Name: 新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶヒト絨毛細胞栄養芽層へのsiRNAトランスフェクションとEMSA分析の最適化手法。マイクロポレーションを用いた効率的な遺伝子発現制御とDNAタンパク質相互作用の解析により、胎盤研究における細胞分化機構の解明に貢献します。

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この作品は、カナダの国立科学と工学研究評議会（NSERC）（＃298527）（BB）からの助成金によってサポートされていました。 CTは、制度FAREの奨学金によってサポートされていました。 AVはNSERC・グラハム・ベル博士によってサポートされていました奨学金。 BBは、ヒトRetrovirology（ティア2）にカナダの研究の椅子を開催しました。テキストの改訂で助けをベアトリクスBeisnerに感謝します。

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<li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li>
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<li>Freeley, M., Long, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+siRNA+delivery+to+T-cells%3A+potential+clinical+applications+for+inflammatory+disease%2C+cancer+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection.</a> Biochem. J. 455, 133-147 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ヒト胎盤機能と開発に関する研究が大幅に様々な胎盤細胞集団の分離を最適化することを目的としたプロトコルによって改善されました。最もよく研​​究さ胎盤細胞集団の一つは研究が大幅に効率的で信頼性の高い分離を可能にする最適化されたプロトコルから恩恵を受けている、絨毛細胞栄養芽層のまま。これはさらに、そのようなトランスフェクションおよびプロモーターの研究などの実験の数を可能にしました。前述のプロトコル3を使用して、一次絨毛細胞栄養芽層の純粋な集団を得ることができます。 CK-7細胞栄養層で発現される中間フィラメントタンパク質です。このタンパク質に対するモノクローナル抗体は、胎盤10からのそれらの単離後に、この栄養膜集団の純度を決定するために使用されます。調製物は、細胞の96％は、CK-7陽性である場合、純粋であると定義されます。細胞は、その後、トランスフェクションのために直接使用することができます。トランスフェクションプロトコル関与する脂質ベースのアプローチは広く初代細胞11,12に核酸を転送するために使用されます。しかし、いくつかの細胞内脂質製剤の毒性は不利となります。微小穿孔は...

ヒト胎盤機能障害は、子癇前症や子宮内発育制限1のようないくつかの妊娠関連疾患の発症に関連しています。胎盤の重要な細胞成分は栄養膜であり、これは絨毛外または絨毛性細胞栄養芽細胞のいずれかに分類できます。融合すると、絨毛性細胞栄養芽細胞は、胎児と母体の交換とホルモン産生に重要な役割を果たす多核細胞構造である合胞体栄養膜層にさらに分化します2。ヒトの初代絨毛性細胞栄養細胞とそれらの分化した対応物は、重要な生物学的サンプルであり、研究者が細胞融合などの多くの胎盤関連プロセスを培養で研究することを可能にします。さらに、妊娠関連疾患に特有の適切な管理と予防療法の改善を促進するマーカーを特定するための多大な努力が進行中です。研究所は、胎盤絨毛のトリプシン消化に基づく標準的な単離手順を使用して、新鮮な胎盤から初代ヒト絨毛性細胞栄養芽細胞を日常的に分離しています3。培養された細胞栄養芽細胞は、培養4で増殖能力を失い、合胞体栄養様層で急速に分化するため、非常に効率的なトランスフェクション方法と最適化された分析アプローチが必要になります。これまでの研究では、これらの初代細胞栄養細胞のトランスフェクションの最適な条件が決定されています5。ここでは、この細胞型6で以前に試験されたsiRNAトランスフェクションの異なる方法を提示する。リポフェクションベースのアプローチと比較して、このマイクロポレーション法は、特定の遺伝子のサイレンシングの程度によって評価されるように、トランスフェクションを改善します。
プロモーターと遺伝子発現の研究も、胎盤の機能についてのより良い理解を提供します。初代絨毛性細胞栄養細胞を培養できる時間枠が短いため、使用がより困難になりますが、それでも、以前に発表された7つのように、標準プロトコルを使用したプロモーター分析に対処することができます。電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)は、in vitroで一般的に使用される方法の1つであり、DNA-タンパク質相互作用の迅速かつ容易なモニタリングを可能にします。これらの初代栄養膜からの核抽出物を使用して、シンシチン-2プロモーターの領域の特定の相互作用を試験しました。その結果、結合因子は、培養の異なる時点で、特異的かつ再現性のある方法で検出できることが明らかになりました。
>jove_content<このプロトコルで提示されたデータは、私たちのトランスフェクションアプローチとEMSAプロトコルが単離された一次絨毛性細胞栄養芽細胞に使用でき、正常または病理学的条件での絨毛性細胞栄養芽細胞の多様な機能を研究するために非常に役立つことを確認しています。

