3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製インビボ

この手順の全体的な目標は、3D環境のコンテキストで細胞移動または他の細胞プロセスを観察する目的で、整列したランダムな3Dコラーゲンマトリックスを生成することです。この方法は、実際の組織に見られるコラーゲンの特徴を捉えるように設計されており、細胞が整列した細胞外マトリックスやランダムな細胞外マトリックスを認識するために使用するメカニズムなどの重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、3D環境の構成、内部の画像セルを操作でき、一般的に利用可能な機器を使用してこれをコスト効率よく実行できることです。

一般的に、この方法に不慣れな人は、コラーゲン溶液と中和バッファーを十分に混合せず、チャネルを通じてコラーゲンを一貫して引き込むため、苦労します。この手順を実演するのは、私の研究室の上級科学者であるブライアン・バーケルです。まず、コラーゲンとHEPESバッファーを十分に混合してから、細胞と培地を添加し、コラーゲンが適切に中和されるようにします。

次に、中和したコラーゲン混合物に細胞と培地を加え、添付のテキストプロトコルに記載されているように氷の上に置きます。氷冷混合物を無菌の非組織培養処理表面にピペットで移し、コラーゲンゲルの外側の細胞の付着と増殖を最小限に抑えます。ピペットを使用して溶液を均等に広げます。

ゲルを室温で約10〜15分間重合させます。次に、ゲルを覆い、摂氏37度のインキュベーターにさらに45〜60分間移動させて重合を終了します。重合すると、ゲルは不透明になります。

重合したら、2〜3ミリリットルの培地を追加します。次に、ウェルの周囲に200ピペットを走らせて、ウェルの側面からゲルを放出します。皿を静かに回転させて、底面からジェルを放出します。

コラーゲンマトリックスを整列させるためのPDMSマイクロチャネルを作成するため。まず、他の場所で説明した標準的なソフトリソグラフィー技術を使用して、SuAシリコンマスターを調製します。次に、クラフトスティックを使用して、20グラムのエラストマーベースと2グラムの硬化剤を使い捨てカップに完全に混合します。

十分に混合したら、使い捨てカップを550ミリメートル水銀の真空圧力下で真空チャンバーに入れて、PDMS混合物を脱気します。混合物を約1時間から1時間半脱気します。PDMSを脱気しながら、ホットプレート上に透明フィルムのクリーンシートを置き、続いてシリコンマスターを敷いてシリコンマスターを準備します。

マイクロチャネルモールドが上を向いていることを確認してください。1時間から1時間半後、脱気したPDMSを真空チャンバーから取り出します。PDMSをマスターの中心にゆっくりと注ぎ、重力で均等に広がるようにします。

次に、シリコンマスターとPDMSの上に2枚目の透明フィルムを慎重に巻いて、気泡を防ぎます。透明物の上にゴムシートをそっと置き、続いて1/8インチのアクリルシートを置き、次に、アクリルシートの上に3つの10ポンドの重りの最初のものを追加します。最初に、最初のウェイトは浮き、残りの2つのウェイトプレートに進む前に落ち着いて安定します。

続行する準備ができたら、ホットプレートを摂氏70度に設定し、PDMSを4時間硬化させます。硬化したら、PDMSをさらに1時間以上冷ましてから、ウェーハの上部の透明フィルムを慎重に剥がします。最後に、鉗子でチャネルを取り外します。

新しいきれいな透明フィルムの上にチャネルを逆さまに置き、鋭い鉗子で円を描くように動かしてすべてのポートを清掃します。緩んでいる PDMS の断片をすべて取り除きます。次に、粘着性のある面を上にして梱包用テープをベンチに置き、PDMSチャネルを下にしてテープの上に置きます。

一対の鉗子の丸い端でチャネルを押し下げて、良好な接触を確保します。チャネルを取り外し、目に見える破片がすべて取り除かれるまで、このプロセスを両側で繰り返します。次に、清潔で調製したPDMSチャンネルを、70%エタノールで満たされた50ミリリットルの円錐管に移します。

チャネルを最大速度で30秒間ボルテックスし、次に溶液を新鮮な70%エタノールと交換します。無菌技術を使用して、PDMSチャネル側を上にして、清潔で滅菌済みの皿に移します。次に、エタノールが蒸発するまでチャネルをUV処理します。

乾いたら、チャネルをカバースリップまたはガラス底皿に裏返し、ガラスに押し下げてしっかりと密閉します。滅菌済みPDMSのパッチを追加して、チャネルの中央部分を覆って閉じ、セットアップを完全に乾かしてから続行します。次に、100マイクログラム/ミリリットルのコラーゲン溶液の100マイクロリットルの液滴をチャネルの上部に置き、真空を使用してチャネルに引き込みます。

チャネルを摂氏37度で1時間インキュベートした後、コラーゲンコーティング溶液で満たされたチャネルを冷蔵庫に移します。セットアップを約15〜30分間冷却してから、吸引器またはピペットを使用して、チャネルからコラーゲンコーティング溶液を取り除きます。まず、コラーゲン溶液を中和し、細胞培地で希釈し、氷上で15分間インキュベートします。

次に、120〜150マイクロリットルのコラーゲン溶液を、事前に冷却したチャネルのポートAに入れます。次に、25ミリリットルのピペットを真空ラインに取り付け、ポートCに置きます。ランダムなマトリックスを生成するための最も重要なステップは、チャネルを通じてコラーゲンをゆっくりと引き込むことです。

引き込まれると、チャネルの一部またはチャネル全体の位置合わせが増加します。ポート領域から余分な溶液を慎重に取り除き、次に滅菌済みPDMSパッチを両方のポート、AとC.Afterの両方に配置します。2〜3分後、ポートBを覆う中央のPDMSパッチを取り外し、1ミリリットルあたり1〜300万の細胞の濃度で2〜3マイクロリットルの細胞を中央のポートに追加します。ゲルを室温でさらに10〜15分間部分的に重合する時間を与え、次にコンストラクトを摂氏37度のインキュベーターにさらに15〜30分間移します。

重合したら、PDMSポートカバーを取り外し、チャネルを完全に覆うようにメディアを追加します。ここでは、50, 000個の4つのTワン細胞を2mg / mlまたは3.5mg / mlのコラーゲンゲルに5日間包入しました。4つのT細胞1つのラインは、非常に収縮性のMed Aesthetic cancerラインですが、高密度ゲルを約10%しか収縮させることができませんコンポーラブルな低密度ゲルは、同じ時間枠で57%収縮します。

コラーゲンの整列の程度は、コラーゲンの流量が多いほど良好な整列が得られるように、コラーゲンの流動速度によって調節されます。狭いチャネルと高い真空圧の組み合わせにより、コラーゲンネットワークのアライメントが強化され、より広いチャネルと低真空圧の組み合わせにより、ランダムなマトリックスが生成されます。一度マスターすれば、コラーゲンジェルやチャンネルの注入は、適切に行えば2時間半で完了します。

この手順を試行する際は、開始する前にコンポーネントを設定することを忘れないでください。コラーゲンの取り扱いを開始したら、すぐに作業を行う必要があります。開発後、この技術は、3D細胞生物学の分野の研究者が、細胞の接着、移動、および3次元細胞外環境への侵入を調査する道を開きました。

このビデオを見れば、さまざまな密度のコラーゲンゲルを注ぐ方法や、ランダムおよび整列したコラーゲンマトリックスを生成する方法についてよく理解できるはずです。