複数の色で高速構造化照明TIRF顕微鏡のガイド

このプロトコルの全体的な目標は、TIRFおよび複数の色の光学セクショニングモードで動作可能な高速ライブセル超解像イメージングに適した構造化照明顕微鏡を構築し、調整することです。この方法は、細胞生物学の分野における、標準的な回折限界TIRF顕微鏡では答えられない重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、他の超解像顕微鏡技術と比較して時間分解能が速いため、生細胞の動的プロセスのイメージングに適していることです。

このプロトコルはTIRF-SIM顕微鏡の構築手順を説明していますが、セットアップは柔軟性があり、3D-SIM、多焦点SIM、非線形SIMなどのイメージングモダリティを実装するために簡単に変更できます。構造化照明顕微鏡の励起経路を配置および整列するには、まず、ここに示すように光学テーブル上のコンポーネントの位置をマークします。1枚目のダイクロイックミラーDM4を顕微鏡フレームのフィルターキューブタレットに挿入した後、2枚目のダイクロイックミラーDM3を1インチ四方のキネマティックミラーマウントに挿入し、コンデンサーレンズL5から1焦点距離離して配置します。次に、システムの光学アクセスを正確に定義するために、対物レンズOBをタレットから取り外し、代わりにアライメントツールをねじ込みます。

次に、ダイクロイックミラーDM3とSLMのほぼ最終位置に配置された一時的なアライメントミラーを使用して、レーザー1からのコリメートされた参照ビームを2つのアライメントディスクの穴の中心に誘導します。ここに示されているように、3つのミラーとダイクロイックミラーDM2を使用して、レーザー1からのビームを一時的なミラーに向けます。粗い光軸が決まったら、位置合わせツールを取り外します。

次に、アイリスを顕微鏡本体に入る前にビーム経路に挿入し、ビームの中央に配置します。虹彩の中央に小さな穴が開いた白いカードを取り付けてから、対物レンズを再度挿入します。次に、ミラーDM3を繰り返し角度調整し、SLM位置で、入射ビームでカードの後方反射を中央に配置します。

次に、対物レンズを一時的に取り外し、天井のレーザースポットに印を付けて基準位置を作成します。対物レンズから焦点距離約1つ離れたところに結像レンズL5を挿入し、基準ビームの方向に沿って並進するように設定された線形平行移動ステージに取り付けます。対物レンズから出るビームがコリメートされ、天井の基準点に当たるように、結像レンズの位置と角度を調整します。

レンズがビームに対して垂直になっていることを確認するには、アイリスとホワイトカードで後方反射を再度確認します。次に、対物レンズを取り外し、イメージリレー望遠鏡の2番目のレンズL4を挿入します。線形平行移動ステージを使用して、このレンズの位置と角度を調整してコリメーションを維持し、基準ビームが天井のマークされたスポットにまだ当たるようにします。対物レンズを交換し、望遠鏡の最初のレンズL3を挿入します。このレンズの位置と角度を調整して、前述のようにコリメーションと非たわみを確保します。

テキストプロトコルに従ってSLMチップを取り付けた後、レンズを位置合わせして、ミラーの代わりにSLMを挿入します。基準ビームがSLMチップの中心に位置するようにSLMの位置を調整し、ビームが2つのリレーレンズを通過するように角度を調整します。次に、基準ビームがマークされたスポットの中央にあることを確認します。

液晶可変位相差板(LCVR)を、入射偏光に対して45度の高速軸で取り付けます。次に、テキストプロトコルに従って偏光回転子の位置合わせを完了した後、接眼レンズを透過した光を使用して、レチクルに焦点を合わせ、対物レンズをこの位置に固定します。次に、1.5番のカバーガラスに100ナノメートルのマルチカラービーズを一滴広げて、蛍光ビーズの単層を準備します。

ビーズを乾かしてビーズをガラスに吸着させてから、水に再度浸します。浸漬油を使用して、ビーズサンプルを対物レンズに置きます。蛍光ビーズ層にピントが合うようにカメラの位置を微調整します。

SIMバイナリグレーティングパターンをビットマップファイルとして生成し、テキストプロトコルに従ってSLMにアップロードした後、SLM制御ソフトウェアをロードして[接続]をクリックします。[レパートリー] タブで [ロード] をクリックしてレパートリー ファイルを開き、ファイルに含まれる実行中の注文数を確認します。「Send to Board」をクリックして、レパートリーファイルをSLMにアップロードします。

次に、「ステータス」タブを選択し、実行中の順序の番号を入力します。[選択]をクリックして、実行順序を位置合わせグレーティングに変更します。XYステージに取り付けられた空間マスク(SM)をL3の焦点位置でビームパスに挿入し、その位置を光軸に対して平行移動して、目的の一次のみが通過するようにします。

