mmアクロマティックダブレットレンズ</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f = 140 mm、直径31.5 mm</td></tr><tr><td>精密XYトランスレーションマウント</td><td>Thorlabs</td><td>LM2XY</td><td></td></tr><tr><td>レンズマウント</td>アダプター <td>Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>31.5mmレンズを2インチマウントに取り付けるため</td></tr><tr><td>トランスレーションステージ</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>ダブテール、サイドドライブ</td></tr><tr><td>差動ドライブ付きXYトランスレータ</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>空間フィルター用</td></tr><tr><td>回転ケージマウント</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>空間フィルター用</td></tr><tr><td>300 mm アクロマティックダブレット</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>励起チューブレンズ</td></tr><tr><td>Zピエゾトッププレート付き自動XYステージ</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&nbsp;</td><td>MS-2000コントローラー付き</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡フレーム</td><td>オリンパス</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>UAPON100XOTIRF</td><td>100X/1.49NA</td></tr><tr><td>高速フィルターホイール</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110A</td><td>with Prior ProScan IIIコントローラー</td></tr><tr><td>バンドパス発光フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td>sCMOSカメラ</td><td>浜松</td><td>オルカフラッシュ v4.0</td><td></td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーター</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>ライブセルイメージング用、ボールド ライン温度とCO2コントローラー付き</td></tr><tr><td>ステンレス製光学ポスト</td> 光学<td>部品取り付け用</td><td>Thorlabs</td><td>TRシリーズ</td> 光学部品取り付け用</tr><tr><td>ポストホルダー</td><td>Thorlabs</td><td>PHシリーズ</td> 光学<td>部品取り付け用</td></tr><tr><td>キネマティックミラーマウント</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>取り付け用 1インチ ミラー</td></tr><tr><td>せん断干渉計</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>100 nm 蛍光マイクロスフィア</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ T-7279</td><td>テトラスペック</td></tr><tr><td>ローダミン 6G</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>83697-250MG</td><td></td></tr><tr><td>8 ウェル ガラス ボトム ディッシュ</td><td>同上</td><td>80827</td><td>#1.5 カバーガラス</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II チャンバー カバーグラス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>サイエン</td>ティフィック 155409 <td>#1.5 カバーガラス</td></tr><tr><td>0.01 mm 顕微鏡レチクルスライド</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight チューブリン-GFP、BacMam 2.0</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

複数の色で高速構造化照明tirf顕微鏡のガイド

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

構造化照明顕微鏡（SIM）と光学的に超解像イメージングは​​、化学および生物医学科学の分子レベルでのプロセスの可視化のためのキーテクノロジーです。商用SIMシステムが利用可能であるが、カスタム商用システムを上回ることができ、実験室で設計されているシステムでは、後者は、典型的には、イメージングの忠実度と速度の点で両方、使用および汎用アプリケーションを容易にするために設計されました。この記事では、全反射（TIR）照明を使用し、100nmでの到達分解能で3色で最大10 Hzで撮像が可能であるSIMシステムを構築するための綿密なガイドを提示します。 SIMとTIRFの組み合わせに、システムは、ライバルの技術よりも優れた画像コントラストを提供します。これらの仕様を達成するために、いくつかの光学要素は、すべての利用可能な励起WAVする照明光の偏光状態と空間構造上の自動制御を可能にするために使用されていますelengths。ハードウェア実装および制御の詳細は、励起光パターン生成、波長、偏光状態、および最大の取得フレームレートを達成することに重点を置いてカメラ制御との間の同期を達成するために与えられています。システムのアライメントおよびキャリブレーションのためのステップバイステップのプロトコルが提示され、達成可能な解像度の向上は、理想的な試験サンプルで検証されています。ビデオレートの超解像画像化する能力は、生きた細胞を用いて実証されています。

この記事は、全反射蛍光照明(TIRF-SIM)で動作する構造化照明顕微鏡の組み立てと操作のための詳細なガイドを提供します。これにより、複数の色の光学超解像でダイナミックな生物学的プロセスをイメージングすることができます。