<table><tbody><tr><td>HBSSなし&nbsp;Ca2+、Mg2+&nbsp;</td><td>Sigma</td> <td>#H2387</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Sigma</td><td>#14060-057</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose without</td><td>Hepes Gibco</td><td>#12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Gibco</td><td>#15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x)</td><td>Gibco</td><td>#15640-055</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B&nbsp;</td><td>シグマ</td> <td>#A2411</td><td></td></tr><tr><td>CaCl<サブ>2</サブ></td><td>シグマ</td> <td>#C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgSO<サブ>4</サブ>.7H<サブ>2</サブ>O&nbsp;</td><td>Sigma</td> <td>#M</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>#16170-078&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>パーコール&nbsp;</td><td>Sigma</td> <td>#P-1644</td><td>密度勾配</td></tr><tr><td>Syncytin-2 siRNA</td><td>Ambion Life テクノロジー</td> <td>#AM16708</td><td></td></tr><tr><td>スクランブル siRNA</td><td>Qiagen</td><td># SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#D5025</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン、タイプ I&nbsp;</td><td>Sigma</td> <td>#T8003</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT Lipotransfection&nbsp; 試薬&nbsp;</td><td>GEhealthcare</td><td># T-2001-01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td> <td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td> <td>#P9416&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG、HRP結合抗体&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>#7074</td><td></td></tr><tr><td>BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD)</td><td>Roche Diagnostic</td><td>#11500708001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>#14287-080</td><td></td></tr><tr><td>T4ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>NEB</td> <td>#M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&gamma;-32P]</td><td>Perkin Elmer</td> <td>#BLU002A100UC</td><td></td></tr><tr><td>Acrylmide</td><td>Sigma&nbsp;</td><td></td><td></td>#A9099</tr><tr><td>TEMED</td><td>Life technologies</td><td>#17919</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>Σ&nbsp;</td><td></td><td></td>#A3678</tr><tr><td>抗ヒトサイトケラチン-7抗体クローンLP5K、FITC標識</td><td>ミリポア</td><td>CBL194F</td><td>希釈1:200</td></tr><tr><td>FcRブロッキング試薬&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130- 059-901</td><td>希釈 1:10</td></tr><tr><td>フローサイトメーター BD アキュリシステム</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロポレーター MP-100 装置&nbsp;</td><td>デジタルバイオ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>再懸濁バッファーR (ネオントランスフェクションシステム100&nbsp;&マイクロ;l キット)</td>PVDF膜<td>MPK10096</td><td></td><td>ライフテクノロジー</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>IPVH00010&nbsp;</td><td>メタノールによる活性化</td></tr><tr><td>抗ヒトGAPDH抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-137179</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Horseradi Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>#7074</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>Horseradish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody</td><td>Cell Signalling</td><td>#7076&nbsp;</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>NE-PER 核・細胞質抽出試薬</td><td>Thermo Scientific</td><td>#78833</td><td></td></tr><tr><td>G-25 カラム&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>#27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>化学発光および蛍光イメージングデバイス</td><td>Montr&eacute;al Biotech</td><td>Fusion FX5</td><td></td></tr><tr><td>4% ネイティブ ゲル</td><td>自家製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>自家製</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>パーソナル分子イメージャー (PMI) システム</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsirnaトランスフェクションおよびemsa分析

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

ヒトの一次絨毛細胞栄養芽細胞は、胎盤の機能や調節メカニズムを研究し、妊娠に関連する疾患を理解するための非常に有用な初代細胞の供給源です。このプロトコルでは、標準的なDNase/トリプシンプロトコルを通じて胎盤から新たに単離されたヒト一次絨毛性細胞栄養芽細胞を、低分子干渉RNA(siRNA)でマイクロポレーションします。このアプローチにより、リポフェクションベースの方法と比較して、siRNA トランスフェクションの効率が高かった。トランスフェクションした細胞は、その後、トランスフェクション後3〜4日以内に標準的なウェスタンブロットで分析できます。さらに、培養した初代絨毛細胞栄養細胞を用いて、1日目から4日目までの抽出物に対して、Electrophoretic Mobility Shift Assay(EMSA)分析を最適化し、実施しました。これらの培養初代細胞および記載されたプロトコルの使用は、合胞体栄養細胞様細胞層への絨毛性細胞栄養膜分化の過程における特定の遺伝子および転写因子の含意の評価を可能にする。しかし、培養で許容される期間が限られているため、安定した細胞集団の生成など、より多くの時間を必要とする方法を使用することはできません。したがって、この細胞集団の試験には、高度に最適化された遺伝子導入プロトコルが必要です。

満期妊娠からの新鮮な胎盤は、プロトコルのセクションで説明した実験のセットを行うために、ヒト初代絨毛細胞栄養層を分離するために使用されました。それらの単離に続いて、我々は最初のサイトケラチン7マーカー（ 図1）の使用を介して細胞栄養層の純度を分析しました。細胞調製物は、このように、モノクローナル抗サイトケラチン7抗体を用いて染色した。 図1は、標準的なフローサイトメトリーによって分析し、一次絨毛細胞栄養芽層の精製以下の典型的な実験の結果を表します。密度勾配のステップに続いて、（この場合、99％）&gt; 97％の細胞が陽性にそれによって、この細胞型の浄化効率の非常に高い程度を示す、標準的な実験においてサイトケラチン7について染色されます。 それらの単離後、ヒト初代細胞栄養芽層を直接TRAのために使用することができますnsfection。二つの異なるプロトコルは、 すなわち、</e...

このプロトコルは、効率的に新たに単離されたヒト絨毛細胞栄養芽層でのsiRNAのトランスフェクションマイクロポを使用して、これらの細胞におけるDNA-タンパク質複合体を同定するための方法が記載されています。トランスフェクトされた細胞は、ウェスタンブロットによりモニターすることができ、EMSAは、4日間の培養期間中に分析します。

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

Human primary villous cytotrophoblasts are a very useful source of primary cells to study placental functions and regulatory mechanisms, and to comprehend ...

本プロトコルの総合的な目的は、新鮮に単離した初代絨毛細胞栄養膜細胞のトランスフェクションにおける最適条件を実証し、プロモーター部位におけるDNAタンパク質相互作用を同定する方法を提示することです。この手法は、細胞栄養膜細胞の分化に関与する遺伝子や、その発現に関与する調節機構など、胎盤研究分野における重要な疑問への回答に役立ちます。この技術の主な利点は、操作が容易であり、非常に効率的であることです。さらに、本実験に要する時間は短く、多くの異なるサンプルを組み込むことが可能です。これらの手順のデモンストレーションは、私の研究室の元博士課程学生であるChirine Toufailyと、リサーチアソシエイトのYong Xiaoが行います。ここでは、標準的なプロトコルに従って、新鮮な胎盤から一次絨毛細胞滋養細胞を単離します。本プロトコルの最初のステップは、FACS解析によって調製物の純度を分析することです。まず、分取した直後の cytotrophoblasts 1×10⁶ 個をマイクロ遠心チューブに入れ、300 ×g で5分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨てます。あらかじめ温めておいたPBSを1 mL加え、遠心分離を繰り返します。吸引によりPBSを除去した後、細胞に冷メタノール1 mLを加え、-20 °Cで20分間インキュベートします。次に、遠心分離によって細胞をペレット化し、メタノールを吸引して除去します。次に、室温のPBSを1 mL加えてペレットを再懸濁させます。細胞を遠心分離し、PBSを除去した後、FC受容体ブロッキング剤を含むFBS含有PBSを加え、非特異的結合を排除するために室温で45分間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、室温のPBS 500 µLで細胞を2回洗浄し、その都度300 ×gで5分間遠心分離します。最後のPBS洗浄後、室温のPBS 100 microlitersで細胞を再懸濁します。次に、マウスモノクローナルFITC標識抗ヒトサイトケラチン7抗体（クローンLP5K）、またはコントロールとしてアイソタイプ一致の非特異的抗体と共に、室温・暗所で4分間インキュベートします。PBSで細胞を洗浄した後、フローサイトメトリーで蛍光を分析します。今後の実験には、フローサイトメトリーでCK7陽性細胞が96%以上であることを確認した細胞調製物を使用してください。マイクロポレーションデバイスを用いてヒト原代絨毛細胞栄養胚細胞をトランスフェクションするには、まず、サプリメント添加DMEM培地を2 mLずつ入れた6ウェルプレートを用意し、37 °Cの組織培養インキュベーターに設置します。次に、単離した原代細胞栄養胚細胞 1.5 × 10⁶ 個ずつをマイクロ遠心チューブに移します。遠心分離により細胞をペレット化した後、1 mLのDulbecc