空間フィルターの直後には、2 つの円形のビームのみが表示されます。カメラに写っている蛍光ビーズ層の画像を確認します。2 つの円形ビームがここに示されているように重なっていない場合は、サンプル平面を再配置し、対物レンズとカメラの位置を繰り返し調整します。

ピントを微調整し、テキストプロトコルに従ってサンプル平面を設定した後、例えば、10マイクロモルのローダミン6G色素の溶液をピント合わせてイメージングすることにより、TIRF照明を確認します。2つのビームが正しいTIRF角度で入射すると、単一の分子が高バックグラウンドなしで見え、円形の開口部のエッジに焦点が合っています。ダイクロイックミラーDM3を調整することで、ビームの位置を微調整することができます。

システムを同期して校正するには、ビーズ単層サンプルを対物レンズに置き、焦点を合わせます。SLM制御ソフトウェアを使用して、最初のパターンの向きに対して3つの位相シフト画像をそれぞれ順番に表示するようにSLMをプログラムします。次に、例のレパートリーの実行順序 4 に切り替えます。

取得ソフトウェアで、[Advanced Camera Properties]を選択し、[Output Trigger Kind 1]を[positive]に、[Output Trigger Kind 2]を[negative]に設定して、カメラをグローバル露出期間に設定します。シーケンス ウィンドウの [スキャンの種類] で [ハード ディスク レコード] を選択し、フレーム数を 3 に設定します。次に、「開始」をクリックして3つのフレームを取得します。

SLMパターンは露光ごとに変化します。テキストプロトコルに従ってシステムを調整した後、SLM制御ソフトウェアで、SLMの実行順序をTIRF-SIMに必要な9つのバイナリグレーティングイメージの全シリーズに切り替えます。これは、例のレパートリーの実行中の順序 0 です。

ビーズサンプルの画像を9枚取得した後、カメラソフトウェアのシーケンスペインで、スキャンタイプとして「ハードディスクレコード」を選択し、フレーム数を9に変更します。次に、「開始」をクリックして画像を取得します。最後に、[バッファリングされた画像を保存]で、画像の種類として[TIFF]を選択し、[OK]をクリックします。テキストプロトコルに従って超解像画像を再構築します。

ここに示されているのは、直径100ナノメートルのマルチカラー蛍光ビーズを画像化して、標準のTIRFとTIRF-SIMを比較したものです。TIRF-SIMは、TIRFと比較して明らかに横方向の分解能が有意に高かった。顕微鏡の推定解像度は、488ナノメートルと640ナノメートルのTIRF-SIMでそれぞれ90ナノメートルと120ナノメートルです。

これは、理論上の回折限界の場合と比較して、両方の波長の横方向の分解能が2倍向上することに相当します。ここに見られるように、蛍光標識されたアミロイド線維はin vitroで形成され、2倍の分解能を示すための試験サンプルとしても使用されました。emGFP標識微小管やLifeAct-GFPなど、コントラストの高い細胞内構造はTIRF-SIMイメージングに最適で、高コントラストの超解像画像が得られます。

実証されたセットアップを用いたTIRF-SIMイメージングにより、基底細胞皮質の近傍に位置する微小管の亜集団を観察することができ、微小管の重合・解重合を経時的に観察することができます。離散構造を持たない低コントラストサンプルは、原形質膜の端を除いて高解像度の情報が不足しているため、TIRF-SIMイメージングには最適ではありません。最後に、SIMイメージングを成功させるには、高い変調コントラストが不可欠です。

ここで示すように、再構成された画像のフーリエ変換により、SIMの光伝達関数を視覚化できます。このテクニックを習得すると、必要なパーツをすべて習得すれば、約1週間で完了することができます。この手順を試みるときは、TIRF-SIM を正常に実装するための最も重要な問題に注意する必要があります。

まず、ビームの正確な位置合わせが不可欠です。これらは対物レンズの絞りの端に配置する必要があるため、これは難しい場合があります。次に、光の偏光状態がパターンと共回転していることが重要です。

これがないと、サンプルのパターンコントラストが低くなり、その後の画像構築が不可能になります。このビデオを見れば、SLMベースのTIRF-SIMマイクロスコープの構築とアライメントにおける最も重要なステップについて十分に理解できるはずです。クラス3Bレーザーでの作業は非常に危険であることを忘れないでください。

レーザー出力は、TIRF対物レンズを所定の位置に設置してアライメントプロセスを実行する間、目に安全なレベルに保つ必要があります。