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

このプロトコルの全体的な目標は、TIRFおよび複数の色の光学セクショニングモードで動作可能な高速ライブセル超解像イメージングに適した構造化照明顕微鏡を構築し、調整することです。この方法は、細胞生物学の分野における、標準的な回折限界TIRF顕微鏡では答えられない重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、他の超解像顕微鏡技術と比較して時間分解能が速いため、生細胞の動的プロセスのイメージングに適していることです。このプロトコルはTIRF-SIM顕微鏡の構築手順を説明していますが、セットアップは柔軟性があり、3D-SIM、多焦点SIM、非線形SIMなどのイメージングモダリティを実装するために簡単に変更できます。構造化照明顕微鏡の励起経路を配置および整列するには、まず、ここに示すように光学テーブル上のコンポーネントの位置をマークします。1枚目のダイクロイックミラーDM4を顕微鏡フレームのフィルターキューブタレットに挿入した後、2枚目のダイクロイックミラーDM3を1インチ四方のキネマティックミラーマウントに挿入し、コンデンサーレンズL5から1焦点距離離して配置します。次に、システムの光学アクセスを正確に定義するために、対物レンズOBをタレットから取り外し、代わりにアライメントツールをねじ込みます。次に、ダイクロイックミラーDM3とSLMのほぼ最終位置に配置された一時的なアライメントミラーを使用して、レーザー1からのコリメートされた参照ビームを2つのアライメントディスクの穴の中心に誘導します。ここに示されているように、3つのミラーとダイクロイックミラーDM2を使用して、レーザー1からのビームを一時的なミラーに向けます。粗い光軸が決まったら、位置合わせツールを取り外します。次に、アイリスを顕微鏡本体に入る前にビーム経路に挿入し、ビームの中央に配置します。虹彩の中央に小さな穴が開いた白いカードを取り付けてから、対物レンズを再度挿入します。次に、ミラーDM3を繰り返し角度調整し、SLM位置で、入射ビームでカードの後方反射を中央に配置します。次に、対物レンズを一時的に取り外し、天井のレーザースポットに印を付けて基準位置を作成します。対物レンズから焦点距離約1つ離れたところに結像レンズL5を挿入し、基準ビームの方向に沿って並進するように設定された線形平行移動ステージに取り付けます。対物レンズから出るビームがコリメートされ、天井の基準点に当たるように、結像レンズの位置と角度を調整します。レンズがビームに対して垂直になっていることを確認するには、アイリスとホワイトカードで後方反射を再度確認します。次に、対物レンズを取り外し、イメージリレー望遠鏡の2番目のレンズL4を挿入します。線形平行移動ステージを使用して、このレンズの位置と角度を調整してコリメーションを維持し、基準ビームが天井のマークされたスポットにまだ当たるようにします。対物レンズを交換し、望遠鏡の最初のレンズL3を挿入します。このレンズの位置と角度を調整して、前述のようにコリメーションと非たわみを確保します。テキストプロトコルに従ってSLMチップを取り付けた後、レンズを位置合わせして、ミラーの代わりにSLMを挿入します。基準ビームがSLMチップの中心に位置するようにSLMの位置を調整し、ビームが2つのリレーレンズを通過するように角度を調整します。次に、基準ビームがマークされたスポットの中央にあることを確認します。液晶可変位相差板(LCVR)を、入射偏光に対して45度の高速軸で取り付けます。次に、テキストプロトコルに従って偏光回転子の位置合わせを完了した後、接眼レンズを透過した光を使用して、レチクルに焦点を合わせ、対物レンズをこの位置に固定します。次に、1.5番のカバーガラスに100ナノメートルのマルチカラービーズを一滴広げて、蛍光ビーズの単層を準備します。ビーズを乾かしてビーズをガラスに吸着させてから、水に再度浸します。浸漬油を使用して、ビーズサンプルを対物レンズに置きます。蛍光ビーズ層にピントが合うようにカメラの位置を微調整します。SIMバイナリグレーティングパターンをビットマップファイルとして生成し、テキストプロトコルに従ってSLMにアップロードした後、SLM制御ソフトウェアをロードして[接続]をクリックします。[レパートリー] タブで [ロード] をクリックしてレパートリー ファイルを開き、ファイルに含まれる実行中の注文数を確認します。「Send to Board」をクリックして、レパートリーファイルをSLMにアップロードします。次に、「ステータス」タブを選択し、実行中の順序の番号を入力します。[選択]をクリックして、実行順序を位置合わせグレーティングに変更します。XYステージに取り付けられた空間マスク(SM)をL3の焦点位置でビームパスに挿入し、その位置を光軸に対して平行移動して、目的の一次のみが通過するようにします。空間フィルターの直後には、2 つの円形のビームのみが表示されます。カメラに写っている蛍光ビーズ層の画像を確認します。2 つの円形ビームがここに示されているように重なっていない場合は、サンプル平面を再配置し、対物レンズとカメラの位置を繰り返し調整します。ピントを微調整し、テキストプロトコルに従ってサンプル平面を設定した後、例えば、10マイクロモルのローダミン6G色素の溶液をピント合わせてイメージングすることにより、TIRF照明を確認します。2つのビームが正しいTIRF角度で入射すると、単一の分子が高バックグラウンドなしで見え、円形の開口部のエッジに焦点が合っています。ダイクロイックミラーDM3を調整することで、ビームの位置を微調整することができます。システムを同期して校正するには、ビーズ単層サンプルを対物レンズに置き、焦点を合わせます。SLM制御ソフトウェアを使用して、最初のパターンの向きに対して3つの位相シフト画像をそれぞれ順番に表示するようにSLMをプログラムします。次に、例のレパートリーの実行順序 4 に切り替えます。取得ソフトウェアで、[Advanced Camera Properties]を選択し、[Output Trigger Kind 1]を[positive]に、[Output Trigger Kind 2]を[negative]に設定して、カメラをグローバル露出期間に設定します。シーケンス ウィンドウの [スキャンの種類] で [ハード ディスク レコード] を選択し、フレーム数を 3 に設定します。次に、「開始」をクリックして3つのフレームを取得します。SLMパターンは露光ごとに変化します。テキストプロトコルに従ってシステムを調整した後、SLM制御ソフトウェアで、SLMの実行順序をTIRF-SIMに必要な9つのバイナリグレーティングイメージの全シリーズに切り替えます。これは、例のレパートリーの実行中の順序 0 です。ビーズサンプルの画像を9枚取得した後、カメラソフトウェアのシーケンスペインで、スキャンタイプとして「ハードディスクレコード」を選択し、フレーム数を9に変更します。次に、「開始」をクリックして画像を取得します。最後に、[バッファリングされた画像を保存]で、画像の種類として[TIFF]を選択し、[OK]をクリックします。テキストプロトコルに従って超解像画像を再構築します。ここに示されているのは、直径100ナノメートルのマルチカラー蛍光ビーズを画像化して、標準のTIRFとTIRF-SIMを比較したものです。TIRF-SIMは、TIRFと比較して明らかに横方向の分解能が有意に高かった。顕微鏡の推定解像度は、488ナノメートルと640ナノメートルのTIRF-SIMでそれぞれ90ナノメートルと120ナノメートルです。これは、理論上の回折限界の場合と比較して、両方の波長の横方向の分解能が2倍向上することに相当します。ここに見られるように、蛍光標識されたアミロイド線維はin vitroで形成され、2倍の分解能を示すための試験サンプルとしても使用されました。emGFP標識微小管やLifeAct-GFPなど、コントラストの高い細胞内構造はTIRF-SIMイメージングに最適で、高コントラストの超解像画像が得られます。実証されたセットアップを用いたTIRF-SIMイメージングにより、基底細胞皮質の近傍に位置する微小管の亜集団を観察することができ、微小管の重合・解重合を経時的に観察することができます。離散構造を持たない低コントラストサンプルは、原形質膜の端を除いて高解像度の情報が不足しているため、TIRF-SIMイメージングには最適ではありません。最後に、SIMイメージングを成功させるには、高い変調コントラストが不可欠です。ここで示すように、再構成された画像のフーリエ変換により、SIMの光伝達関数を視覚化できます。このテクニックを習得すると、必要なパーツをすべて習得すれば、約1週間で完了することができます。この手順を試みるときは、TIRF-SIM を正常に実装するための最も重要な問題に注意する必要があります。まず、ビームの正確な位置合わせが不可欠です。これらは対物レンズの絞りの端に配置する必要があるため、これは難しい場合があります。次に、光の偏光状態がパターンと共回転していることが重要です。これがないと、サンプルのパターンコントラストが低くなり、その後の画像構築が不可能になります。このビデオを見れば、SLMベースのTIRF-SIMマイクロスコープの構築とアライメントにおける最も重要なステップについて十分に理解できるはずです。クラス3Bレーザーでの作業は非常に危険であることを忘れないでください。レーザー出力は、TIRF対物レンズを所定の位置に設置してアライメントプロセスを実行する間、目に安全なレベルに保つ必要があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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TIRF顕微鏡法によるファゴソームの形成と閉鎖の可視化