sirna-transfection-emsa-analyses-on-freshly-isolated-human-villous

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遺伝学

このプロトコルでは、パーコール勾配を用いた栄養膜細胞の分離に続いて妊娠d10.5、上のマウスから胎盤の解剖について説明します。次に、マトリゲル浸潤アッセイで単離された細胞の使用例を示します。...

マウスの主栄養膜細胞と絨毛浸潤アッセイの分離

この原稿は、低酸素/再酸素化下で培養された免疫精製されたヒト絨毛性細胞栄養細胞のユニークなin...

メラトニンに対する低酸素/再酸素化誘発性の破壊の保護効果を研究するために、ヒト初代栄養膜細胞培養モデル

栄養膜巨細胞(TGC)は、健康な妊娠を確保するために胎盤で重要な役割を果たします。着床後胚のクライオスタット切片または胚の7日目の外胎盤錐体の短期培養における新生蛍光in...

の新生RNA FISHによる転写分析<em&gt;インビボ</em&gt;栄養膜巨細胞または<em&gt;インビトロ</em&gt;栄養膜コーン外植片の短期文化

ここで、我々は、ヒト臍帯（UC）および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための（CL）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞（MSC）の特徴付け。...

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

ここでは、骨の形態形成タンパク質4とアクチビン/ノード経路の阻害剤を使用して、ヒト多能性幹細胞からヒト絨毛細胞を効率的に生成するプロトコールを提示します。この方法は、ヒト多能性幹細胞の効率的な分化に適しており、遺伝子操作のための細胞を大量に生成することができます。...

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

ここで紹介は一次電池文化のよりよくの分離に続いてひと胎盤絨毛組織のサンプリングのためのプロトコルです。Tnf α と絨毛トロホブ...

胎盤におけるオートファジーの制御の母性的な肥満に関連付けられている炎症の影響を検討する主なひと胎盤絨毛細胞モデル

本研究は、リバーシブルの組織免疫染色、3 D レンダリングやひと胎盤絨毛サンプル 1-2...

三次元レンダリングとカルビンディン抗体、解析人間の胎盤絨毛血管のネットワークを明らかにしました。

このプロトコルは、アプリケーション (すなわち免疫細胞化学、フローサイトメトリー、等) の様々...

用語胎盤の胎児膜から主のひと脱落膜細胞の分離

ここでは、3 つの生体外の試金を使用して絨毛細胞における細胞運動を評価するため非常にアクセス プロトコルを提案: スクラッチ アッセイ、transwell...

移行, 侵略, と不死化妊娠初期絨毛細胞の増殖を評価する生体外の試金

本プロトコルは、栄養膜細胞などの細胞が細胞外基底膜マトリックスの層上に毛細血管様構造に組織化する古典的な in vitro...

分化マーカー発現解析のための血管新生チューブ形成アッセイからの栄養膜細胞回収

このプロトコルにより、ヒトの胎盤の基底部十座および絨毛膜から原発HLA-G+の絨毛膜(EVT)の精製、特徴解析、培養が可能になります。一次EVT培養は96時間の生存能力を維持し、サンプルマッチした母体免疫細胞との共培養や、その後のフローサイトメトリクスおよび分子分析を可能にします。...

表現型および機能解析のためのヒト胎盤組織からのHLA-G+ 外芽外栄養芽細胞の精製

学ぶヒト絨毛細胞栄養芽層へのsiRNAトランスフェクションとEMSA分析の最適化手法。マイクロポレーションを用いた効率的な遺伝子発現制御とDNAタンパク質相互作用の解析により、胎盤研究における細胞分化機構の解明に貢献します。

新たに単離したヒト絨毛細胞栄養芽層に対するsiRNAトランスフェクションおよびEMSA分析

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