Name: 3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製インビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶ 3Dコラーゲンゲルとマイクロチャネル作製法により、細胞移動や細胞外マトリックスとの相互作用を三次元環境で観察する。組織工学や細胞生物学研究に応用可能な実験手法です。

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作者はこの仕事に資金を供給するための助成金番号UO1CA143069、R01CA142833、R01CA114462、RO1CA179556、T32-AG000213-24、およびT32-GM008692-18を承認したいと思います。また、CT-FIRE分析での開発と支援のための遺伝子座のジェレミーBredfeltとユーミン劉を認めます。

1.中和、希釈および3D調査と細胞収縮アッセイのためのコラーゲンソリューションの重合<ol><li>滅菌組織培養フード中で氷上で、コラーゲン（1：1）を中和2×PBS、pH7.4中の滅菌、氷冷100mMのHEPESで、15ミリリットルコニカルチューブ内を。溶液が均一でないと、混合渦巻きが見えなくなるまで、プラスチックピペットを用いて完全に混合します。混合プロセスの間に気泡を導入しないように注意してください。氷の上で簡単に保管してください。 </li><li>細胞培地を用いて適切な濃度（ など RPMI、DMEM、など）に中和されたコラーゲンを希釈します。 <ol><li> Nが必要な中和コラーゲンの量であり、（S / 2）/所望のコラーゲン濃度を構成するために必要な中和されたコラーゲンの量を計算式N =（Dの*のV）を使用するには、Dは、所望のコラーゲン濃度で、Vは所望の最終コラーゲン濃度の量、及びSをt彼は株式コラーゲン濃度を開始します。 </li><li>細胞と細胞培地溶液を添加することによってボリュームに中和したコラーゲンの量を起動します。完全に混合し、キャストする準備ができるまで氷上で保存します。 <ol><li>例：1ミリリットルゲルボリューム（6ウェルプレートまたは50ミリメートルのガラスボトムディッシュでゲルキャスト用の典型的な量）中の2mg / mlのゲルについて、最初の所望の最終体積で所望の濃度（2mg / ml）を掛けます（1 ml）を。この数（2 mg）を取り、ボトルに記載されているストック濃度（9.49 mg / mlで）の半分で割り。この場合には、中和​​されたコラーゲンを0.42 mlの培地/細胞混合物0.58 mlを希釈します。 </li></ol></li></ol></li><li>ピペットは、非組織培養のいずれかに、氷冷コラーゲン/細胞/培地の混合物を、6ウェルプレートまたは50ミリメートルのガラスボトムディッシュを処理しました。溶液を均等に広げるためにピペットチップを使用してください。 注：collagの外の細胞の付着又は成長を最小化するために、非組織培養処理したプレートを使用することが重要ですゲルエン。 </li><li> 15分 - 約10のために室温で重合することを可能にします。ゲルは、重合時に不透明有効にしてください。 </li><li>重合を完了するために60分 - それが不透明になった後、追加の45を37℃にプレート又は皿を移動します。 </li><li> 45後 - メディアの3ミリリットルとウェルまたは皿の周囲P200のピペットチップを実行することにより、ウェルの側面からゲルをリリース - 60分、2を追加します。渦巻料理は優しくゲルを解放します。コラーゲンゲルは、メディアに浮遊する必要があります。 </li></ol> 2.ウェスタンブロッティング、細胞形態形成やジェルGontractilityアッセイ<ol><li>タンパク質レベル、ECMの剛性に関連する形態や細胞の収縮性を評価するために、コラーゲンゲルを注ぐことにより開始し、1.1に従って - 10日間のアッセイ - 1.6、7用の細胞を播種。成長率や密集度に応じて経験的に各細胞株の播種量を決定します。 100,000細胞/ゲル - 10日間のアッセイについては、播種密度20,000の範囲であり得ます。 </li><li>測定する細胞収縮性は、24時間毎定規またはカメラを使用するか、または適切な時間間隔でゲルの直径を測定します。 注：細胞株の形態学的特徴の特性は、ゲルに播種するために加え、顕微鏡から収集し、対応する画像は、腺房様構造、上皮尿細管、細胞突起、及びlameliapodiaとして、調べることができます。 </li><li>ウォズニアックに記載されているように17、ギャラガーら ら 、タンパク質レベルを評価するRIPA緩衝液でゲルを溶解し、目的のタンパク質のウエスタンブロット分析のために処理した。18。 <ol><li>重要：細胞株との間の収縮性の比較で、 らルイで概説したようにゲルから抽出することができる総DNAへの収縮性を正常化19、または西洋によって変化しない、ハウスキーピングタンパク質（ヒストン、GAPDH など ）。ブロット分析、ウォズニアックらに記載されているように17、ギャラガーら 。18。血球計数器を用いてゲル内の細胞を計数した場合、請負ゲルなど総ゲル面積に細胞数を正規化することを確認した細胞を集中します。 </li></ol></li><li>メディアの1ミリリットルを除去し、新鮮な培地の1ミリリットルでそれを置き換えることにより4日 - フィードゲルごとに3。測定は新鮮な培地/血清の添加とした後、ゲルを供給するようにしてください収縮にスパイクが発生します。 </li></ol>コラーゲン繊維の位置合わせのためのPDMSマイクロチャンネルの3世代注：整列コラーゲンマトリックスを生成するには、PDMSマイクロチャネル（ 図 2A）のための金型は、ソフトリソグラフィー15を介して作られたSU-8シリコンマスターが必要です。 <ol><li> PDMSチャネルを作成するには、クラフトスティックで使い捨てカップに徹底的にPDMSを混ぜます。 6インチのシリコンマスターのために、硬化剤を2 gのエラストマーベース20gを混合します。 </li><li>脱ガスの減圧下で真空チャンバ内で使い捨てカップを配置することによってPDMS液550ミリメートルHgの。 1.5時間 - 1のための脱ガス。 </li><li> PDMSを脱ガス発生が、注ぐためのシリコーンマスターを準備します。シリコーンマスターに続いて、ホットプレート上に透明フィルムのクリーンシートを配置することによって準備します。マイクロチャネルモールドは上向きいることを確認してください。 注：PDMS鋳造および硬化中に、シリコーンマスタは透明フィルムの2枚のシートの間に挟まれます。 </li><li> 1の後 - 1.5時間、真空チャンバーから脱気PDMSを削除して、ゆっくりとシリコーンマスターの上に注ぎます。 重要：気泡を避けてください。マスターの中心に注ぐと、重力が均等にそれを広めることができるように続けます。 注：PDMS降下がマスターの端にすべての方法を拡張する必要はありません。 </li><li> PDMSをマスター上に注がれた後、シリコンマスターとPDMSの上に透明フィルムの第二シートを適用します。慎重に気泡を回避するために、PDMS /シリコンマスターの上に第二の透明シートを転がり落ちます。急がないで。 PDMSは今均等にoを分散させる必要がありますマスター版。 </li><li>静か1/8 &quot;アクリル板に続いて透明性の上にゴムシートを配置。 </li><li>アクリル板の上に3 10ポンドの重みを追加します。当初は、重みは「フロート」になります。彼らはさらに進む前に解決して安定化することを可能にします。 </li><li> 4時間、70℃および硬化PDMSにホットプレートの温度を設定します。乱す前にさらに1時間の最小値のために冷却してください。 </li><li>慎重にウエハから透明フィルムのトップシートを剥離し、鉗子でチャンネルを削除します。 </li><li>使用する準備ができるまで無塵の皿に保管してください。 </li></ol>使用4.プレッピングPDMSマイクロチャンネル<ol><li>逆さまに新しい、きれいな透明フィルムの上に置いてチャンネル。鋭いピンセットで円運動を使用して清掃し、すべてのポート（ 図2b）。 PDMSの任意のフラグメントを削除します。 </li><li>タッククロスとしてガムテープの一部を使って、クリーンチャンネル。ベンチ（粘着面を上）の表面にテープを適用し、その後、チャネルOを設定n個のトップ。良好な接触を確実にするために鉗子の丸い端を有するチャネルを押し下げます。削除して、目に見える破片が除去されるまで両側に繰り返します。 </li><li>洗浄転送は、70％EtOHで50ミリリットルコニカルにPDMSチャネルを準備さ。 30秒間最大速度でボルテックス。エタノールを捨て、新鮮な70％EtOHで置き換えます。使用する直前まで70％エタノールで保管してください。 </li><li>組織培養フード内で無菌技術を使用して、清潔で無菌カバーガラスやガラスボトムディッシュにPDMSチャネルを転送します。エタノールが蒸発するまで、チャネル側のアップとUV御馳走を置きます。 </li><li>チャンネルはカバーガラスに向かって下向きにされるように乾燥したら、PDMSを反転。