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タンパク質官能基化平面ガラス支持脂質二重膜の調製、タンパク質内のタンパク質移動度の決定、およびタンパク質密度の測定がここに示されている。ノイズを低減した全反射顕微鏡を構築するためのロードマップが概説されており、これにより、高い時空間分解能で単一の二重層常在蛍光色素を視覚化できます。...

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

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構造化照明顕微鏡データの時空間画像相関分光法により定量化したT細胞における皮質アクチンの流れ

この方法論の全体的な目標は、固定細胞における微小管、中間径フィラメントの 2D デュアル カラー dSTORM...

中間径フィラメントと微小管 2次元直接確率光再構成顕微鏡イメージング

生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる...

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

従来のエピ蛍光イメージング、分子検出に基づく超解像イメージング、およびマルチカラー単一分子検出を結合、統合された顕微鏡システムの構築の実践的なガイドの紹介など単一分子蛍光共鳴エネルギー移動イメージング、コスト効率の高い方法の 1...

1 蛍光顕微鏡を用いた複数の画像モードを実施

高速・高分解能を可能にする高度な顕微鏡分離膜と周囲の細胞内のボリュームの両方の画像が表示されます。1 つのセットアップでディスクと全反射蛍光顕微鏡を回転の統合により、3.5 まで高い獲得率でライブ...

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

チップベースの超分解能光学顕微鏡は、蛍光顕微鏡検査の新しいアプローチであり、費用対効果とスループットの利点を提供します。ここでは、チップ調製およびイメージングのためのプロトコルをTIRF顕微鏡および局在化ベースの超解像顕微鏡用に示す。...

フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

我々は、動的微小管および蛍光標識微小管関連タンパク質の同時イメージングのための干渉反射顕微鏡および全内部反射蛍光顕微鏡を実施するためのプロトコルを提示する。...

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

学ぶTIRF-SIM顕微鏡の構築と調整法。高速ライブセル超解像イメージングを実現し、細胞生物学の動的プロセスを多色で観察可能にします。研究者が独自の装置を再現できる詳細なプロトコルを提供します。

複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

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