良好なシールを作るためにガラス上にPDMSチャネルを押し下げます。中央のポート（ポートB、 図2b）を閉じる/カバーするために滅菌PDMSのパッチを追加します。先に進む前には、完全に乾燥できるようにします。 </li><li>プレコート滅菌水で10 / mlのコラーゲンとチャネルの内部。コー​​トに、channの上に100μlの液滴を配置エル、真空とを通して描きます。 37℃で1時間後、冷蔵庫へのコラーゲンコーティング溶液で満たされた転送チャネル。 30分 - 約15のためのチル。 </li><li>吸引器またはピペットでコラーゲンコーティング溶液を除去し、コラーゲンの準備を始めます。 </li></ol>マイクロチャンネルにおける使用のため5.コラーゲンの準備<ol><li> 2×PBS、pH7.4中の氷冷100mMのHEPESで：氷上で、コラーゲン（1 1）を中和します。均一になるまで完全に混合（詳細については、1.1節を参照してください）​​。 </li><li>細胞培地を用いて適切な濃度に中和されたコラーゲンを希釈する（詳細については、1.2節を参照してください）​​。氷上で15分間インキュベートします。 </li><li>同時に、寒さは氷の上のチャネルを搭載しています。 注：目標は4℃以下でのチャネル処理のためのすべてのコンポーネントを持つことです。コラーゲンの核形成温度及び時間は、重合プロセスに重要なパラメータであり、そして必要に応じて、さらなる最適化のための出発点であってもよいです。 </li><li> COUNこの時に適切な播種密度で血球計および再懸濁を有するT細胞。 3百万個の細胞/ mlの - 計算を容易にするために、1に再懸濁します。 （詳細については、また、2.1節を参照してください）​​。 </li><li>細胞がカウントされ、15分が経過したら、注ぐコラーゲンに進みます。 </li></ol> 6.注ぐ同盟とランダムコラーゲンマイクロチャンネル<ol><li>チャネルを介してコラーゲンを描画する前に、調整し、インライン真空レギュレータと真空圧力を設定します。真空圧は、誘導し、アライメントの程度を決定するコラーゲンの流量を制御するための力を提供します。 <ol><li>ランダムまたは非整列行列の場合、10ミリメートルHgの以下の真空圧と広いチャネル（3ミリメートル幅×身長200μm）を使用します。 </li><li>整列行列に対して、60ミリメートルHgの以上の真空圧力で狭チャネル（1ミリメートル幅×200μmの背の高い）を使用します。 </li></ol></li><li>氷からマウントされたチャネルを削除し、層流hのクリーン、消毒表面上に置きますOOD。 </li><li> （ 図2b）、ポートAに中和されたコラーゲン150μlの-すぐに働くと120をロードします。 </li><li>ポートc（ 図2b）を介して真空ラインに取り付けられた25ミリリットルピペットを配置することによって、チャネルを介してコラーゲンを描画します。単一、均一な動きで通ってコラーゲンを描画します。重要：ランダムまたはアラインされていない行列の場合、チャネルにわたってゆっくりとコラーゲンを描く（約0.5から1秒当たりミリメートル）、およびそれが最後に到達すると停止します。整列行列に対して、より迅速に渡ってコラーゲンを描くが、気泡を避けるように注意してください。 </li><li>慎重P200ピペットマンやアスピレーターでポート領域から過剰なコラーゲンを削除します。 </li><li> AとCのすべてのポートが今カバーされるべきである両方のポートを介して滅菌PDMSパッチを配置します。 </li><li> 2後 - 3分、中央PDMSパッチ（ポートB）を除去し、2を追加 - 中央ポートに - （1万細胞5）細胞の3μLを。 15分 - 部分的に別の10室温で（不透明ターン）重合させました。 </li><li> 10後- 15分、さらに15、37℃への転送 - 重合を終了する30分。 PDMSのカバーを外し、必要に応じて完全にチャネルと文化のセルをカバーするためにメディアを追加。細胞は、古いメディアのミリリットルを除去し、新しいメディアのミリリットルでそれを置き換えることによって供給することができます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません

3Dコラーゲンゲルは、細胞がどのように解釈するかを理解し、それらの局所微小環境に対応するため、当社のツールボックスに貴重な追加されています。この原稿は、3Dコラーゲンマトリックス内に細胞を埋め込むための非常に基本的なプロトコルを提供している、かつ再現ランダムまたは整列したコラーゲン繊維とマトリクスを生成します。両方のプロトコルは、異なるコラーゲンアイソフォーム、架橋剤、または他のマトリックスタンパク質は、潜在的に重合時に添加することができる適応プラットフォームとして働きます。遺伝子発現およびタンパク質産生のために異なる時間枠およびエンドポイントを評価するためのプラットフォームを変更することも容易です。イメージング、タンパク質やRNAのレベルを評価し、代謝プロファイルを読み込むには、すべてのこれらの3D技術と非常に互換性があります。 すべての技術とが重要であるとして、ゲルおよびアッセイの品質を評価することが重要です。良質のコラーゲンゲルの符号は、手動操作を扱うことができるものです。例えば、1 mlの[1mg / mlの簡単にピンセットで拾い、操作されるべき]コラーゲンゲルは、6ウェ...

多くの細胞プロセスは、2次元で広範囲に研究され、それによって基本的な細胞シグナル伝達メカニズムの集合的な知識を形成しています。しかし、これらの研究では、局所的な細胞微小環境と細胞外マトリックス(ECM)の構造的および機械的特性から得られる重要な細胞の手がかりが無視されています。生理学的状況下で細胞がどのように相互作用するかをよりよく理解するためには、3次元(3D)アッセイで細胞を研究することが重要です。 これらの3DアッセイのECMは、細胞由来のものでも、精製されたタンパク質から再構成したものでもかまいません。 ECMの出所にかかわらず、3Dマトリックスアッセイは、細胞が生理学的世界内でどのように移動し、相互作用するかを理解するために非常に貴重であることが証明されています。 例えば、3Dマトリックスで増殖した細胞は、周囲のECMの機械的性質に依存する明確な移動モードを示しますが、これは2D実験では観察されません4-6。さらに、3Dで培養された細胞は、ガラスやプラスチックなどの硬い表面で成長した細胞よりも、ストレス繊維や焦点接着が少なく、目立たなくなっています7。 
しかし、コンテクスト3Dアッセイの重要性は細胞移動に限定されません。 他のいくつかの細胞シグナル伝達イベントは、3Dアッセイを使用することによってのみ調査できます。 組織や細胞の分化時には、細胞外環境とECMの硬さが、形態形成イベントに影響を与えるシグナルを提供します。 例えば、乳腺上皮尿細管形成は、剛性の低い3Dマトリックスでのみ起こり、硬いマトリックスや2D基層では起こりません8,9。 硬い3Dマトリックス内で培養すると、これらの同じ上皮細胞は、増殖が増加し、細胞膜の突出が変化したFAKおよびERKシグナル伝達によって駆動される異常な表現型を呈します10。他の多くのシグナル伝達経路や細胞プロセスが、局所的な細胞環境の硬さによって同様に影響を受けることが知られており、これらのシグナル伝達カスケードは、3D ECMの適切な局所的な機械的特性の文脈でシグナル伝達イベントと細胞表現型を調査することの重要性を強調しています。 
コラーゲンIは、ECMの最も豊富な成分であり、細胞微小環境の多くの機械的特性に関与しているため、in vitro研究に使用するのに特に関連性のあるタンパク質です。 もともとは単なる構造タンパク質と考えられていましたが、現在ではその役割がはるかに複雑であることがわかっています。 コラーゲン繊維の組成、構造、配向、密度、および剛性はすべて、シグナル伝達情報の集中的な環境を提供します5。 慢性炎症や腫瘍形成などの特定の疾患の進行中に、コラーゲンネットワークは劇的に再構築されます2,11。 より具体的には乳がんでは、コラーゲン沈着と組織硬化の増加が伴い、腫瘍の進行に寄与する可能性があります。これらの初期の腫瘍では、硬化したコラーゲンネットワークは緊張してより整列しているように見え、ほとんどの繊維が成長中の腫瘍をカプセル化しています2。 腫瘍が進行するにつれて、コラーゲンは再編成され続け、線維ネットワークの領域は腫瘍境界2,12に対して垂直に配向するようになります。垂直アライメントは、これらの患者が無病進行と全生存期間が不良な予後バイオマーカーとして機能します1。この相関関係の1つの説明は、悪い結果は、整列したコラーゲンネットワーク3での持続的な細胞移動による腫瘍細胞の播種の増加の結果であるということです。 
腫瘍の進行で観察されるアライメントと組織化に対して細胞がどのように特異的に反応するかを理解するためには、実験のためにランダムおよびアライメントされた3Dコラーゲンマトリックスを生成する必要があります。線維ネットワーク内でアライメントを誘導するには、3つの基本的な方法論があります。 第1の技術は、2点間のコラーゲンが収縮または引き伸ばされて整列を生成するひずみ誘導装置を利用する。 力軸に平行な繊維はぴんと張られ、軸に垂直な繊維は圧縮されて座屈します。 ひずみ誘発技術は、通常、優れたアライメントを提供するが、このアプローチでは、多くのプラットフォーム3,13に容易に適応できないかさばる機器が必要である。あるいは、細胞誘導株は、その後コラーゲン13を収縮して整列させる細胞の局在プラグを配置することによって作り出すことができる。 この方法には、多くのパラメータが変更される可能性があるため、変数であるという問題があります。 第2の方法は、磁気ビーズと重合中の磁場を利用してコラーゲンの整列を誘導する13,14。 この方法からは、洗練されていない機器でも良好な結果を得ることができますが、ポリマーを磁化するために抗体または他の方法を使用する必要があります。 そのため、使用料がやや高額になる可能性があり、コラーゲンゲルの剛性は、ネットワーク内の接続性の増加によって変化する可能性があります。 さらに、このプロセスで使用される磁気ビーズは自家蛍光であることが多く、イメージング実験では問題となります。最後に、アライメントは、PDMSマイクロ流体チャネル3、15、16によって生成することができる。 この方法では、小さなマイクロ流体チャネルを介して重合コラーゲンを流すことにより、コラーゲンの整列が達成されます。 これらのマイクロ流体チャネルは、さまざまな設計で作成でき、多くのプラットフォームに簡単に適応できます。 さらに、サイズが小さいため、コラーゲンやその他の試薬が非常に少量使用されるため、非常に経済的です。
ここで提供されるのは、3次元の線維性コラーゲンハイドロゲル内に細胞を埋め込むための簡単なプロトコルです。さらに、PDMSマイクロ流体チャネルを使用してコラーゲンマトリックスの組織化および整列を制御する、より高度な技術も提供される。このプロトコルは、多くのプラットフォームに容易に適応でき、3次元の生理学的微小環境における細胞移動、細胞分裂、およびその他の細胞プロセスを調査するために、整列したコラーゲンマトリックスとランダムコラーゲンマトリックスの両方を再現性よく生成できます。

<table><tbody><tr><td>高濃度ラットテールコラーゲン</td><td>コーニング354249</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SylGard184エラストマーキット</td><td>PDMSチャンネル用コーニング</td><td>NC9285739</td><td>エラストマー</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>フィッシャーBP310</td><td></td><td>HEPES中和</td></tr><tr><td>バッファーKCl&nbsp;</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP366</td><td>HEPES中和バッファー用</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td>HEPES中和バッファー用</td></tr><tr><td>Na2HPO4</</td><td>sub>Fisher</td><td>S374</td><td>HEPES中和バッファー用</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>HEPES中和バッファー</td></tr><tr><td>用 賦課金改良型ノイバウアー血球計算計</td><td>Fisher</td><td>15170-208</td><td>cell counting</td></tr><tr><td>6-well non-tissue culture plate&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>50 mm ガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P50g-1.5-30-f</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art プラスチック真空デシケーター</td><td>Bel-Art</td><td>F4200-2021</td><td>PDMS 透明フィルム用脱気チャンバー</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>3M</td><td>pp2950</td><td>PDMSチャンネルを注ぐためのプラスチックフィルム</td></tr><tr><td>ThermoScientific CimaRec</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>HP141925</td><td>PDMSマイクロチャンネルを硬化させるためのホットプレート</td></tr><tr><td>真空レギュレータ</td>ー <td>プレシジョンメディカル</td><td>PM3100</td><td>コラーゲンマイクロチャンネル用真空レギュレーター</td></tr><tr><td>8インチ x 8インチ ゴムシート</td><td>アマゾン - ゴムカル</td><td>シリコーン - 60A</td><td>PDMSマイクロチャンネルを注ぐためのゴムシート</td></tr><tr><td>8インチ x 8インチ x 0.125インチ アクリルシート</td><td>アマゾン</td> PDMSマイクロチャンネルを注ぐための<td>プレキシガラスシート</td><td></td></tr><tr><td>10ポンドの重量</td><td>PDMSマイクロチャネルを注ぐための</td><td>Amazon</td><td>CAPバーベル</td></tr><tr><td>15 mlコニカルチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mlコニカルチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックピペット</td><td>ドットサイエンティフィック</td><td>229202B、229206B、および667225B</td><td>2&nbsp;ml, 5&nbsp;ml、および25&nbsp;ml</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>フィッシャー</td><td>NC9663244</td><td></td></tr></tbody></table>

3d相互作用の研究のための3dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

歴史的に、ほとんどの細胞プロセスは2次元でしか研究されていません。 これらの研究は、一般的な細胞シグナル伝達メカニズムについて有益ですが、局所微小環境と細胞外マトリックス(ECM)の構造的および機械的特性から受け取る重要な細胞の手がかりを無視しています。生理学的ECM内で細胞がどのように相互作用するかを理解するためには、3次元アッセイの文脈で細胞を研究することが重要です。 細胞遊走、細胞分化、および細胞増殖は、3次元ECMの機械的特性の局所的な変化によって影響を受けることが示されているプロセスのほんの一部です。 ECMの中核となる線維成分であるコラーゲンIは、組織の単純な構造要素以上のものです。通常の条件下では、コラーゲンネットワークからの機械的な手がかりが形態形成を指示し、細胞構造を維持します。 腫瘍微小環境のような疾患微小環境では、コラーゲンネットワークはしばしば劇的に再構築され、組成の変化、沈着の促進、および線維組織の変化を示します。 乳がんでは、腫瘍境界に垂直に整列した線維の増加が患者の予後不良と相関しているため、線維の整列の程度が重要です1。 整列したコラーゲンマトリックスは、持続的な移動を介して腫瘍細胞の播種を増加させます2,3。 以下は、3次元の線維性コラーゲンハイドロゲル内に細胞を埋め込むための簡単なプロトコールです。 このプロトコールは、多くのプラットフォームに容易に適応でき、調整可能な3次元の生理学的微小環境における細胞移動、細胞分裂、およびその他の細胞プロセスを調査するために、整列コラーゲンマトリックスとランダムコラーゲンマトリックスの両方を再現性よく生成できます。

3Dアッセイは、コラーゲンゲルの同じ剛性内で行うことができるが、ゲルの剛性を変化させることは、細胞がそれらの細胞の微小環境における機械的な変化に応答する方法を決定するために使用することができます。堅いコラーゲンハイドロゲルは、埋め込まれた細胞が局所的に周囲のコラーゲンを収縮することができないゲルとして定義されています。異なる細胞型の本質的な収縮が独特であるため、それが準拠しており、硬いとして感知されるコラーゲン濃度を確立するために、単純な収縮曲線で始めるのがベストです。 細胞数を一定に保持し、コラーゲンゲルの濃度を増加させることによって開始します。以前に10,20示すように、ゲルの剛性は、濃度とともに指数関数的にスケールします。収縮アッセイの代表的な例は、図1に示されている。ここでは、50,000 4T1細胞をeitheに埋め込 ​​まれていますRAの2mg / mlまたは5日間3.5 mg /...

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

この手順の全体的な目的は、3D環境における細胞遊走やその他の細胞プロセスを観察するために、配向性およびランダムな3Dコラーゲンマトリックスを作製することです。この手法は、実際の組織に見られるコラーゲンの特徴を再現するように設計されており、細胞が配向性またはランダムな細胞外マトリックスを認識するために使用するメカニズムなどの重要な疑問を解明するのに役立ちます。この技術の主な利点は、3D環境の組織化を操作でき、内部の細胞をイメージングでき、かつ一般的に利用可能な装置を用いて費用対効果高く実施できることです。一般的に、この手法に慣れていない方は、コラーゲン溶液と中和バッファーが十分に混合されていなかったり、チャンネルへのコラーゲンの注入が不均一であったりすることに苦心します。本手順の実演は、私の研究室のシニアサイエンティストであるBrian Burkelが行います。まず、コラーゲンを適切に中和させるため、細胞と培地を加える前にコラーゲンとHEPESバッファーを十分に混合してください。次に、中和済みコラーゲン混合物に細胞と培地を加え、付随するテキストプロトコルに従って氷上に置きます。コラーゲンゲルの外での細胞の付着および増殖を最小限に抑えるため、氷冷した混合物を、組織培養処理されていない滅菌表面にピペットで分注します。ピペットを使用して、溶液を均一に広げてください。室温で約10〜15分間、ゲルの重合を待ちます。次に、ゲルをカバーで覆い、37 °Cのインキュベーターに移動させて、さらに45〜60分間置いて重合を完了させます。重合が完了すると、ゲルは不透明になります。重合後、2〜3 mLの培地を加えます。次に、200 µLピペットをウェルの周囲に沿って動かし、ウェルの側面からゲルを剥離させます。ディッシュをゆっくりと揺らし、底面からゲルを剥離させてください。コラーゲンマトリックスを整列させるためのPDMSマイクロチャネルを作製します。まず、他で詳述されている標準的なソフトリソグラフィー技術を用いて、SuAシリコンマスターを準備します。次に、使い捨てカップの中で、20 gのエラストマーベースと2 gの硬化剤をクラフトスティックで十分に混合します。十分に混合した後、使い捨てカップを真空チャンバーに入れ、550 mmHgの真空圧力でPDMS混合物を脱気します。約1時間から1時間半かけて脱気を行ってください。PDMSの脱気を行っている間に、ホットプレートの上に清潔な透明フィルムを敷き、その上にシリコンマスターを配置して、シリコンマスターの準備を行います。マイクロチャネルモールドが上を向いていることを確認します。1時間から1時間半後、脱気したPDMSを真空チャンバーから取り出します。PDMSをマスターの中央にゆっくりと注ぎ、重力で均等に広がるようにします。次に、気泡が入らないように、シリコンマスターとPDMSの上に2枚目の透明フィルムを慎重に重ねます。透明フィルムの上にゴムシートを、さらにその上に1/8インチのアクリル板を静かに配置し、アクリル板の上に3枚ある10ポンドのウェイトのうち1枚目を載せます。最初は1枚目のウェイトが浮いた状態になりますが、残りの2枚のウェイトプレートを載せる前に、ウェイトが落ち着いて安定するまで待ちます。準備ができたら、ホットプレートを70 °Cに設定し、PDMSを4時間キュアします。キュア後、PDMSを最低さらに1時間冷却させ、その後、ウェハー上の上層の透明フィルムを慎重に剥がします。最後に、ピンセットでチャネルを取り出します。チャネルを新しい清潔な透明フィルムの上に裏返しに置き、鋭いピンセットを用いて円を描くようにすべてのポートを洗浄します。剥がれ落ちたPDMSの断片はすべて取り除いてください。次に、梱包用テープを粘着面を上にして作業台に貼り付け、PDMSチャネルをテープの上に裏向きにセットします。ピンセットの丸い先端でチャネルを押し下げ、十分に接触していることを確認します。チャネルを取り出し、目に見えるゴミがすべて除去されるまで、両側でこの操作を繰り返します。その後、洗浄し準備が整ったPDMSチャネルを、70% ethanolを満たした50 milliliterコニカルチューブに移します。チャンネルを最大速度で30秒間ボルテックスし、その後、溶液を新鮮な70% ethanolに交換します。無菌操作を用いて、PDMSチャンネルをチャンネル側を上にして、清潔で滅菌済みのディッシュに移します。次に、ethanolが蒸発するまでチャンネルにUV処理を行います。乾燥後、チャネルをカバースリップまたはガラス底ディッシュの上に反転させ、ガラスに押し付けてしっかりと密着させます。チャネルの中央部分を覆って密閉するために、滅菌済みのPDMSをパッチ状に貼り付け、次へ進む前に装置を完全に乾燥させます。次に、10 µg/mLのコラーゲン溶液を100 µL滴下してチャネル上部に載せ、真空を用いてチャネル内に吸引します。チャネルを37°Cで1時間インキュベートした後、コラーゲンコーティング溶液を満たしたままの状態で冷蔵庫に移します。このセットアップを約15〜30分間冷却し、その後、アスピレーターまたはピペットを使用してチャネルからコラーゲンコーティング溶液を除去します。まず、コラーゲン溶液を細胞培地で希釈して中和し、氷上で15分間インキュベートします。次に、あらかじめ冷却しておいたチャネルのポートAに、コラーゲン溶液を120〜150 µL注入します。続いて、25 mLピペットを真空ラインに接続し、ポートCの上に配置します。一度の均一な動作で混合物を吸い込み、コラーゲンが端に達したところで停止させます。ランダムマトリックスを作製する上で最も重要なステップは、コラーゲンをチャネルに通してゆっくりと吸い出すことです。あまりに速く吸引すると、チャネルの一部または全体でアライメント（配向）が強まってしまいます。ポート領域から余分な溶液を注意深く取り除き、ポートAとCの両方を滅菌済みPDMSパッチで塞ぎます。2〜3分後、ポートBを覆っている中央のPDMSパッチを取り除き、1〜3 x 10⁶ cells/mLの濃度の細胞を2〜3 µL、中央ポートに添加します。室温でさらに10〜15分間放置してゲルを部分的に重合させ、その後、構築物を37 °Cのインキュベーターに移し、さらに15〜30分間静置します。重合後、PDMSポートカバーを取り除き、チャネルが完全に浸されるように培地を添加します。ここでは、50,000個の4T1細胞を、2 mg/mlまたは3.5 mg/mlのコラーゲンゲルに5日間埋め込みました。4T1細胞株は非常に高い収縮能を持つ乳がん細胞株ですが、高密度ゲルの収縮率は約10%にとどまります。一方、同条件の低密度ゲルでは、同期間に57%の収縮が認められました。コラーゲンの配向度はコラーゲン流速によって調節され、流速が高いほど配向性が向上します。より狭いチャネルを使用し、高い真空圧をかけることでコラーゲンネットワークの配向が強化されますが、広いチャネルで低い真空圧を用いた場合は、ランダムなマトリックスが形成されます。習熟し、適切に実施できれば、コラーゲンゲルの流し込みやチャネル作成は2時間半で完了することが可能です。この手順を行う際は、開始前に構成要素を準備しておくことが重要です。コラーゲンの操作を開始した後は、迅速に作業を行う必要があります。この手法の開発により、3D細胞生物学分野の研究者が、3次元の細胞外環境における細胞の接着、遊走、および浸潤を探索するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、さまざまな密度のコラーゲンゲルを注入する方法と、ランダムおよび配向したコラーゲンマトリックスの両方を生成する方法について、十分な理解を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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学ぶ 3Dコラーゲンゲルとマイクロチャネル作製法により、細胞移動や細胞外マトリックスとの相互作用を三次元環境で観察する。組織工学や細胞生物学研究に応用可能な実験手法です。

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製

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